Summary
Hier beschrijven we een protocol voor pseudovirusverpakking en het meten van antilichaamneutraliserende activiteit.
Abstract
Sinds 1996 veroorzaken A/gans/Guangdong/1/96-afstamming hoogpathogene aviaire influenza (HPAI) H5-virussen griepuitbraken bij pluimvee en wilde vogels. Af en toe worden mensen er ook het slachtoffer van, wat resulteert in een hoge sterfte. Niettemin wordt hpai-virusonderzoek vaak belemmerd, aangezien het moet worden behandeld in bioveiligheidsniveau 3-laboratoria. Om dit probleem aan te pakken, worden pseudovirussen gebruikt als alternatief voor wild-type virussen in sommige experimenten van H5 HPAI-studies. Pseudovirussen blijken de ideale hulpmiddelen te zijn om neutraliserende antilichamen tegen H5 HPAI-virussen te bestuderen. Dit protocol beschrijft de procedures en kritieke stappen van H5 HPAI pseudoviruspreparaten en pseudovirusneutralisatietests. Het bespreekt ook de probleemoplossing, beperking en wijzigingen van deze testen.
Introduction
Sinds 1996 veroorzaken A/gans/Guangdong/1/96-afstamming hoogpathogene aviaire influenza (HPAI) H5-virussen voortdurende griepuitbraken bij pluimvee en wilde vogels, goed voor enorme sociaaleconomische verliezen in de wereldwijde pluimvee-industrie. Soms raken mensen er ook mee besmet, geconfronteerd met een hoog sterftecijfer 1,2. HPAI-virusonderzoek wordt echter vaak belemmerd, aangezien het niet buiten bioveiligheidsniveau 3-laboratoria kan worden behandeld. Om dit probleem aan te pakken, worden pseudovirussen gebruikt als alternatief voor wild-type virussen in sommige experimenten van H5 HPAI-studies. Pseudovirussen zijn veilig genoeg om te oefenen in bioveiligheidsniveau 2 laboratoria.
H5 HPAI pseudovirussen behoren tot chimere virussen bestaande uit surrogaatviruskernen, lipide-enveloppen met de oppervlakteglycoproteïnen van influenzavirussen en reportergenen. Pseudoviruskernen zijn meestal afgeleid van lentiviraal humaan immunodeficiëntievirus (HIV), retrovirussen zoals muizenleukemievirus (MLV) en vesiculair stomatitisvirus (VSV)3. In het bijzonder wordt het HIV-1-verpakkingssysteem veel gebruikt om influenza-pseudovirus te produceren, waarbij de primaire genen gag en pol zijn. Het HIV-gaggen brengt kerneiwitten tot expressie. Het pol-gen brengt het integrase en reverse transcriptase tot expressie, die beide nodig zijn voor de expressie van het reporter-gen in getransduceerde cellen. Door het genoom van het surrogaatvirus na te bootsen, wordt het reporter-gen in RNA-vorm omarmd in de pseudoviruskern. Het reporter-gen zal het eiwit tot expressie brengen in gastheercellen. De genexpressieniveaus van reportergenen kunnen worden gebruikt om de efficiëntie van pseudovirusinfecties te meten 3,4. De primaire reporter is firefly luciferase om de relatieve luminescentie-eenheden (RLU) of relatieve luciferase-activiteit (RLA) in getransduceerde cellen te meten. Andere verslaggevers zoals lacZ, Gaussia en Renilla luciferase worden ook gebruikt, alleen in mindere mate5.
Pseudovirussen zijn ideale hulpmiddelen om neutraliserende antilichamen tegen H5 HAPI-virussen te bestuderen. Om de neutraliserende antilichaampotentie te meten, worden pseudovirusneutralisatie (PN) assays6 gebruikt. Hemagglutinine (HA) en neuraminidase (NA) zijn glycoproteïnen op het oppervlak van het influenza A-virus 7,8. Het HA bestaat uit een bolvormig hoofddomein voor receptorbinding en een stamdomein voor membraanfusie. Het NA-eiwit heeft de sialidase-activiteit om virusafgifte 7,8 te vergemakkelijken. Een PN-test kan neutraliserende antilichamen meten die gericht zijn op HA-eiwitten. Neutraliserende antilichamen gericht op het hoofd- en stengelgebied van HA kunnen ook worden gedetecteerd door virale hechtings- en ingangstests. In vergelijking met wild-type virussen hebben pseudovirusneutralisatie-experimenten gevoeligere detectiewaarden, kunnen ze veilig worden behandeld in een bioveiligheidslaboratorium van niveau 2 en zijn ze over het algemeen gemakkelijker te bedienen in de praktijk.
Dit protocol presenteert in detail de procedures en kritieke stappen van H5 HPAI pseudoviruspreparaten en PN-assays. Het bespreekt ook de probleemoplossing, beperking en wijzigingen van deze testen. In deze studie werd de A/Thailand/1(KAN)-1/2004(TH) stam van H5N1 HPAI virussen als voorbeeld gebruikt. Om de immuunsera te verkrijgen die in assays worden gebruikt, selecteerde dit protocol het HA-eiwit afkomstig van de TH-stam als het immunogeen om muizen te immuniseren.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alle pseudovirus-gerelateerde experimentele operaties werden uitgevoerd onder ABSL2-conditie in het Institut Pasteur van Shanghai Chinese Academy of Sciences (IPS, CAS). Dierproeven werden uitgevoerd op basis van door de Institutional Animal Care and Use Committee goedgekeurde dierprotocollen van IPS, CAS.
