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Troca de hidrogênio/deutério à base de eletroforose capilar para caracterização conformacional de proteínas com espectrometria de massa de cima para baixo

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DOI:

10.3791/62672

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8 de junho de 2021

 ,  ,  ,  ,  , 
1School of Chemistry and Materials Science, Nanjing Normal University, 2Institute for Cell Analysis, Shenzhen Bay Laboratory, 3Department of Chemistry, University of British Columbia

Neste artigo

Resumo

Apresentado aqui é um protocolo para uma abordagem de troca de hidrogênio/deutério à base de eletroforese capilar (HDX), juntamente com espectrometria de massa de cima para baixo. Essa abordagem caracteriza a diferença nas estruturas de alta ordem entre diferentes espécies proteicas, incluindo proteínas em diferentes estados e diferentes proteoformes, conduzindo o diferencial simultâneo HDX e a separação eletroforética.

Resumo

A resolução da heterogeneidade conformacional de múltiplos estados protetivos que coexistem na solução continua sendo um dos principais obstáculos na caracterização da terapêutica proteica e na determinação das vias de transição conformais críticas para funções biológicas, que vão do reconhecimento molecular à catálise enzimática. A reação de troca de hidrogênio/deutério (HDX), juntamente com a análise espectrométrica de massa superior para baixo (MS), fornece um meio de caracterizar estruturas e dinâmicas de alta ordem de proteínas de forma mais adequada. O poder de resolução conformacional desta técnica é altamente dependente da eficiência de separar estados proteicos no nível de proteína intacta e minimizar o teor protic residual não deutado durante as reações HDX.

Aqui descrevemos uma variante capilar baseada em eletroforese (CE) da abordagem HDX MS que visa melhorar a resolução conformacional. Nesta abordagem, as proteínas sofrem reações HDX enquanto migram através de uma solução de eletrólito de fundo deuterado (BGE) durante a separação eletroforética capilar. Diferentes estados proteicos ou proteoformes que coexistem na solução podem ser eficientemente separados com base em suas diferentes relações carga-tamanho. A diferença na mobilidade eletroforética entre proteínas e moléculas de solventes protic minimiza o solvente residual não deuterado, resultando em um ambiente de deuteração quase completo durante o processo HDX. A interface de fluxo microvial CE-MS permite uma ionização de eletrospray eficiente das espécies de proteínas elucidadas após uma rápida mistura com a solução de modificação de saciamento e desnaturação na saída do pulverizador. A análise on-line de cima para baixo de MS mede o nível global de deuteração das espécies de proteínas intactas e, posteriormente, a deuteração de seus fragmentos de fase gasosa. Este artigo demonstra essa abordagem em HDX diferencial para sistemas, incluindo as variantes de proteína natural que coexistem no leite.

Introdução

Distinguir espécies proteicas em diferentes estados conformais, vinculantes ou modificadores e caracterizar suas diferenças estruturais são importantes para monitorar os caminhos das transições entre essas espécies envolvidas em eventos biológicos, que vão desde o reconhecimento molecular até a catálise enzimática, e a compreensão dos mecanismos subjacentes a esses eventos. As técnicas biofísicas convencionais não fornecem uma solução completa devido às limitações como resolução insuficiente e perda de informações dinâmicas na solução. A troca de hidrogênio/deutério juntamente com espectrometria de massa (HDX MS) é uma técnica que rotula as características estruturais e conformais das proteínas com deutério (2H) através da troca entre átomos de hidrogênio labile de proteínas e 2H da solução deliberadamente introduzida 2H2O. Prótons envolvidos na ligação de hidrogênio ou que são sequestrados do solvente no interior da proteína não trocam prontamente1. Assim, como a taxa de câmbio em um local de troca é altamente dependente de seu envolvimento em estruturas de alta ordem, as estruturas proteicas podem ser reveladas em alta resolução espacial por MS que sonda a extensão e taxa de captação de 2H com base nas diferentes massas atômicas entre 1H e 2H. Nas últimas décadas, o HDX MS tornou-se uma técnica de excelente sucesso para estudar conformações e dinâmicas proteicas2.

