Avaliação do Comprometimento Motor em C. elegans Modelos de Esclerose Lateral Amiotrófica

Resumo

Este protocolo descreve dois ensaios sensíveis para discriminação entre prejuízos motores leves, moderados e graves em modelos C. elegans de esclerose lateral amiotrófica, com utilidade geral para cepas de C. elegans , com motilidade alterada.

Resumo

A doença neurodegenerativa esclerose lateral amiotrófica (ELA) apresenta perda progressiva de neurônios motores acompanhada de fraqueza muscular e comprometimento motor que piora com o tempo. Embora tenham sido feitos avanços consideráveis na determinação de condutores genéticos de ELA para um subconjunto de pacientes, a maioria dos casos tem uma etiologia desconhecida. Além disso, os mecanismos subjacentes à disfunção e degeneração do neurônio motor não são bem compreendidos; portanto, há uma necessidade contínua de desenvolver e caracterizar modelos representativos para estudar esses processos. Os elegans de caenorhabditis podem adaptar seu movimento às restrições físicas de seu entorno, com dois paradigmas de movimento primário estudados em um ambiente de laboratório: rastejando sobre uma superfície sólida e nadando em líquido. Estes representam uma interação complexa entre sensação, neurônios motores e músculos. C. elegans modelos de ELA podem exibir prejuízo em um ou ambos esses paradigmas de movimento. Este protocolo descreve dois ensaios sensíveis para avaliar a motilidade em C. elegans: um ensaio de locomoção radial otimizado medindo rastejando em uma superfície sólida e um método automatizado para rastrear e analisar a natação em líquido (thrashing). Além da caracterização do comprometimento motor básico dos modelos de ELA, esses ensaios podem detectar supressão ou aprimoramento dos fenótipos de intervenções genéticas ou pequenas moléculas. Assim, esses métodos têm utilidade para estudar modelos de ELA e qualquer cepa C. elegans que expondo motilidade alterada.

Introdução

A Esclerose Lateral Amiotrófica (ELA) é uma doença neurodegenerativa debilitante relacionada ao envelhecimento com um impacto particular nos neurônios motores. A doença apresenta perda de neurônios motores no cérebro e medula espinhal e comprometimento motor progressivo. Isso resulta em incapacidade funcional grave e morte prematura, tipicamente dentro de 3-5 anos após o ^{diagnóstico1}. Mutações em pelo menos 38 genes podem causar ELA; no entanto, a maioria dos pacientes com ELA acumula inclusõesubiquitinadas da proteína TDP-43 como sua patologia primária em neurônios e células gliais2,3,4. Vários modelos animais foram desenvolvidos para estudar os mecanismos subjacentes que causam ou contribuem para a ALS in vivo (revisada ⁱⁿ⁵). Em C. elegans, esses modelos incluem mutações de perda de função genéticas em homólogos de genes causadores de ELA ou expressão transgênica de genes humanos da ELA. Existem inúmeras vantagens para modelar a ELA em C. elegans. C. elegans são um animal simples tratável com um sistema nervoso diferenciado, paradigmas comportamentais bem caracterizados e considerável homologia genética para ^humanos6,7. Existem muitas ferramentas para trabalhar com C. elegans, incluindo robustas capacidades de edição de genomas, repórteres fluorescentes in vivo de neurodegeneração, paradigmas de triagem RNAi, genética tratável e ensaios comportamentais e fenotípicos estabelecidos. C. elegans modelos de ALS recapitulam aspectos da doença humana, incluindo acúmulo de proteína insolúvel, neurodegeneração e morte ^precoce8,9. Além disso, a disfunção motora com perturbação de comportamentos de rastreamento e natação está presente em muitos modelos C. elegans ALS.

Este protocolo descreve dois métodos para caracterizar fenótipos motores C. elegans : o ensaio de locomoção radial para avaliar o rastreamento em uma superfície sólida e a avaliação da natação em líquido (thrashing) usando o rastreamento e análise automatizados do WormLab. Estes métodos sensíveis para caracterizar déficits motores permitem comparações de gravidade e oferecem ferramentas para medir a supressão e melhorias dos fenótipos motores. O ensaio de locomoção radial quantifica diferenças na motilidade rastejante (movimento sinusoidal em uma superfície sólida) entre populações de vermes. Este ensaio se aproveita do comportamento de exploração natural não estimulado de C. elegans colocando vermes em um único local em uma placa e marcando sua localização final após um determinado período de ^tempo10. Alternativamente, os ensaios de natação em líquido (thrashing) contam dobras corporais de vermes individuais durante um determinado período de tempo. A contagem manual de curvas corporais pelo olho humano é intensiva em tempo e normalmente exibe considerável variabilidade entre experimentadores. O uso de rastreamento e análise automatizado assistido por computador pode eliminar grande parte dessa variabilidade. Além da caracterização do comprometimento motor de base dos modelos de ELA, tanto a locomoção radial quanto os ensaios de natação podem detectar modulação de fenótipos locomotores distintos de intervenções genéticas ou pequenas moléculas. Esses métodos têm utilidade para estudar modelos de ELA e qualquer cepa C. elegans que expondo motilidade alterada.