1. Pseudovirusverpakking met calciumfosfaattransfectie
- Maak eencellige suspensies van HEK293FT cellen (9 x 105 per ml) in volledig DMEM-medium (tabel 1). Voeg 10 ml van de eencellige suspensies toe aan een T75-kolf, incubeer de cellen in een 37 °C, 5% kooldioxide (CO2) incubator gedurende 20 uur vóór de transfectie.
OPMERKING: HEK293FT lage doorgang (<20 passages) wordt aanbevolen. Zorg ervoor dat de cel monolaag voor 80-90% confluent is. - Vervang het medium 2 uur voor de transfectie door 10 ml vers compleet medium dat chloroquine (100 μM) bevat.
- Meng de reagentia en het plasmide-DNA zoals weergegeven in tabel 2 en figuur 1: ddH 2 O, pCMV/R-HA, pCMV/R-NA, pHR-Luc, pCMV Δ 8,9, 2,5 M CaCl2en 2x HEPES-buffer. Pipetteer 5 keer zachtjes op en neer, incubeer het mengsel bij kamertemperatuur (RT) gedurende 20 minuten.
- Breng het mengsel over in het medium boven de cellen en wieg de kolf voorzichtig. Incubeer de cellen in de celincubator gedurende 15 uur.
- Vervang het medium door 15 ml vers compleet DMEM-medium. Incubeer de cellen in een 37 °C, 5% CO2 incubator gedurende 65 uur.
OPMERKING: De kleur van het medium is lichtoranje of lichtgeel en ten minste 80% van de cel moet het cytopathische effect (CPE) onder de microscoop met omgekeerd licht vertonen. - Oogst het supernatant en centrifugeer het gedurende 20 minuten bij 4 °C op 2095 x g . Verzamel het supernatant, aliquoteer het en bewaar het bij -80 °C.
2. Detectie van de HA, NA en HIV-1 p24 eiwitexpressie van influenza pseudovirus
- Detecteer de HA-eiwitexpressie door hemagglutinine (HA) -test.
- Voeg 50 μL PBS toe aan kolommen 2-12, rijen A, B en C van een 96-well round-bottom plaat.
OPMERKING: Rij A, B en C behoren tot 3 onafhankelijke replicatietests en kolom 12 wordt gebruikt als de negatieve controle. - Voeg 100 μL pseudovirus toe aan de putjes van kolom 1. Breng 50 μL over van kolom 1 naar kolom 2, meng goed door 5 keer op en neer te pipetteren, voer de tweevoudige verdunningen uit tot de laatste kolom 11 en gooi de extra 50 μL uit kolom 11 weg.
- Voeg 50 μL 0,5% erytrocyt toe aan elk putje, pipetteer het twee keer zachtjes op en neer. Incubeer de plaat gedurende 30-60 minuten bij RT of totdat de erytrocyten van de negatieve controle de regelmatige vlekken op de bodem van de put vormen.
- Observeer en registreer HA-titers van het pseudovirus.
OPMERKING: HA-eenheid van de pseudovirussen is de hoogste verdunningsfactor van het virus die 100% hemagglutinatie van de rode bloedcellen kan veroorzaken.
- Voeg 50 μL PBS toe aan kolommen 2-12, rijen A, B en C van een 96-well round-bottom plaat.
- Detecteer HA- en NA-eiwitexpressie door de western-blot-assay.
OPMERKING: Alle western-blot stappen worden uitgevoerd volgens de handleiding van Moleculair klonen (4e editie). - Detecteer de hiv-1 p24-eiwitexpressie met de hiv-1 p24 ELISA-kit (materiaaltabel).
- Voeg 50 μL van de lysisbuffer toe aan 450 μL pseudovirusmonster. Meng het grondig.
- Voeg 300 μL van de wasbuffer toe aan elk putje van de microplaat. Sla de plaat omgekeerd om de wasbuffer volledig te verwijderen. Herhaal de was 5 keer.
- Voeg 200 μL van de standaard en monsters toe aan elke put afzonderlijk. Incubeer ze bij 37 °C gedurende een nacht of gedurende 2 uur.
- Zuig de inhoud van de plaat aan en was de plaat zoals beschreven in stap 2.3.2.
OPMERKING: Laat één putje van de testplaat leeg om als substraat leeg te gebruiken. - Voeg 200 μL van de p24-detectorantistoffen toe aan elk putje. Incubeer ze bij 37 °C gedurende 1 uur. Zuig de plaat op en was deze zoals beschreven in stap 2.3.2.
- Voeg 100 μL van de streptavidin-peroxidase werkoplossing toe aan elk putje en incubeer ze bij 37 °C gedurende 30 minuten. Zuig de plaat op en was deze zoals beschreven in stap 2.3.2.
- Voeg 100 μL van de substate-werkoplossing toe aan elke put, inclusief de blancoput van het substraat, en incubeer ze bij 37 °C gedurende 30 minuten.
OPMERKING: Blauwe kleur zal zich ontwikkelen in de putten. - Voeg 100 μL van de stopbuffer toe aan elke put.
OPMERKING: De blauwe kleur verandert onmiddellijk in geel. - Lees de optische dichtheid bij 450 nm binnen 15 min. Noteer de p24-titers van het pseudovirus
3. Pseudovirustitratie
- Maak eencellige suspensies van MDCK-cellen (5 x 104 per ml) in volledig DMEM-medium, voeg 1250, 2500, 5000, 10000, 20000 en 40000 cellen toe aan verschillende putten van een 96-well flat-bottom plaat. Incubeer de cellen in een 37 °C, 5% CO2 incubator gedurende 20 uur.