Na abordagem clássica de baixo para cima do HDX MS, o conjunto de espécies proteicas em diferentes estados conformais, vinculativos ou modificações é proteolisado sem separação ao nível de proteína intacta, tornando inviável caracterizar espécies individuais analisando os fragmentos proteolíticos resultantes com conteúdo de deutério convolucido. Em contraste, na abordagem de cima para baixo, diferentes estados proteicos ou proteoforms que incorporaram diferentes conteúdos de deutério dão origem a múltiplas distribuições de massas proteicas intactas em um exame de ESM. Isso permite que as espécies individuais sejam separadas por seleção em massa de íons correspondentes a cada distribuição de massa usando um filtro de massa adequado (como um quadrupole) e a caracterização de suas diferenças conformais na análise subsequente de MS 3,4,5,6. No entanto, a eficiência da separação de estados proteicos ou proteoformes nesta estratégia é limitada pela extensão da diferença em suas distribuições de massa correspondentes.

A eletroforese capilar (CE) fornece um meio de separar espécies proteicas com base em suas diferentes cargas e tamanhos hidrodinâmicos na fase de solução com alta eficiência7. A combinação de CE com HDX oferece separação adicional de estados proteicos ou proteoforms na fase da solução. Além disso, o pequeno volume do capilar CE permite a utilização de uma solução totalmente deutada como a solução de eletrólito de fundo (BGE), ou seja, o buffer em execução, tornando o capilar como um reator HDX para amostras de proteínas. Devido à diferença na mobilidade eletroforética entre proteínas e reagentes protic no processo de eletroforese, a condução do HDX durante a CE resulta em um ambiente de deuteração quase completo para os analitos proteicos com conteúdo residual mínimo não deutedado, aumentando assim a sensibilidade da análise estrutural usando dados HDX. Como tal, desenvolvemos uma abordagem HDX diferencial baseada em CE, juntamente com MS de cima para baixo para caracterizar estruturas de alta ordem proteicas de forma específica do estado ouproteoforme 8.

Este artigo descreve protocolos para essa abordagem detalhando as etapas de preparação de materiais, procedimento experimental e análise de dados. Fatores que podem afetar o desempenho do método ou a qualidade dos dados estão listados em notas curtas. Os resultados representativos aqui apresentados incluem dados diferenciais de HDX de misturas de diferentes proteínas e variantes naturais de β-lactoglobulina bovina (β-lg), a maior proteína de soro de leite presente no leite9. Demonstramos eficiência de separação, reprodutibilidade e desempenho de rotulagem em 2H das duas variantes abundantes de β-lg, ou seja, A e B10,11 durante o HDX baseado em CE e caracterização específica de variantes de suas conformações.

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Protocolo

NOTA: Utilize reagentes de grau de cromatografia líquida de alto desempenho (HPLC) ou reagentes de grau MS sempre que possível para minimizar os contaminantes que possam interferir na análise de MS. Não toque na interface CE-MS com as mãos nuas durante a medição para evitar a possibilidade de um choque elétrico causado pela tensão eletroforética ou por tensão eletrospray.