Protocolo

1. Ensaio de locomoção radial

1. Prepare placas de Petri de 100 mm ou 150 mm de diâmetro cerca de metade cheias de mídia de crescimento de nematode (NGM) e semeadas com um gramado uniforme de bactérias OP50 para cobrir toda a superfície do ágar.
2. Vire as placas de ensaio NGM de cabeça para baixo e rotule a parte inferior com um identificador para as cepas C. elegans a serem avaliadas, 2 placas por cepa (Figura 1A).
3. Faça um pequeno ponto com o marcador no centro da placa de cabeça para baixo (Figura 1A).
4. Enquanto trabalhava com um microscópio dissecando, a transferência de 15-20 estágios correspondeu ¹¹ worms para o centro da placa de ensaio diretamente sobre o ponto central (visível através do NGM) usando uma picareta de fio de platina (Figura 1B).
   NOTA: Tente transferir todos os worms ao mesmo tempo ou o mais rápido possível.
   1. Defina um temporizador para 30 minutos após os vermes serem colocados no centro da placa. Coloque a tampa de volta na placa e reserve-a (Figura 1C).
5. Continue transferindo vermes até que todas as cepas estejam nas placas de ensaio designadas, anotando aproximadamente quanto tempo leva para transferir entre as placas (aponte para ~ 1 min entre as placas). Mantenha todas as placas na mesma ordem que foram criadas.
6. Depois de 30 min, comece a marcar a primeira placa.
   1. Remova a tampa e coloque a placa de frente para baixo sob o microscópio de dissecação, de tal forma que a parte de trás rotulada da placa esteja virada para cima, e o ágar NGM esteja entre a linha de visão e os vermes. A placa estará de cabeça para baixo do uso normal.
   2. Ajuste o foco do microscópio até que os vermes sejam visíveis através do ágar.
   3. Usando uma caneta de ponta de feltro colorida diferente do ponto central, coloque um pequeno ponto na localização de cada verme - siga os rastros de vermes através do gramado bacteriano para encontrar os animais mais distais.
   4. Verifique a borda da placa como alguns vermes podem acabar lá. Além disso, conte e regista o número de vermes no ponto central (Figura 1D).
7. Continue marcando todas as placas de ensaio em ordem, de modo que todas as placas tenham 30 minutos de tempo de atividade, tendo o cuidado de explicar o tempo que levou para configurar a placa. Em seguida, realize medições manuais ou digitais conforme descrito nas etapas 1.8 ou 1.9.
8. Realize medições manuais usando uma régua.
   1. Use uma régua para medir em mm, a distância do ponto central até as marcas finais de localização de cada verme e regissão a distância. Para ajudar a acompanhar o progresso durante a pontuação, marque o primeiro ponto marcado com uma pequena linha de marcação.
   2. Registo de comprimento recorde para cada ponto consecutivamente girando a placa de forma no sentido horário (Figura 1E).
9. Realize a medição digital usando um scanner e ImageJ.
   1. Usando um scanner de blocos, escaneie a parte de trás da placa de ensaio ao lado de uma régua (números voltados para a superfície de varredura) (Figura 2A).
   2. Abra a imagem da placa digitalizada no ImageJ ou em um programa semelhante.
      NOTA: ImageJ é um software gratuito de processamento de imagem baseado em Java hospedado pelo NIH.
   3. Clique na Ferramenta Linha Reta e, em seguida, desenhe uma linha conectando os pontos de 1 cm e 2 cm na imagem digitalizada da régua (Figura 2B).
      NOTA: Segurar a tecla do computador Shift forçará a linha ao ângulo de 45° mais próximo.
   4. Navegue até o menu Analisar e use-o para definir a escala (Analisar | Escala definida) (Figura 2C).
   5. Digite a Distância Conhecida (10) e Unidades de Comprimento (mm) nas caixas apropriadas, não ajuste a distância no número de pixels. Verifique globalmente para aplicar a mesma escala a todas as imagens que estão sendo analisadas em cada sessão ImageJ; caso contrário, defina a escala para cada imagem após a abertura (Figura 2D). Clique em Ok.
      NOTA: As etapas 1.9.2-1.9.5 são realizadas para definir a escala de medição. As medições desta imagem agora relacionarão automaticamente o comprimento das linhas ao pixel definido: relacionamento de comprimento. As imagens escaneadas a 300 dpi terão uma relação aproximada de 11,8 pixels por mm.
   6. Use a ferramenta paintbrush para marcar um pouco acima do primeiro ponto a ser pontuado.
      NOTA: Este é um indicador visual para o primeiro worm marcado.
   7. Use a ferramenta linha reta para desenhar uma linha do ponto central para o primeiro ponto de dados do worm.
   8. Clique na tecla M no teclado para medir a distância. Alternativamente, navegue até o menu Analisar e escolha Medir (Analisar | Medida). Em ambos os casos, a medição aparecerá em uma nova janela; esta janela coletará todas as medidas por imagem.
   9. Mantendo o ponto central constante, mova a extremidade da linha tocando o primeiro ponto de worm para o próximo ponto de worm, movendo-se no sentido horário e clique na tecla M para medir.
   10. Continue medindo cada ponto de forma no sentido horário até que todos os pontos sejam marcados.
   11. Copiar e colar dados de medição de comprimento em uma planilha para salvá-los. Em seguida, repita o processo para cada imagem da placa digitalizada.
       NOTA: Etapas 1.9.6 - 1.9.11 medem os valores de deslocamento do worm (Figura 2E-F).
10. Faça análise estatística.
    1. Combine réplicas dentro de um único experimento de modo que um número total pontuado é entre 30-40 worms.
    2. Realizar réplicas experimentais independentes em diferentes dias e com populações independentes de vermes para acabar com 3 réplicas experimentais independentes.
    3. Analise os dados utilizando análises estatísticas apropriadas, como o teste t do Student para 2 cepas ou ANOVA de 1 via para três ou mais cepas.