- Haal het pseudovirus uit de -80 °C koelkast, ontdooi het op het ijs en draai het pseudovirus vortex.
- Voeg 6 HAU (6x HA-eenheden) pseudovirussen toe aan elke put met een ronde bodemplaat van 96 en vul elke put aan met volledige DMEM tot 120 μL.
- Pipetteer het mengsel 5 keer op en neer om goed te mengen. Incubeer de mengselplaat gedurende 1 uur in een 37 °C, 5 % CO 2-incubator.
- Breng 100 μL van het mengsel over naar de cellen in de 96-putplaat. Plaats de celkweekplaat terug in de couveuse gedurende 48 uur, 60 uur en 72 uur na virusinfectie.
- Haal de plaat uit de couveuse en voer de luciferasetest (Table of Materials) uit.
- Verwijder het medium voorzichtig uit de putjes van de plaat. Spoel de cellen met 200 μL PBS en verwijder de PBS zoveel mogelijk.
OPMERKING: Draai de plaat om en gooi het supernatant weg door het omgekeerd op absorberend papier te slaan. Als de testcellijn niet stevig aan de bodem kon worden bevestigd, verwijdert u de mediumaspiratie voorzichtig. - Voeg 50 μL van de lysisbuffer toe aan elke put en rock de kweekplaat meerdere keren. Bewaar de plaat een nacht bij -80 °C.
OPMERKING: Meng 1 volume 5x lysisbuffer met 4 volumes water om de 1x lysisbuffer te maken. Breng de 1x lysisbuffer voor gebruik in evenwicht met RT. Schommel de plaat om ervoor te zorgen dat de cellen volledig bedekt zijn met de lysisbuffer. Het enkele vries-dooiproces kan helpen de cel volledig te lyseren. - Haal de plaat eruit, balanceer op RT gedurende 2 uur.
OPMERKING: De cel moet volledig worden gelyseerd. - Rock de plaat meerdere keren zachtjes en breng alle cellysaten over op ondoorzichtige 96-putplaten.
- Voeg 50 μL van het substraat toe aan elke put, schommel de plaat meerdere keren voorzichtig en meng substraat en lysisbuffer grondig.
- Meet het geproduceerde licht binnen 5 minuten met behulp van een luminometer. Noteer de luciferasetiters van het pseudovirus.
OPMERKING: Wanneer een goed substraat wordt toegevoegd, wordt licht uitgezonden als bijproduct via een chemische reactie waarbij luciferine wordt omgezet in oxyluciferine door het luciferase-enzym. De hoeveelheid geproduceerd licht is evenredig met de hoeveelheid luciferase-enzym.
4. Immuun sera preparaat
OPMERKING: Het immuunserum zal worden gebruikt voor celgerelateerde experimenten en de experimentele operatie moet worden uitgevoerd onder aseptische omstandigheden.
- Bereid 12 acht weken oude vrouwelijke BALB / c-muizen voor. Verdeel de muizen gelijkelijk in twee groepen.
OPMERKING: De ene groep was de DDV-groep en de andere was de negatieve controlegroep. - Immunisatie van de DDV-groep: Prime tweemaal intramusculair met 100 μg van een voor codon geoptimaliseerd DNA-plasmide dat codeert voor A/Thailand/(KAN-1)/2004 (TH) HA-eiwit in week 0 en week 3 en boost eenmaal intraperitoneaal met 512 HAU TH-virusachtige deeltjes (VLP) in week 6.
- Immunisatie van de controlegroep: Prime tweemaal intramusculair met 100 μg leeg vectorplasmide-DNA in week 0 en week 3 en boost eenmaal intraperitoneaal met HIV-1 gag VLP in week 6.
- Verzamel het muizenbloed 2 weken na de laatste immunisatie.
OPMERKING: Hier werden de muizen verdoofd met pentobarbitalnatrium (65 mg / kg) op het moment van bloedafname. Na bloedafname uit de submandibulaire ader werden de muizen onmiddellijk geëuthanaseerd met CO2. - Houd het bloed op RT gedurende 2 uur, daarna 4 °C gedurende een nacht. Centrifugeer gedurende 10 minuten bij 900 x g bij 4 °C en verzamel het supernatant. Inactiveer de sera door deze gedurende 30 minuten op 56 °C te plaatsen.
- Bewaar de immuunsera in een koelkast van -80 °C voor gebruik.
OPMERKING: Raadpleeg aanvullende figuur 1 voor het stroomdiagram dat de belangrijkste procedures voor muisimmunisatie beschrijft.
5. Pseudovirus neutralisatie (PN) assay
- Maak eencellige suspensies van MDCK-cellen (5 x 104 per ml) in volledig DMEM-medium en voeg 100 μL van de celsuspensie toe aan elke put van een 96-well platbodemplaat. Incubeer de cellen in een 37 °C, 5% CO2 incubator gedurende 20 uur.
- Haal het pseudovirus en de sera uit de koelkast van -80 °C, ontdooi het op het ijs en vortex grondig.
- Verdun de sera 20 keer in het volledige medium en voeg 100 μL volledig DMEM-medium toe aan de putjes van een 96-well round-bottom plaat uit kolommen 2-10.
- Voeg 200 μL van de verdunde sera toe aan de putjes van kolom 2, breng 100 μL over van kolom 2 naar kolom 3, verdun de sera als 1:20, 1:40, 1:80, enz., tot 1:10240 achtereenvolgens van kolom 2 naar kolom 10, en gooi de 100 μL uit kolom 10 weg.
- Voeg 100 μL DMEM compleet medium toe aan de putjes van kolom 11 als negatieve controle.