1. Preparação do material

  1. Modificação da capilar de sílica fundida para CE
    1. Prepare uma solução de celulose hidroxipropílica (HPC) de 5% (w/w) dissolvendo o pó de HPC (peso molecular [MW]: 100 kDa) em água com agitação contínua à temperatura ambiente em um agitador magnético por ~12 h ou até o desaparecimento completo de partículas sólidas12. Remova quaisquer bolhas de ar visíveis com um ultrassônico.
    2. Montar um capilar de vidro de sílica fundido (diâmetro interno [ID]: 50 μm, diâmetro externo [OD]: 360 μm) de aproximadamente 85 cm de comprimento em um instrumento CE. Enxágüe o capilar infundindo continuamente um solvente orgânico, como acetona13, usando o autosampler de CE a uma pressão de infusão de 40 psi por 10-15 min.
    3. Encha o capilar limpo com solução HPC usando o autosampler a uma pressão de infusão de 40 psi (que muitas vezes leva ~40 min). Infundir ar no capilar repleto de HPC a 40 psi para garantir o fluxo de ar livre no capilar, indicado pelas bolhas de ar ejetadas do capilar após a imersão na água.
    4. Asse o capilar revestido de HPC em um forno programável à temperatura (idealmente o forno de coluna controlado pela temperatura de um cromatógrafo de gás programado pela temperatura) com gás nitrogênio (25 psi) fluindo através do capilar, seguindo o programa de temperatura mostrado na Figura 1.
    5. Esfrie o forno à temperatura ambiente antes de tirar o capilar. Use este capilar modificado por HPC para separação ce.

figure-protocol-1
Figura 1: Um programa de temperatura recomendado para cozimento capilar. Por favor, clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

  1. Solução de eletrólito de fundo (BGE) e solução de modificação8
    1. Prepare 1-10 mL de BGE na concentração desejada (por exemplo, 10 mM) dissolvendo a quantidade adequada de acetato de amônio em 2H2O. Coloque 200 μL-alíquotas de BGE em frascos BGE separados e selou os frascos com parafilm para minimizar a reação HDX entre BGE e vapor de água no ar.
    2. Prepare 10 mL de uma solução modificador com 75% (v/v) de metanol e 25% (v/v) de água, com pH ajustado para 2,5 utilizando ácido fórmico.
      NOTA: Use 2H2O e metanol desuterado para preparar a solução modificadora se os átomos de deutério nas cadeias laterais e as amidas desprotegidas de espinha dorsal devem ser retidos para detecção por MS.
  2. Desselting de amostras de proteínas
    1. Prepare uma solução de acetato de amônio em água não deuterada na concentração desejada.
      NOTA: Recomenda-se uma concentração inferior a 100 mM para evitar uma alta corrente elétrica durante a eletroforese e o efeito de aquecimento Joule resultante.
    2. Quando necessário, ajuste o pH da solução de acetato de amônio ao nível desejado usando ácido fórmico (para pH < 6,8) ou hidróxido de amônio (para pH > 6,8).
    3. Substitua os tampões originais da solução proteica por uma solução de acetato de amônio (preparada em água não deutada na concentração desejada; pH ajustada para 7,5 com hidróxido de amônio) através de pelo menos cinco concentrações sequenciais e passos de diluição a 4 °C usando um filtro centrífuga com um corte adequado de MW.
      NOTA: As amostras de proteína a serem desseladas podem ser provenientes de procedimentos de produção anteriores (por exemplo, purificação ou formulação) ou preparadas pela dissolução do pó liofilizado da proteína. Os "sais" a serem removidos das soluções amostrais nesta etapa referem-se, em geral, a todos os íons pequenos ou moléculas que não são voláteis. Embora essas espécies possam ser eficientemente separadas das proteínas durante o processo de eletroforese, esta etapa é recomendada para evitar comprometer a resolução eletroforética e, assim, minimizar a contaminação do espectrômetro de massa. Quando os analitos proteicos devem ser estabilizados por sais ou aditivos específicos, inclua-os no BGE.
    4. Determine a concentração de proteínas usando um espectrofotômetro UV-Vis microvolume.

2. Operação da análise HDX MS baseada em CE

NOTA: O espectrômetro de massa utilizado nesta abordagem deve ser equipado com um analisador de massa com resolução ultra-alta, como uma ressonância ciclotron de íons de ion fourier (FTICR) ou orbitrap, um filtro de massa, como um quadrupole que permite a seleção em massa de íons precursores para fragmentação, e dissociação de transferência de elétrons (ETD) ou dissociação de captura de elétrons (ECD) funções para realizar análises de cima para baixo com dados de MS tandem confiáveis (sinais isototaticamente resolvidos de fragmentação).