2. Ensaio de natação analisado por computador

NOTA: Este protocolo contém instruções detalhadas para o sistema de hardware e software WormLab comercialmente disponível (ver Tabela de Materiais). No entanto, o fluxo de trabalho pode ser aplicado a outros sistemas de ensaio de natação analisados por computador.

1. Configuração e gravação de vídeos.
2. Levante a blindagem no hardware de imagem (Figura 3) e verifique se a altura da câmera está definida para o local esperado.
   NOTA: A altura ideal para capturar vermes em uma placa de 35 mm é tal que o terceiro do furo do parafuso roscado inferior seja visível abaixo do suporte de montagem da câmera ajustável, mas nenhum orifício de montagem adicional é visto acima do furo do parafuso (aproximadamente 30,5 cm acima do palco) (Figura 3C). Isso resultará em uma relação de captura de 11,43 μm/pixel. Considere adicionar um indicador de "altura correta" para que isso seja mais fácil de confirmar antes de iniciar o ensaio. Consulte a etapa 2.18 do protocolo para dar conta de ajustes de altura.
3. Abra o software associado (Figura Suplementar 1A).
4. Clique no ícone Captura de vídeo (filme com um triângulo de ponta direita no meio) para abrir uma nova janela de captura de vídeo . A câmera estará no Live View, mas o display será preto (Figura Suplementar 1B).
5. Pressione para baixo o botão dimmer e gire-o no sentido horário para ajustar a luz.
   NOTA: O botão dimmer está no estágio do sistema de imagem perto da fonte de luz de campo brilhante. A exibição de exibição ao vivo do Video Capture passará de preto para iluminado.
6. De volta à janela Captura de vídeo , clique na guia Configurações , ajuste da seguinte forma: Modo de vídeo: 2456 x 2052_Mono8, Taxa de quadro: 14, Saída: monocromático, Exposição: 0,00300 s, Ganho: 1 dB , Gamma: 1, Rotate 180 (check on).
7. Volte para a guia Capturar . Selecione a pasta de gravação (Figura Suplementar 1B).
   NOTA: É aqui que todas as gravações e arquivos do projeto serão armazenados. Crie pastas exclusivas para experimentos individuais para manter os dados organizados.
8. Atribua um nome de arquivo inserindo-o na caixa de texto prefixo do Arquivo .
   NOTA: O software anexará automaticamente um número progressivo ao final do prefixo no formato "0001". É aconselhável ter um esquema de nomeação consistente para os arquivos como: "YYYYMMDD_treatmentName_rep#_".
9. Defina outras configurações de captura da seguinte forma: Buffer: 128 quadros (padrão), Duração (check on): 00 h:01min:00 s. Ignore ou desligue outras configurações nesta guia.
10. Coloque a placa de ensaio, tampa para cima, no estágio do dispositivo e centralize-a na tela de captura de vídeo ; remover a tampa.
    NOTA: Prepare as placas de ensaio com antecedência. Cada placa consiste em uma placa de Petri de 35 mm aproximadamente meio cheia de NGM não semeado (sem grama bacteriana).
11. Use uma micropipette para lavar o palco ^{sincronizado11} worms em 1 mL de M9 na placa de ensaio - aponte para cerca de 50 vermes (Figura 3D). Gire suavemente a placa para levar os animais ao centro ou use uma micropipette para adicionar algumas gotas de M9 para separar animais (Figura 3E). Defina um temporizador para 60 s para permitir que os vermes se aclimatem à natação.
    NOTA: A placa não estará 100% visível na tela. Os animais não são rastreados com precisão enquanto se sobrepõem.
12. Enquanto o temporizador conta para baixo, ajuste manualmente o foco da câmera girando o anel de foco no corpo da lente da câmera enquanto assiste ao display (Figura 3F). É possível ampliar os worms usando um mouse de roda de rolagem permitindo um foco mais preciso.
13. Depois de definir o foco, ajuste o botão de luz de modo que o display seja o mais brilhante possível sem superexposição (aparece como pixels vermelhos no display).
14. Depois dos 60, pressione o botão Gravar .
    NOTA: O vídeo irá do Live View para a Gravação e um temporizador será visível. Quando a captura estiver concluída, a tela captura de vídeo retornará à Live View (Figura Suplementar 1B).
15. Retire a placa após a gravação e configure a próxima placa. Renomeie o prefixo conforme necessário. Lave os vermes na placa de ensaio, incubar por 60 s e registe cada tratamento.
16. Depois de concluir todas as gravações para um experimento, feche quaisquer guias de vídeo abertas e desligue a fonte de luz deprimindo o botão dimmer.
17. Feche a janela Captura de vídeo clicando no botão x vermelho no canto superior direito da janela; alternativamente, fechar todo o pacote de software e reabrir.
18. Prepare vídeos para rastreamento.
19. No menu barra lateral do Fluxo de trabalho , selecione o primeiro botão neste menu, Importe a Sequência de Imagem e encontre e clique duas vezes em um vídeo. O vídeo será aberto na janela do meio (Figura Suplementar 2A).