- Voeg 100 μL pseudovirussen toe aan elk putje, pipetteer het mengsel 5 keer grondig op en neer en incubeer de mengselplaat in een 37 °C, 5% CO2 gedurende 1 uur.
- Breng 100 μL van het mengsel over van de 96-well round-bottom plaat naar de overeenkomstige put van de 96-well celkweekplaat. Plaats de plaat terug in de incubator (37 °C, 5% CO2) gedurende 60 uur.
- Haal de plaat uit de couveuse. Voer de luciferasetest uit zoals beschreven in stap 3.7-3.12.
6. Pseudovirus attachment assay
- Maak eencellige suspensies van MDCK-cellen (4 x 104 per ml) in volledig DMEM-medium en voeg 100 μL celsuspensies toe aan elke put in een 96-well platbodemplaat. Incubeer de cellen bij 37 °C, 5% CO2 gedurende 20 uur.
- Incubeer het pseudovirus met sera in DMEM met 1% BSA bij 4 °C gedurende de nacht.
OPMERKING: Het volume van het mengsel is 100 μL. - Blokkeer de MDCK-cellen met 100 μL per putje DMEM met 1% BSA bij 4 °C gedurende 1 uur.
- Ent het pseudovirus en het serummengsel (100 μL) op de MDCK-monolaag en incubeer deze gedurende 2 uur bij 4 °C.
- Was de celplaat 4 keer met PBS met 1% BSA om elk ongebonden virus te verwijderen.
- Lyseer de cellen met 100 μL luciferase lysisbuffer bij RT gedurende 30 min.
- Kwantificeer de hoeveelheid gebonden virus op de cellen met een HIV-1 p24 ELISA-kit zoals hierboven beschreven (rubriek 2.3).
7. Beoordeling van virale binnenkomst
- Maak eencellige suspensies van MDCK-cellen (5 x 104 per ml) in volledig DMEM-medium en voeg 100 μL van de celsuspensie toe aan elke put van een 96-well platbodemplaat. Incubeer de cellen bij 37 °C, 5% CO2 gedurende 20 uur vóór de test.
- Ent het pseudovirus (100 μL) op een MDCK-monolaag in een 96-wellige plaat bij 4 °C gedurende 6 uur.
- Was de celplaat 4 keer met PBS met 1% BSA om ongebonden pseudovirussen te verwijderen.
- Voeg 100 μL van de serieel verdunde immuunsera of sera van schijnvaccinatiemuizen in DMEM met 1% BSA toe aan de monolaag en incubeer de cel bij 4 °C gedurende 2 uur.
- Verwijder het celsupernatant en was de celkweekplaat 4 keer met PBS met 1% BSA.
- Voeg verse DMEM toe aan de cellen en incubeer gedurende 60 uur in een 37 °C, 5% CO 2-incubator.
- Meet de relatieve luciferase-activiteit (RLA) van de cellen zoals beschreven in stap 3.7-3.12.
OPMERKING: Virale vermelding, zoals aangegeven door RLA, werd uitgedrukt als een percentage van de aflezing verkregen in afwezigheid van sera, die werd vastgesteld als 100%.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
HA, NA en HIV-1 p24 eiwitexpressie van influenza pseudovirus
Om de efficiëntie van de virale verpakking te identificeren, werden influenza pseudovirusvoorraden voor het eerst gedetecteerd door middel van HA-assay (figuur 2A). HA-eenheden per milliliter influenza pseudovirussen zijn 643 (tabel 3). Western-blot assay en sandwich ELISA-assays werden gebruikt om HA, NA en HIV-1 p24 eiwitexpressie te testen. Vervolgens werden de verhoudingen van HA-eenheid en de hoeveelheid gag p24 voor pseudovirussen berekend. De resultaten van de western-blot-test toonden aan dat er 4 eiwittypen waren: HA0-, HA1-, HA2- en NA-eiwitten (aanvullende figuur 2). Dit geeft aan dat de omhullende eiwitten van influenza pseudovirussen vergelijkbaar zijn met die van wild-type virussen. De verhoudingen van HA en Gag p24 lagen binnen een normaal bereik zoals gerapporteerd (tabel 3)9.
| Pseudovirus stammen | HAU/ml | 1.00E + 05 pg/ml | Verhouding van HAU/1.00E+05 pg* |
| P A/Thailand/(KAN-1)/2004 | 642,52 ± 30,26 | 4,20 ± 0,17 | 152.98 |
| *De verhoudingen van de HA-eenheden en de hoeveelheid HIV-1 Gag p24 in pseudovirussen werden als volgt berekend: HA-eenheden/de hoeveelheid Gag p24. | |||
Tabel 3: Kwantificering van H5 pseudovirus.
Pseudovirustitratie
Om de concentratie van functionele virale deeltjes te meten, werd relatieve luciferaseactiviteit (RLA) van pseudovirus gedetecteerd. RLA-metingen zijn afhankelijk van veel variabelen. Om het effect van de getransduceerde celhoeveelheid op RLA-metingen te identificeren, zaaiden we de cellen van 1250, 2500, 5000, 10000, 20000 en 40000 per put van 96-wellplaat (figuur 2). De resultaten toonden aan dat RLA-metingen van pseudovirus het hoogst zijn, en de standaardfout van het gemiddelde is het laagst wanneer 5000 cellen worden gezaaid in een put van 96-putplaat (figuur 4A). Om het effect van de incubatietijd te identificeren, worden RLA-metingen gedetecteerd op 48 uur, 60 uur en 72 uur na virusinfectie. De resultaten toonden aan dat bij incubatie gedurende 60 uur de RLA-waarden van pseudovirus hoger zijn in waarden en beter in herhaalbaarheid met een lage standaardfout van het gemiddelde (figuur 4B). De resultaten geven aan dat het geschikt is om 5000 cellen in een put van een 96-putplaat te zaaien en RLA-metingen 60 uur na virusinfectie te detecteren.