  1. Otimização das configurações de CE e MS
    1. Realize uma medição piloto de MS usando uma fonte padrão de ionização de eletrospray (ESI) pulverizando a amostra pré-carregada de uma capilaridade de vidro borossilicato revestida de metal (o esquema nanoESI "estático" ou a amostra continuamente infundida de um emissor de metal para otimizar as configurações de MS para medição de proteínas intactas (MS1) e seus fragmentos de fase de gás (MS2). Fragmentar as espécies proteicas de interesse por seleção em massa do conjunto de seus íons em um único estado de carga, seguido por ETD ou ECD dos íons precursores.
      NOTA: As configurações essenciais incluem os parâmetros que afetam a desolação, a seleção em massa de íons precursores (para evitar interferência de outras espécies) e a eficiência de fragmentação. Tanto o centro quanto a largura da janela de seleção em massa devem ser aumentados para coincidir com a distribuição em massa resultante dos íons analitos após o HDX. Como a janela de eluição de uma espécie de proteína em CE normalmente varia de 0,5 min a 2 min, avalie a eficiência de fragmentação com base em exames de MS2 acumulados em uma janela de tempo comparável. Os valores ideais desses parâmetros são específicos da proteína; os leitores são encaminhados a relatórios publicados anteriormente para configurações exemplares 8,14.
    2. Realize uma medição piloto de CE usando um instrumento CE equipado com um detector óptico, ou seja, um detector de matriz de fotodioda (PDA) ou um detector UV para otimizar as configurações ce para a separação da espécie proteica e os tempos de migração, o que equivale aos tempos de reação HDX.
      NOTA: Esta etapa é opcional dependendo da disponibilidade do detector óptico de CE. Na ausência de um detector óptico, as configurações CE podem ser otimizadas utilizando CE-MS após a conclusão da seção 2.2, seguindo as instruções descritas na seção 2.3. As configurações essenciais incluem parâmetros que afetam a eficiência da separação, formas de pico mostradas em eletroferógramas e tempos de eluição.
  2. Pré-condicionamento da configuração CE-HDX
    1. Limpe a interface CE-MS microvial de fluxo com uma mistura de 50% de metanol, 49% de água e 1% de ácido fórmico (v/v) usando ultrassônica por pelo menos 30 minutos à temperatura ambiente.
    2. Após a montagem do capilar modificado por HPC em um instrumento CE, enxágue o capilar com bge usando o autosampler por 10 minutos e deixe o capilar cheio de BGE.
    3. Obtenha um comprimento adequado de tubo capilar de sílica fundido não modificado (ID: 50 μm, OD: 360 μm) como tubo de infusão para a solução do modificador. Conecte a tubulação do modificador a uma seringa de vidro apertada a gás com uma ponta cega usando uma maçaria e manga adequada, e enxágue a tubulação com a solução de modificador usando uma bomba de infusão por pelo menos 10 minutos.
    4. Insira as saídas do tubo capilar e modificador CE revestido de HPC, que foram carregados com soluções correspondentes, na interface CE-MS limpa, conforme ilustrado na Figura 2.
    5. Avance a seringa para a infusão do modificador manualmente ou com a bomba de infusão para garantir que a solução do modificador atinja a ponta da interface. Monte a interface CE-MS montada em uma carcaça de fonte nanoESI de um espectrômetro de massa.

figure-protocol-2
Figura 2: Ilustração esquemática da configuração HDX MS baseada em CE. Este número foi modificado a partir de8. Abreviaturas: BGE = solução de eletrólito de fundo; CE = eletroforese capilar; MS = espectrometria de massa; HDX = troca de hidrogênio/deutério; ESI = ionização eletrospray; FTICR = Ressonância ciclotron de íons de ion de fourier-transform; ETD = dissociação de transferência de elétrons; ECD = dissociação de captura de elétrons. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