    NOTA: O display padrão do software é o menu barra lateral do fluxo de trabalho; este menu também pode ser acessado através do menu suspenso de vista em Exibir [Exibir | Fluxo de trabalho]. O menu Workflow tem várias opções de exibição; a exibição de faixa é apropriada neste ponto do protocolo. Se o botão Definir informações de sequência não estiver visível no menu, então esta não será a exibição correta. Primeiro, olhe para a parte inferior do Menu e verifique se a guia Fluxo de trabalho está ativa, próxima verificação de que a exibição 'Faixa ' está ativa clicando no ícone 'Acompanhar '. Onde os menus aparecem na janela depende do tamanho do monitor e da localização de outros menus abertos. Os menus podem ser movidos por arrastar e soltar, redimensionados e fechados. A maioria dos menus também pode ser aberta através do menu View dropdown.
20. No menu Fluxo de trabalho, selecione Definir informações de sequência (Figura Complementar 2B). Na nova janela do menu, verifique o esquema de nomeação, adicione notas e valide metadados.
21. Verifique se o dimensionamento está definido corretamente; Escala: 11,43 μm/pixel e Measure será preenchido automaticamente como 1000 μm é de 87 pixels. Se a altura da câmera tiver sido ajustada de forma diferente do prescrito aqui, siga as instruções neste menu para atualizar a escala. Clique no botão Salvar .
22. No menu Workflow, selecione Ajustar imagem e um novo menu pop-up chamado Ajustes de Imagem será aberto (Figura Suplementar 2C). Selecione Worms escuros em fundo claro (campo brilhante).
23. Ajuste as configurações adicionais. As Configurações recomendadas de processamento de imagem são as seguintes : Alisamento de fundo: 10, suavização gaussiana: 5, Preencher orifícios: 2, Filtro de objeto pequeno: 0 e pular Segmentação derivativa integral.
24. Ajuste o nível limiar de modo que os animais estejam completamente cheios de verde, mas ainda distintos do fundo. Clique em Aplicar.
    NOTA: É permitido pegar alguns objetos que não são vermes.
25. No menu Workflow , selecione Detectar e Rastrear (Figura Suplementar 2D).
    NOTA: Um menu aparecerá na lateral do vídeo com 3 guias: Detectando, Rastreando e Reparando. O cursor vai parecer um dedo apontando quando sobre a exibição de vídeo. Alternativamente, clique no ícone Selecionar (seta cursor) no menu de ícone no canto superior esquerdo do software.
    1. Use a ferramenta seletor de dedos para selecionar 3-7 worms e clique no botão Detectar worms na guia Detecção .
       NOTA: Esta seleção ajuda o software a identificar com precisão os worms para determinadas condições e deve ser feita para cada vídeo. Após alguns segundos, a maioria dos vermes será destacada em verde e terá um número em amarelo. Vermes que estão tocando ou enrolados provavelmente não serão destacados; no entanto, o programa provavelmente irá encontrá-los durante o rastreamento. Há uma opção para ajustar os parâmetros de detecção; no entanto, os padrões funcionam bem na maioria das condições. Se forem feitos ajustes nos parâmetros de detecção, certifique-se de ser consistente entre amostras e réplicas.
26. Ainda na janela Detectar e Rastrear , mova-se para a guia Rastreamento (Figura Suplementar 2E). Na verificação Parâmetros de rastreamento Use backtracking, desmarque worms na borda da imagem.
27. Definir a hipótese de max rastreado para 5. Defina o modo de rastreamento para natação.
    NOTA: A configuração de hipóteses rastreadas pelo Max ajusta quantas faixas potenciais de worm um único worm rastreado pode ter e dá ao programa alguma margem de manobra na precisão de rastrear um único worm sem perder o controle dele. 5 é um bom cenário para nadar.
28. Mova-se para a seção Configurações Avançadas e defina o seguinte: Os worms de quadros podem tocar o limite: 50, os worms frames podem se sobrepor: 500, Tolerância à posição: 0,50, Tolerância de forma: 0,50. Salve essas configurações e implante-as para todos os vídeos em um experimento (e além) salvando-as como uma configuração.
    NOTA: A filtragem da faixa não é recomendada e pode ser facilmente feita após o processamento, deixe de fora.
29. Navegue até o gerenciador de configuração (ícone de engrenagem) no menu de ícone superior esquerdo. Quando clicado, o menu barra lateral do Gerenciador de configuração será aberto. Em seguida, clique no ícone Salvar (engrenagem +), dar a esta configuração um nome e descrição e clique no botão OK .
    1. Para acessar essa configuração no futuro, abra o menu Configuração , selecione a configuração desejada e clique no ícone Carregar (seta de engrenagem). Em seguida, adicione informações de sequência, possivelmente ajuste o nível de limiar e selecione worms para detecção. Todas as outras configurações serão as mesmas.
30. No menu Workflow , clique em Salvar projeto, verifique o local de salvar e adicione um nome de arquivo de projeto (combinar o nome do arquivo do projeto com o nome do vídeo ajuda na continuidade). Feche o vídeo.
    NOTA: Esses projetos são salvos com o tipo de arquivo .wpr.
31. Repita para todos os vídeos: Import Image Sequence (2.18), Load saved configuration (2.28.1), adjuste o limiar (2.23), definir informações de sequência (2.19), detectar worms (2.24.1), salvar o projeto (2.29), fechar vídeo.
32. Acompanhe vídeos
    1. Para rastrear os arquivos do projeto, acesse o menu Workflow e clique no ícone Batch (pasta contendo páginas de worm) (Figura Suplementar 2F).