PN-testen
Neutralisatietiters van immuunsera uit de controlegroep en de DDV-groep werden gemeten met PN-assays (figuur 5). Zoals te zien is in figuur 5A, vertoonden de immuunsera uit de DDV-groep hoge neutralisatietiters tegen pseudovirus A/Thailand/1(KAN)-1/04 stam. Sera uit de controlegroep vertoonden daarentegen geen neutralisatieactiviteit (figuur 5B). In vergelijking met traditionele serologische assays (HI- en MN-assays) zijn PN-assays gevoeliger (Data are not showed).
Aanhechtingsneutralisatietest
Sommige neutralisatie-antilichamen kunnen de hechting van virussen aan de siaalzuurreceptoren belemmeren. Deze antilichamen zijn gericht op de HA-kop en zijn overheersend na immunisatie door commercieel vaccin of infectie van influenzavirus. Om de neutraliserende activiteit van deze antilichamen te identificeren, worden hechtingsneutralisatietests uitgevoerd (figuur 3). In vergelijking met de controlesera is de neutraliserende activiteit van immuunsera krachtig, wat aangeeft dat er veel antilichamen gericht zijn op de HA-kop in de immuunsera (figuur 6A).
Beoordeling van virale binnenkomst
Deze test wordt gebruikt om antilichamen te identificeren die de fusie van virusomhulling en endosomale membranen tijdens influenzavirusinfectie belemmeren. Deze antilichamen zijn gericht op het HA-stengeldomein en zijn meestal minder krachtig. Om de neutralisatietiters van deze antilichamen te meten, worden post-attachment assays uitgevoerd (figuur 3). Er zijn significante verschillen tussen de immuunsera en de controlesera, wat aangeeft dat er antilichamen gericht zijn op het HA-stamgebied in de immuunsera (figuur 6B).
Figuur 1: Stroomdiagram van calciumgemedieerde transfectie. Dit stroomdiagram wordt gebruikt om de belangrijkste procedures van calciumgemedieerde transfectie te beschrijven. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 2: Kwantificering en titratie van pseudovirus. (A) Stroomdiagram van pseudovirus HA-assay waarin de belangrijkste stappen van pseudovirus HA-assay worden beschreven. (B) Stroomschema van pseudovirus P24-test waarin de belangrijkste stappen van pseudovirus P24-assay worden beschreven. (C) Stroomschema van pseudovirustitratietest waarin de belangrijkste stappen van pseudovirustitratietest worden beschreven. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 3: Pseudovirus-gebaseerde neutralisatietesten. (A) Stroomschema van PN-assay waarin de belangrijkste stappen van PN-assay worden beschreven. (B) Stroomschema van pseudovirus-hechtingstest waarin de belangrijkste stappen van de hechtingstest worden beschreven. (C) Stroomschema van beoordeling van virale entry assay waarin de belangrijkste stappen van viral entry assay worden beschreven. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 4: Pseudovirustitratie. (A) Verschillende celhoeveelheden per put in een 96-well plaat beïnvloeden RLA-metingen. 1250, 2500, 5000, 10000, 20000 en 40000 cellen werden gezaaid in een plaat met 96 putten. (B) Verschillende oogsttijden beïnvloeden de RLA-metingen. RLA-waarden worden gedetecteerd na 48 uur, 60 uur en 72 uur na virusinfectie. Gegevens verzameld uit drie onafhankelijke experimenten worden gepresenteerd als gemiddelde ± SEM; foutbalken vertegenwoordigen de standaardfout van het gemiddelde (SEM). One-way ANOVA met Tukey-test werd uitgevoerd. P < 0,0001; ns, niet significant. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 5: H5 neutraliserende antilichaamresponsen gedetecteerd met pseudovirus. (A) Titratie van neutraliserende antilichaamresponsen van de immuunsera uit de DDV-groep. (B) Titratie van neutraliserende antilichaamresponsen van de immuunsera uit de controlegroep. De IC 50 wordt gedefinieerd als de wederzijdse verdunningen van het neutraliserende antilichaam die50 % van het pseudovirus kunnen remmen. Gegevens verzameld uit drie onafhankelijke experimenten worden gepresenteerd als gemiddelde ± SEM; foutbalken vertegenwoordigen de standaardfout van het gemiddelde (SEM). VSVG pseudovirus werd gebruikt als een negatieve controle. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 6: Detectie van neutralisatie-antilichaampotentie door bindings- en virale entry-assays . (A) Immuunsera uit de DDV-groep, niet die uit de controlegroep, remmen de virale hechting aan cellen. (B) Immuunsera uit de DDV-groep, niet die uit de controlegroep, remmen gedeeltelijk virale post-attachment infectie. Gegevens verzameld uit drie onafhankelijke experimenten worden gepresenteerd als gemiddelde ± SEM; foutbalken vertegenwoordigen de standaardfout van het gemiddelde (SEM). Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
| Complete DMEM medium samenstelling | Concentratie |
| Dulbecco's Gemodificeerde Eagle Medium (DMEM) | 1x |
| Foetaal runderserum | 10% |
| Penicilline (1 U / ml) / Streptomycine | 1 μg/ ml |
Tabel 1: Complete DMEM medium samenstelling.
| Materiaal | Concentratie | Volume |
| 2x HEPES (pH 7,1) | -- | 675,0 μL |
| CaCl 2 (2,5 m) | -- | 67,5 μL |
| ddH2O | -- | 529,2 μL |
| pCMV Δ 8,9 | 1000 ng/μL | 18,9 μL |
| pCMV/R-HA | 100 ng/μL | 27,0 μL |
| pCMV/R-NA | 50 ng/μL | 13,5 μL |
| pHR-Luc | 1000 ng/μL | 18,9 μL |
Tabel 2: Pseudovirus verpakkingssysteem.