  1. Separação CE simultânea, reação HDX e análise de MS
    NOTA: Recomenda-se que o BGE desuterado seja usado dentro de 1 dia após o deslaparo.
    1. Aplique uma tensão de pulverização de 3-5 kV na interface CE-MS.
    2. Comece a infundir a solução do modificador com a bomba de infusão a uma vazão que varia de 0,1 a 10 μL/min, e garanta um eletrospray estável na ponta da interface CE-MS.
    3. Coloque o frasco de amostra contendo o BGE no autosampler e use-o na etapa 2.3.4 para adquirir eletroferogramas em branco e espectros de massa em branco.
    4. Injete a solução amostral usando o autosampler a 2 psi e por uma duração adequada para permitir a injeção de uma quantidade desejada da amostra. Estime o volume de injeção utilizando a relação entre o volume de injeção e os parâmetros de injeção15 definidos pela equação (1).
      figure-protocol-3 (1)
      Onde Vinj é o volume de injeção, Δp é a pressão da injeção, dc é o diâmetro interno do capilar, A é a seção transversal do capilar, tinj é a duração da injeção, η é a viscosidade do líquido no capilar, e L é o comprimento do capilar.
    5. Inicie a separação ce aplicando uma tensão eletroforética de 30 kV e pressão de infusão variando de 0 a 2 psi, e adquira o eletroferograma. Enquanto isso, inicie a aquisição dos dados de MS no modo cromatógrafo onde o gráfico atual de íon é adquirido em função do tempo, e as varreduras de MS correspondentes não são automaticamente combinadas em um único espectro.
      NOTA: As proteínas sofrem reação hdx espontânea no ponto de contato com moléculas de 2H2O em BGE durante sua migração eletroforética nesta etapa. A detecção óptica para CE pode ser usada além da detecção de MS. Como a detecção na coluna requer a remoção de um certo comprimento de revestimento de poliimida na extremidade de saída do capilar de sílica fundido, deve-se tomar cuidado adicional para evitar danos capilares durante a montagem da interface CE-MS.
    6. Salve o eletroferograma em branco e o espectro de massa como referências.
      NOTA: Os dados em branco devem ser usados para solução de problemas em vez de subtração da linha de base.
    7. Coloque os frascos de amostra contendo as concentrações desejadas das soluções de amostra de proteína no autosampler. Adquira os eletroferogramas e os espectros de massa para as amostras de proteínas seguindo as etapas 2.3.4-2.3.5. Colete um número adequado de exames de ESM para obter espectros MS1 das espécies de proteínas eletroforeticamente separadas e 2H.
    8. Realize medições de MS tandem para as espécies de interesse, seja após a aquisição do espectro MS1 dentro da mesma corrida ou em uma corrida subsequente e separada.
    9. Quando necessário, ajuste os tempos de migração/tempos de reação HDX alterando a pressão de infusão ou o comprimento do capilar CE. Se o tempo de reação hdx deve ser menor do que o tempo de migração, use a abordagem descrita anteriormente8, que emprega bge desuterado e não deuterado no capilar durante o processo CE.
    10. Lave o capilar ce com bge a uma pressão de 20 psi por pelo menos 10 minutos após cada medição.
    11. Após a conclusão dos experimentos, limpe a interface CE-MS e toda a tubulação para armazenamento.
    12. Adquira um conjunto de dados da amostra "endpoint" HDX (que pode ser preparado usando abordagens descritas anteriormente 6,16) com MS no modo de infusão direta.
      NOTA: Esta etapa só é necessária quando uma solução de modificação deuterada é usada para HDX baseado em CE.