       NOTA: O painel de processamento de lotes será exibido (Figura Suplementar 2G). Às vezes está oculto, mas pode ser acessado na parte inferior do menu Batch Workflow ; a janela pode precisar ser expandida para vê-la.
    2. Clique no botão Adicionar na seção Seleção de arquivos deste menu Processamento de lote . Navegue e selecione todos os arquivos de projeto (.wpr) a serem processados, clique em Abrir.
       NOTA: O menu processamento de lotes será preenchido com o caminho do arquivo selecionado, um indicador de status e uma barra de progresso cinza para cada arquivo.
    3. Clique no Ícone iniciar (reproduzir botão). Observe o indicador de progresso verde no primeiro arquivo. Permita que todos os arquivos sejam processados. Quando todos os arquivos lidos como terminados (verde), o software pode ser fechado (Figura Suplementar 2G).
    4. Se um arquivo de projeto ficar preso, considere executar o arquivo suspenso por si só, isso geralmente corrige o problema. Se isso não corrigir o problema, abra o arquivo do projeto, exclua os worms selecionados (Detecte e Rastreie o menu) e resesse a partir de um novo conjunto de treinamento. Em seguida, reprocesse o arquivo do projeto.
33. Reparando faixas (recomendado)
    NOTA: A reparação de faixas pode aumentar a precisão das faixas. Correções comuns estão combinando faixas que claramente pertencem ao mesmo worm visto pelo olho humano como, excluindo faixas que não são precisas ou não capturam dados reais de worm, e dividindo faixas que são deturpadas porque os vermes estão tocando (remova a seção ruim e combine faixas de antes e depois da seção ruim se for prático).
    1. Abra o software e abra um arquivo de projeto [Arquivo | Projeto Aberto] de interesse. Clique em Abrir e clique em sim para usar este arquivo. Aguarde a carga do filtro temporal. O vídeo processado estará na tela; vermes serão destacados em verde e delineados em amarelo. Use o reprodutor de vídeo para esfregar ou reproduzir o vídeo.
    2. No menu Workflow , selecione Detectar e Rastrear (Figura Suplementar 2D). Mude para a guia Reparar . Ative o cursor seletor clicando no ícone da ferramenta Seletor (seta do cursor). Esfregue através do vídeo, encontrando e selecionando uma faixa de worm e, em seguida, use o menu de reparo para criar a alteração desejada.
       NOTA: Para corrigir estrategicamente a maioria dos problemas rapidamente, amplie de tal forma que cerca de 1/6 ^da placa seja visível, comece com a área ao redor da faixa #1. Esfregue rapidamente através do vídeo verificando se há worms que misteriosamente aparecem do nada, rastreia onde os números mudam, ou vermes colidindo entre si, editando à medida que surgem problemas. Siga os vermes em ordem numérica desde a posição inicial. Esfregue para frente e para trás para seguir cada verme conforme necessário até que toda a placa seja reparada. Preste atenção às bordas da placa; muitas vezes, vermes falsos aparecem nas sombras das bordas das placas.
34. Análise de dados
    1. No menu Fluxo de trabalho , selecione Analisar dados (Figura Complementar 3A).
       NOTA: Uma nova janela chamada Análise e Plotagem de Dados aparecerá (Figura Suplementar 3B). Esta janela tem muitas maneiras de avaliar e visualizar os dados de movimento da população de vermes de um arquivo de projeto específico. A maioria dessas análises permite a seleção de worms específicos, múltiplos ou todos de um determinado vídeo, permitindo que as informações de faixa sejam plotadas de diferentes maneiras.
    2. Para analisar a contagem de curvas, navegue até o Resumo da Faixa [Posição & Velocidade | Resumo da faixa] (Figura Suplementar 3C). Use o botão Exportar no canto inferior direito para exportar dados em um formato legível de planilha (.csv), escolha um caminho para o local desejado da planilha, inclusive renomeando-os para algo memorável. As configurações padrão são uma boa escolha (Figura Suplementar 3D).
    3. Cole esses dados, bem como quaisquer outros conjuntos de dados de projetos relevantes em uma pasta de trabalho de planilha consolidada (Figura Complementar 3E).
    4. Use a Contagem de turnos e a duração da faixa para calcular as voltas por minuto para cada faixa usando funções de planilha (=voltas/duração da faixa * 60) ou use uma métrica diferente conforme desejado (Figura Suplementar 3F).
       NOTA: As voltas por minuto capturam informações muito semelhantes como um ensaio manual de desarmes que é uma métrica amplamente utilizada de atividade em líquido, mas há muitas opções, e é bem possível que uma métrica diferente possa identificar outros dados interessantes para um determinado tratamento ou comparação.
    5. Se desejar, rastreie o tamanho do worm, a duração da faixa e/ou algumas outras métricas escolhidas usando ferramentas de formatação condicional para destacar as faixas para remoção se estiverem potencialmente confundindo. Manter o processamento consistente de dados entre tratamentos e réplicas.
    6. Analise os dados utilizando análises estatísticas apropriadas, como o teste t do Student para 2 cepas, ou ANOVA de 1 via para 3 ou mais cepas. Realizar réplicas experimentais independentes em diferentes dias e com populações independentes de vermes para pelo menos 3 réplicas experimentais independentes.