Aanvullende figuur 1: Stroomdiagram van muisimmunisatie. Dit stroomdiagram beschrijft de belangrijkste procedures voor muisimmunisatie. De immuunsera werden gebruikt als monsters. Klik hier om dit bestand te downloaden.
Aanvullende figuur 2: HA, NA en HIV-1 p24 eiwitexpressie van influenza pseudovirus. Western-blot van pseudoviruseiwitten. Klik hier om dit bestand te downloaden.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
HEK293FT cellen worden meestal gebruikt als verpakkingscellen om pseudovirussen te produceren. Regelmatige mycoplasmadetectie is essentieel tijdens de celkweek. Mycoplasmabesmetting kan de pseudovirusopbrengsten drastisch verminderen en soms bijna nul. In vergelijking met andere verontreinigingen leiden mycoplasmabesmettingen niet tot veranderingen in de pH-waarde of troebelheid van het celkweekmedium. Zelfs een hoge concentratie mycoplasma is niet zichtbaar met het blote oog of onder een microscoop. Drie populaire methoden voor mycoplasmadetectie zijn mycoplasmacultuur, DNA-kleuring met fluorescerende DAPI of Hoechst 33258 en polymerasekettingreactie (PCR). PCR die het mycoplasma-DNA in kweekmonsters versterkt, wordt veel gebruikt voor snelle, eenvoudige en betrouwbare mycoplasma-tests10.
Calciumfosfaat-gemedieerde transfectie wordt al vele jaren gebruikt voor influenza pseudovirussen verpakkingen vanwege de hoge efficiëntie, lage kosten en eenvoudige bediening11. Deze methode is echter zeer gevoelig voor de pH-waarde van een HEPES-gebufferde oplossing, het HEK293FT celkweekmedium en de dubbel gedestilleerde H2O. pH-waarde beïnvloedde de vorming van neerslag en de duur van het verblijf van het neerslag op HEK293FT cellen. Het kan dus de DNA-hoeveelheid bepalen die door HEK293FT cellen wordt opgenomen. De pH voor een HEPES-gebufferde oplossing is extreem smal beperkt, variërend van 7,05-7,1212,13,14, in welke toestand, een neerslag met calciumfosfaat en DNA langzaam wordt gevormd in HEPES-gebufferde oplossing. Als de pH te hoog is, wordt de grootte van het neerslag zo groot dat het zelfs de HEK293T cellen kan doden. Integendeel, als de pH te laag is, kan het neerslag niet worden gevormd, of het neerslag zal te klein zijn om zich op het celoppervlak te vestigen. Bovendien speelt de pH van het HEK293FT celkweekmedium ook een rol bij de transfectie-efficiëntie. Tijdens de transfectie moet het celmedium tussen een pH van 7,2-7,4 worden gehouden. Zowel hyperzure als alkalische media zullen de grootte van het neerslag en de adsorptietijd van het DNA-mengsel op het celoppervlak veranderen. Bovendien kan dubbel gedestilleerd H2O met verschillende oorsprongen die in het DNA-mengsel worden gebruikt, de pH van een HEPES-gebufferde oplossing veranderen. Het handhaven van een stabiele pH-waarde van transfectieoplossing en kweekmedium is dus cruciaal om een hoge transfectie-efficiëntie te garanderen. Bovendien wordt de transfectie-efficiëntie ook beïnvloed door 2,5 M CaCl 2-oplossing en de concentratie koolstofdioxide (CO2) in de celincubator. Tijdens het transfectieproces is het cruciaal om de CaCl 2-oplossing goed op te slaan en de CO2-concentratie in de incubator te stabiliseren.
Het meest populaire verpakkingssysteem van influenza pseudovirus omvat een co-transfectiebenadering met meerdere plasmiden. HA-, NA-, reporter- en lentivirale gag - en pol-genen worden afzonderlijk gekloond tot plasmide-expressievectoren en vervolgens worden ze tegelijkertijd in de cellen getransfecteerd. Om de eiwitexpressie te verhogen, wordt vaak een Kozak-consensussequentie toegevoegd voordat de transcriptiestartplaats plaatsvindt.
Het is noodzakelijk om zuiver, supercoiling en endotoxinevrij plasmide-DNA15 te bereiden. Omdat de plasmideverhouding direct van invloed is op de pseudovirusopbrengsten. Dit protocol optimaliseerde de plasmideverhouding van de "core: reporter: HA: NA" tot 28:28:4:1 en vergeleek deze met andere transfectiemethoden. Het is vereist dat de hoeveelheid plasmide-DNA in calciumfosfaattransfectie tot 30,5 μg per schaal van 100 mm moet bedragen.