3. Análise de dados

  1. Análise dos dados da CE
    1. Use uma das seguintes parcelas como o eletroferógrafo para determinar as características eletroforéticas, incluindo o número de picos, tempos de migração e eficiência de separação: (a) absorvência UV versus tempo de migração, adquirido pelo detector óptico do instrumento CE (quando disponível); b Gráfico total da corrente de íon (TIC) adquirido por MS; c O gráfico de corrente de íons extraído (EIC/XIC) adquirido pela MS.
      NOTA: O EIC/XIC fornece a relação sinal/ruído ideal (S/N), em geral, entre os formatos acima mencionados de eletroferogramas. Vale ressaltar que mesmo na ausência de vieses instrumentais, enquanto a absorção UV é proporcional à concentração de massa de proteína, o sinal de EM é proporcional à concentração molar. Portanto, é razoável observar diferenças nos padrões de pico entre eletroferógramas derivados de CE e MS.
    2. Use a área sob a curva (AUC) dos picos mostrados nos eletroferógramas para semi-quantitação. Para amostras envolvendo complexos proteicos, utilize a abordagem descrita anteriormente17 para deduzir os dados de concentração de massa dos eletroferogramas TIC/EIC.
  2. Análise dos dados de MS
    1. Obtenha os espectros MS1 e MS2 combinando as varreduras MS1 e MS2 adquiridas nas janelas de eluição correspondentes, respectivamente.
    2. Determine as massas da proteína intacta (M (proteína intacta)) e fragmentos por qualquer um dos dois métodos seguintes.
      1. Calcule as massas médias dos íons dando origem aos aglomerados de sinais isotopicamente resolvidos.
      2. Use o centro das curvas semelhantes à Gaussiana resultantes da montagem dos envelopes isotópicos correspondentes6.
    3. Use softwares como Biopharma Finder, ProSight18 ou MASH Suite19 para gerar a lista de massa dos íons de fragmento e identificá-los.
  3. Análise dos dados HDX
    1. Determine o nível geral de deuteração de uma espécie de proteína intacta usando equação (2).
      figure-protocol-4 (2)
      onde M (2H) ou M (1H) são pesos atômicos de 2H ou 1H. O asterisco indica dados da amostra de 2H.
    2. Determine a proteção cumulativa ou a deuteração cumulativa de backbone-amides de um segmento específico.
      1. Para dados adquiridos com uma solução modificadora deuterada, use equações (3) e (4) para determinar o nível de proteção cumulativa.
        figure-protocol-5 (3)
        figure-protocol-6 (4)
        Onde P(Sk(N)) é a proteção total do segmento n-terminal abrangendo resíduos 1 a k, P(Sm(C)) é a proteção total do segmento terminal C que compreende m resíduos, M (2H) ou M (1H) são pesos atômicos de 2H ou 1H, e M (ci) ou M (zi) são os pesos moleculares de ci ou zi ions.
        NOTA: O asterisco duplo indica dados da amostra de "ponto final" HDX.
      2. Para dados adquiridos com uma solução modificadora não deuterada, use equações (5) e (6) para determinar o nível de deuteração cumulativa.
        figure-protocol-7 (5)
        figure-protocol-8 (6)
        Quando D(Sk(N)) é a absorção cumulativa de deutério do segmento n-terminal abrangendo resíduos de 1 a k; D(Sm(C)) é a captação cumulativa de deutério do segmento terminal C que compreende resíduos m .
    3. Determine o nível de deuteração em um grupo de amide backbone local
      1. Para dados adquiridos com uma solução modificadora deuterada, use equações (7), (8), (9), (10) e (11) para determinar o nível de proteção local.
        para dados deduzidos de c-ions
        figure-protocol-9 (7)
        para dados deduzidos de z-ions
        figure-protocol-10 (8)
        Onde P(Ri) é a proteção de uma amida de espinha dorsal no resíduo i, e o subscrito "total" denota o número total de resíduos da proteína.
        Para locais de resíduos onde faltavam íons de fragmentos subsequentes, atribua P(Ri) usando equações (9) e (10).
        para dados deduzidos de c-ions
        figure-protocol-11 (9)
        para dados deduzidos de z-ions
        figure-protocol-12 (10)
        Em seguida, determine o nível de deuteração D(Ri) em um grupo de amide backbone local usando equação (11).
        figure-protocol-13(11)
      2. Para dados adquiridos com uma solução modificadora não deuterada, use equações (12), (13), (14) e (15) para determinar o nível de proteção local.
        para dados deduzidos de c-ions
        figure-protocol-14(12)
        para dados deduzidos de z-ions
        figure-protocol-15(13)
        Onde D(Ri) é a proteção de uma amida de espinha dorsal no resíduo i, e o subscrito "total" denota o número total de resíduos da proteína.
        Para locais de resíduos onde faltavam íons de fragmento subsequentes, atribua D(Ri) usando equações (14) e (15).
        para dados deduzidos de c-ions
        figure-protocol-16 (14)
        para dados deduzidos de z-ions
        figure-protocol-17 (15)