Resultados

Tanto os ensaios de locomoção radial quanto de natação oferecem detecção sensível de comprometimento da motilidade (Figura 4 e Figura 5). Para investigar os mecanismos subjacentes ao TDP-43 patológico na ALS, foram desenvolvidos modelos C. elegans que expressam tdp-43 pan-neuronalmente. Esses animais apresentam características moleculares e celulares que lembram a ELA, incluindo disfunção ^motora9. É importante ressaltar que apresentam comprometimento moderado da motilidade com a expressão do TDP-43 humano do tipo selvagem e comprometimento mais grave da motilidade em animais que expressam tdp-43 mutante da ALS usando tanto a locomoção radial quanto os ensaios de natação. Alguns animais mutantes ou transgênicos terão maior prejuízo em engatinhar do que nadar, ou vice-versa. Usando dois ensaios de motilidade diferentes, uma imagem mais clara das diferenças fenotípicas entre as cepas é obtida.

Locomoção radial
Quando colocados em um prato de ágar semeado, C. elegans exploram seus arredores, inclusive buscando os limites de sua fonte de alimento. Ensaios de locomoção radial são uma maneira de tirar proveito desse comportamento como uma métrica para o condicionamento físico. Ao analisar o comportamento locomotor (rastejando em uma superfície sólida) de forma controlada e quantificável, o ensaio locomotor radial oferece uma ferramenta simples e eficaz para avaliar a gravidade dos déficits motores e outros fenótipos relacionados ao motor. Ensaios de locomoção radial capturam diferenças na motilidade em vermes modelos de ELA moderadamente ou severamente prejudicados e oferecem uma linha de base para comparar a modulação de fenótipos de motilidade ou mudanças na motilidade com a idade (Figura 6). Esta estratégia pode ser aplicada para quantificar o comportamento rastejante de qualquer cepa que tenha alterado o movimento do tipo selvagem (N2) ou worms de controle. No entanto, este método pode não ser uma boa escolha para avaliar animais incapazes de rastejar normalmente, como mutantes de rolo ou animais que estão paralisados. Normalmente, os vermes do tipo selvagem apresentarão um deslocamento médio entre 200-300 μm/min quando levantados e testados a 20 °C. Os dados de exemplo apresentados na Figura 4 mostram resultados esperados comparando N2, duas cepas transgênicas diferentes expressando TDP-43 humano tipo selvagem com um fenótipo leve [TDP-43(WT-leve), CK402 (bkIs402[Psnb-1::TDP-43; Pmyo-3::GFP]] ou fenótipo mais forte [TDP-43(WT-moderado), CK410 (bkIs402[Psnb-1::TDP-43; Pmyo-2::GFP]], uma cepa transgênica expressando o mutante humano TDP-43 com um fenótipo grave [TDP-43(M337V), CK423 (bkIs423[Psnb-1::TDP-43; Pmyo-2::GFP]), e uma cepa transgênica expressando outra proteína associada à doença neurodegenerativa, tau humano de tipo selvagem [tau(WT), CK144 (bkIs144[Paex-3::tau(4R1N); Pmyo-2::GFP]]. As duas cepas que expressam tdp-43 de tipo selvagem têm diferentes graus de comprometimento detectados pela locomoção radial. O TDP-43 (WT-low) não é significativamente diferente do N2, enquanto o TDP-43 (WT-high) apresenta diferenças claras na motilidade. As cepas TDP-43(M337V) e Tau (WT) têm prejuízos mais graves na motilidade.