Pseudovirustiters worden gedetecteerd door kwantitatieve real-time PCR (qRT-PCR), enzymgebonden immunosorbent assay (ELISA), hemagglutinatietest en RLA-detectietests. qRT-PCR-assay wordt gebruikt om het aantal kopieën van RNA-genen van pseudovirus inwendig5 te schatten. ELISA-test wordt gebruikt om het gehalte aan p24-eiwit te detecteren, dat het hoofdbestanddeel van de HIV-kern is. Hemagglutinatietest meet ha piekhoeveelheid op het oppervlak van de pseudovirusdeeltjes. Deze drie testen worden gebruikt om niet-functionele virale deeltjes te kwantificeren. RLA-detectietest is de belangrijkste methode voor het meten van de concentratie van functionele virale deeltjes die getransduceerde cellen kunnen infecteren en reportergenen in pseudovirusvoorraad kunnen vrijgeven. MDCK-cellen worden vaak gebruikt als getransduceerde cellen. Getransduceerde cellen worden gezaaid in 96-well kweekplaten, geïnfecteerd door pseudovirus, gelyseerd door lysisbuffer en vervolgens overgebracht naar 96-well luminometerplaten om waarden te lezen. Verschillende celhoeveelheden en incubatietijden beïnvloeden de RLA-waarden. Op basis van de resultaten is de genexpressie van de reporter hoog wanneer 5000 cellen per put op een 96-well-plaat worden gezaaid en RLA wordt gedetecteerd op 60 uur na virusinfectie.
H5 HPAI pseudovirus neutralisatie (PN) assays zijn op grote schaal toegepast voor antilichaamdetectie vanwege hun veiligheid, hogere gevoeligheid, nauwkeurigheid en geschiktheid voor high-throughput screening. Een algemeen protocol van PN-assay omvat de volgende vier stappen: pseudovirushoeveelheden, serumverdunning, pseudovirus-antilichaamincubatie en luciferase-activiteitsdetectie. De hoeveelheden pseudovirus worden genormaliseerd op basis van RLA-metingen. RLA-waarden van 106 per put in een plaat met 96 putten worden gebruikt om reproduceerbare experimentresultaten te verkrijgen. Het beginpunt van de verdunning van het serummonster moet meer dan 40 zijn. De serummonstercomponent zal uiteraard de luciferasewaarden van pseudovirus verhogen wanneer de verdunningsfactor van het serummonster minder dan 40 is. Pseudovirus-antilichaammengsel wordt gedurende 1 uur bij 37 °C geïncubeerd en vervolgens overgebracht naar MDCK-cellen, gevolgd door RLA-metingen in 60 uur. Luciferase niveaus worden over het algemeen genomen als een hulpmiddel om pseudovirus infectie efficiëntie te bepalen.
In PN-assay zijn er vier belangrijke elementen: het luciferasereporter-eiwit, de assaychemie, een luminometer en microplaten16. Ten eerste is het luciferase-gen geoptimaliseerd voor codon om de eiwitexpressieniveaus in getransduceerde cellen te verbeteren. Engineering van de reporter- en vectorbackbonegenen vermindert het aantal consensustranscriptiefactorbindingsplaatsen om het abnormale transcriptierisico te verminderen. Ten tweede worden de juiste detectiereagentia geselecteerd op basis van het doel van het experiment. PN-assays worden over het algemeen gebruikt als high-throughput methoden om neutraliserende reacties van serum- of antilichaammonsters te detecteren. Dit protocol maakte gebruik van het helder-Glo luciferase-testsysteem, dat het helderste signaal, een breed dynamisch bereik en een hoge gevoeligheid biedt. Wat nog belangrijker is, de halfwaardetijd van het signaal is ongeveer 10 minuten en de cellen worden onmiddellijk getest nadat het substraat is toegevoegd. Een luminometer wordt gebruikt om de luciferaseconcentratie te detecteren. Er worden veel verschillende soorten luminometers vervaardigd. Het basisprincipe is dat de gebruikte machine verschillen in luciferase-activiteit tussen verschillende monsters nauwkeurig kan identificeren. Zwarte of witte polystyreen microplaten moeten worden gebruikt voor opaciteit en lage lichtgevende achtergronden. Witte microplaten kunnen luminescerende signalen verbeteren en hebben een lage achtergrondluminescentie, terwijl zwarte microplaten lichtverstrooiing kunnen minimaliseren om well-to-well cross-talkte verminderen 17.
PN-assays zijn in lijn met traditionele methoden voor het detecteren van neutraliserende antilichaamresponsen. Echter, met inbegrip van alleen HA- en NA-eiwitten van influenza wild-type virussen, pseudovirussen zijn verre van het wild-getypeerde virus. HA kan binden aan de siaalzuurreceptor van de ontvangende cel om een infectie te initiëren. Vervolgens veroorzaken de HA-conformatieveranderingen in het endosoom de fusie van de virale en endosomale membranen, waardoor de virale ribonucleoproteïnen (vRNPs) in het cytoplasma vrijkomen. Influenza pseudovirussen kunnen deze processen alleen imiteren en worden toegepast in gerelateerde onderzoeken.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
De auteurs hebben niets te onthullen.