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Resultados

A alteração da pressão de infusão do BGE permite o ajuste tanto da eficiência de separação quanto do tempo de migração, o que equivale ao tempo de reação HDX das proteínas a serem separadas (Figura 3). Uma menor pressão de infusão resulta em uma melhor separação dos picos de CE ao custo da duração do experimento (Figura 3A). Um tempo de reação de migração/HDX mais longo resulta em um nível mais alto de deuteração dos analitos proteicos (Figu...

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Discussão

Os objetivos do revestimento da parede interna do capilar CE incluem a minimização do fluxo eletroosmótico e da absorção de proteínas durante o processo CE13. Embora o fluxo eletroosmótico seja benéfico para a análise ce convencional de pequenas moléculas devido à sua capacidade de conduzir espécies neutras ou opostamente carregadas para o detector, compromete a eficiência de separação de espécies proteicas com tamanhos semelhantes e cargas líquidas em solução. O revestimento do capilar com HPC mi...

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Divulgações

D. D. Y. Chen é um dos fundadores do Instituto de Conhecimento para Saúde para Biomoléculas, que está comercializando a interface de fluxo microvial CE-MS. Outros autores não têm nada a revelar.

Agradecimentos

Este trabalho foi apoiado por subsídios da Fundação Nacional de Ciência Natural da China (NSFC 21974069). Os autores também receberam apoio do Instituto de Análise Celular, Laboratório de Shenzhen Bay, China; Jiangsu Centro de Inovação Colaborativa de Materiais Funcionais Biomédicos; e Jiangsu Key Laboratory of Biomedical Materials na Universidade Normal de Nanjing, China.

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Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo
NomeEmpresaNúmero de catálogoComentários
acetato de amônioFisher ChemicalA/3446/50≥ 99%
CESI 8000 plus sistema de eletroforese capilarSciex, EUA
centrífugacentrífugo 5406000097Eppendorf
MerckUFC20102410 kDa de corte
de óxido de deutérioEnergia E090001química 99,9% D
ácido fórmicoAcros Organics 
capilar de vidro de sílica fundidoPolymicro Technologies1068150017ID 50μ m, OD 360μ m
cromatografia gasosaAgilentGC6890N
ácido clorídricoSigma Aldrich258148
hidroxipropilceluloseAladdinH113415MW 100000
agitadores magnéticosDLAB8030101212
metanolFisher ChemicalA456-4MS
grau microvolume UV-Vis espectrofotômetroDeNovix84677JK7731
mioglobinaSigma AldrichM1882
Orbitrap Fusion Lumos espectrômetro de massaThermo Fisher Scientific, EUA
PA 800 Plus Análise Farmacêutica CE SystemBeckman Coulter, EUA
Q Exactive UHMR mass SpectrometerThermo Fisher Scientific, Alemanha
sódio  hidróxidoSigma AldrichS5881
ubiquitinaSigma AldrichU6253
ultrasonicatorSCIENTZSB-5200
β-lactoglobulinaSigma AldrichL0130
Filtro 270480250

Referências

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