Ensaio de natação
C. elegans se envolvem em movimento estereotipado de natação (surra) quando imersos em líquido. Imediatamente após a submersão, os vermes começam a dobrar caracteristicamente cabeça e cauda em direção um ao outro com um ângulo de dobra de aproximadamente 45°, com o vértice angular sendo o ponto médio do verme. Vermes alternam dobras nas direções ventral e dorsal. Um thrash, medido pelo software, representa o movimento de ir da linha reta para um ângulo de dobra corporal de 20° ou mais, independentemente da direcionalidade (limiar de ângulo pode ser ajustado após o processamento dentro da janela Análise e Plotagem [Fluxo de trabalho | Analisar | de dados | de forma corporal | de ângulo de dobra | de Ponto Médio Limiar de amplitude: # graus]. O ensaio de natação descrito aqui usa rastreamento e análise automatizados baseados em computador para fornecer pontuação imparcial da atividade de natação. Espera-se que os vermes do tipo selvagem (N2) sejam em média entre 150-200 thrashes por minuto quando levantados e registrados a 20 °C. Os dados de exemplo apresentados na Figura 5, mostram resultados esperados comparando N2, duas cepas transgênicas diferentes expressando TDP-43 humano tipo selvagem com um fenótipo leve [TDP-43(WT-leve), CK402 (bkIs402[Psnb-1::TDP-43; Pmyo-3::GFP]] ou fenótipo mais forte [TDP-43(WT-moderado), CK410 (bkIs402[Psnb-1::TDP-43; Pmyo-2::GFP]], e uma cepa transgênica expressando outra proteína associada à doença neurodegenerativa, tau humano de tipo selvagem [tau(TN), CK144 (bkIs144[Paex-3::tau(4R1N); Pmyo-2::GFP]]. A cepa transgênica que expressa o TDP-43 [TDP-43(M337V)] não se despresa em líquido, e por isso é denotada no gráfico como ND (sem dados). Este ensaio pode discriminar fenótipos diferentes do ensaio de locomoção radial mostrado na Figura 4. Por exemplo, no ensaio de locomoção radial (Figura 4), o TDP-43(WT-low) não foi significativamente diferente do N2. No entanto, no ensaio de natação (Figura 5), tanto o TDP-43 (WT-low) quanto o TDP-43(WT-high) são significativamente diferentes do N2, bem como significativamente diferentes um do outro. Além disso, apesar de tanto o TDP-43(M337V) quanto o tau(WT) terem graves prejuízos de rastreamento por locomoção radial (Figura 4), apenas tau(WT) é capaz de bater o suficiente para ser rastreado pelo software (Figura 5). Os animais TDP-43(M337V) são incapazes de bater, e a análise baseada em software não detecta ou rastreia esses worms com precisão. Assim, os dados sobre esses worms não foram coletados (ND, sem dados).