Acknowledgments
Dit werk werd ondersteund door de onderzoekssubsidies van het Innovation Capacity Building Project van de provincie Jiangsu (BM2020019), Shenzhen Scientific and Technological Project (No. JSGG20200225150702770), Strategic Priority Research Program van de Chinese Academie van Wetenschappen (XDB29030103), Guangdong Scientific and Technological Project (nr. 2020B1111340076) en het Shenzhen Bay Laboratory Open Research Program (nr. SZBL202002271003).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1% Chiken Erythrocyte | Bio-channel | BC-RBC-C001 | Reagent |
| 96-well cell culture plates (flat-bottom) | Thermo fisher scientific | 167008 | consumable material |
| 96-well cell culture plates (round-bottom) | Thermo fisher scientific | 163320 | consumable material |
| Allegra X-15R | Beckman coulter | -- | Equipment/Centrifuge |
| BD Insulin Syringes | BD | 324910 | consumable material |
| Calcium Chloride Anhydrous | AMRESCO | 1B1110-500G | Reagent |
| chloroquine diphosphate | Selleck | S4157 | Reagent |
| Dulbecco’s Modified Eagle Medium (DMEM) | Gibco | 12100-046 | Reagent |
| Fetal Bovine Serum | Gibco | 16000-044 | Reagent |
| HEK293FT | Gibco | R700-07 | Cell line |
| HEPES FREE ACID | AMRESCO | 0511-250G | Reagent |
| HIV-1 p24 Antigen ELISA | ZeptoMetrix | 801111 | Reagent kit |
| Luciferase Assay System Freezer Pack | Promega | E4530 | Reagent kit |
| MDCK.1 | ATCC | CRL-2935 | Cell line |
| Microcentrifuge Tubes 1.5 mL | Thermo fisher scientific | 509-GRD-Q | consumable material |
| Nunc Conical Centrifuge Tubes 15 mL | Thermo fisher scientific | 339650 | consumable material |
| Nunc Conical Centrifuge Tubes 50 mL | Thermo fisher scientific | 339652 | consumable material |
| Nunc EasYFlask 75 cm2 | Thermo fisher scientific | 156499 | consumable material |
| Penicillin-Streptomycin | Gibco | 15140-122 | Reagent |
| Pipette Tips (10 μL) | Thermo fisher scientific | TF102-10-Q | consumable material |
| Pipette Tips (100 μL) | Thermo fisher scientific | TF113-100-Q | consumable material |
| Pipette Tips (1000 μL) | Thermo fisher scientific | TF112-1000-Q | consumable material |
| Serological pipets (5 mL) | Thermo fisher scientific | 170355N | consumable material |
| Serological pipets (10 mL) | Thermo fisher scientific | 170356N | consumable material |
| Trypsin/EDTA | Gibco | 25200-072 | Reagent |
| Varioskan Flash | Thermo fisher scientific | -- | Equipment/Microplate reader |
| Water Jacket Incubator | Thermo fisher scientific | 3111 | Equipment/Cell incubator |
| Pentobarbital sodium salt | Sigma | 57-33-0 | Reagent |
References
- Wang, G., et al. DNA prime and virus-like particle boost from a single H5N1 strain elicits broadly neutralizing antibody responses against head region of h5 hemagglutinin. The Journal of Infectious Diseases. 209 (5), 676-685 (2014).
- Wang, G., Yin, R., Zhou, P., Ding, Z. Combination of the immunization with the sequence close to the consensus sequence and two DNA prime plus one VLP boost generate H5 hemagglutinin specific broad neutralizing antibodies. Plos One. 12 (5), 0176854 (2017).
- Li, Q., Liu, Q., Huang, W., Li, X., Wang, Y. Current status on the development of pseudoviruses for enveloped viruses. Reviews in Medical Virology. 28 (1), 1963 (2018).
- Duvergé, A., Negroni, M. Pseudotyping lentiviral vectors: When the clothes make the virus. Viruses. 12 (11), 1311 (2020).
- Carnell, G. W., Ferrara, F., Grehan, K., Thompson, C. P., Temperton, N. J. Pseudotype-based neutralization assays for influenza: A systematic analysis. Frontiers in Immunology. 6 (161), (2015).
- Trombetta, C., Perini, D., Mather, S., Temperton, N., Montomoli, E. Overview of serological techniques for influenza vaccine evaluation: Past, present and future. Vaccines. 2 (4), 707-734 (2014).
- Wei, C. J., et al. Next-generation influenza vaccines: opportunities and challenges. Nature Reviews Drug Discovery. 19 (4), 239-252 (2020).
- Krammer, F., et al.
- Wei, C. J., et al. Induction of broadly neutralizing H1N1 influenza antibodies by vaccination. Science. 27 (329), 1060-1064 (2010).
- Chernov, V. M., Chernova, O. A., Sanchez-Vega, J. T., Kolpakov, A. I., Ilinskaya, O. N. Mycoplasma contamination of cell cultures vesicular traffic in bacteria and control over infectious agents. Acta Naturae. 6 (3), 41-51 (2014).
- Michael, R. G., Joseph, S. Molecular Cloning: A Laboratory Manual (Fourth Edition). , Cold Spring Harbor Laboratory Press. New York. (2012).
- Kumar, P., Nagarajan, A., Uchil, P. D. Transfection of mammalian cells with calcium phosphate-DNA coprecipitates. Cold Spring Harbor Protocols. 2019 (10), (2019).
- Robert, E. K., Chen, C. A., Okayama, H., John, K. R.
- Robert, E. K., Chen, C. A., Okayama, H., John, K. R. Transfection of DNA into eukaryotic cells. Current Protocols in Molecular Biology. 9, 11-19 (1996).
- Kachkin, D. V., Khorolskaya, J. I., Ivanova, J. S., Rubel, A. A. An efficient method for isolation of plasmid DNA for transfection of mammalian cell cultures. Methods and Protocols. 3 (4), 69 (2020).
- Luciferase assay system. , Available from: https://www.promega.com.cn/products/luciferase-assays/reporter-assays/luciferase-assay-system (2021).
- Corning 96-Well Solid Black or White Polystyrene Microplates. , Available from: https://www.fishersci.com/shop/products/costar-96-well-black-white-solid-plates (2021).