Figura 1: Fluxo de trabalho de ensaio de locomoção radial. Os painéis A-E mostram os passos generalizados do ensaio de locomoção radial. Os passos são os seguintes: (A) As placas NGM, com op50 semeadas para as bordas, são preparadas por rotulagem e marcação ponto central, (B) vermes são colocados no centro do ágar como marcado pelo ponto central, (C) vermes são autorizados a se mover livremente por uma quantidade definida de tempo, placa (D) é virada para baixo para cima e a localização final de cada verme é marcada em uma cor diferente do ponto central, (E) A distância do ponto central para cada local final do worm medido manualmente ou digitalmente. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 2: Medição digital do local final usando ImageJ.  A distância das medidas do centro pode ser medida manualmente ou digitalmente, para medir digitalmente usando o lado traseiro do imagej (A) da placa com uma régua no quadro. (B) Desenhe um comprimento conhecido usando a ferramenta de linha. (C) Use o comprimento conhecido desenhado em (B) para definir a escala [Analisar | Definir escala...]. (D) Use a ferramenta de linha para desenhar uma linha do ponto central até uma marca de localização final, repita para cada marca. (E) Uma linha de pincel marcando a primeira marca medida auxilia na pontuação (linha preta squiggly perto da marca 1). As marcas finais de localização são numeradas em amarelo para ilustrar a direcionalidade da pontuação. (F) As medições são registradas na janela Resultados. Guarde resultados em outro lugar para análise estatística. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 3: Ajustes materiais e de hardware para o uso do software. (A) Materiais utilizados para o ensaio de natação assistido por software. (B) Configuração geral do software e materiais necessários, observe que a carcaça está na posição elevada. (C) A altura do suporte de montagem da lente pode ser ajustada. Esta imagem mostra a faixa ajustável e um indicador de fita marcando a altura preferida para a realização de ensaios de natação. É necessário ajustar a luz de campo brilhante e o foco da câmera antes da gravação. (D) Uma placa de ensaio de 35 mm é colocada no palco, animais em M9 são adicionados à placa, e um temporizador de 1 min é iniciado. (E) Às vezes é vantajoso girar suavemente a placa para mover vermes mais perto do centro - observar a localização na tela de captura ao vivo; alternativamente, algumas gotas de M9 de um pipettor podem ser usadas para separar worms. (F) Ajuste o anel de foco na lente da câmera, observe vermes na tela para determinar o foco ideal. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 4: Ensaios de locomoção radial detectam diferenças na velocidade de rastreamento. A dispersão não estimulada das larvas L4 encenadas em desenvolvimento foi medida utilizando o ensaio de locomoção radial descrito acima e grafado como μm/min percorrido (A-B). Os mesmos dados plotados em (A) e (B) demonstram duas apresentações gráficas possíveis diferentes. Em (A), os dados são exibidos como um gráfico de barras, tornando mais claras as diferenças relativas entre as cepas. Em (B), o deslocamento final de cada verme é traçado dentro do gráfico, permitindo que a variação dentro da população seja melhor visualizada. Para avaliar a significância entre as cepas testadas, utilizou-se a análise unidirecional de variância (ANOVA) com o teste de comparação múltipla de Tukey. **p=0,0022, ****p<0,0001, ns=não significativo. TDP-43(M337V) e tau(WT) também são significativamente diferentes de N2, p<0,0001. As barras de erro em (A) são erros padrão da média (SEM) e em (B) são desvio padrão. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 5: Ensaios de natação detectam diferenças de surra no líquido. As taxas de natação (frequência de desolação ou undulação em líquido) foram medidas utilizando-se pontuação e análise assistida por computador imparcial descritas acima e grafadas como thrashes/min (A-B). Mesmos dados plotados em (A) e (B). Em (A), os dados são gráficos como um gráfico de barras, o que torna mais fáceis de ver diferenças relativas entre as cepas. Em (B), os dados de cada verme individual pontuado são traçados dentro do gráfico, permitindo que a variação dentro da população seja melhor visualizada. Para avaliar a significância entre as cepas testadas, utilizou-se uma análise unidirecional de variância (ANOVA) com o teste de comparação múltipla de Tukey. p<0,0001, ns=não significativo. As barras TDP-43(WT-moderada) e tau(WT) também são significativamente diferentes de N2, p<0.0001.As barras de erro em (A) são erro padrão da média (SEM) e em (B) são desvio padrão. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 6: Vermes mutantes TDP-43 viajam menos que vermes selvagens. Placas que mostram uma diferença representativa na localização final do L4 N2 encenado (tipo selvagem) e TDP-43(M337V) (CK423 (bkIs423[Psnb-1::TDP-43; Pmyo-2::GFP]), uma cepa que expressa tdp-43 humano mutante com função motora severamente prejudicada após 1 hora de rastreamento não estimulado à temperatura ambiente. As placas são marcadas com um ponto vermelho para o ponto central e pontos azuis para a localização final dos animais. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura suplementar 1: Registrando o comportamento de natação usando o software de imagem e rastreamento. (A) O fluxo de trabalho de rastreamento e a localização do ícone de captura de vídeo. (B) A janela Captura de vídeo é mostrada no Live View e os aspectos mais importantes são destacados. As palavras verdes "Live view" mudarão para uma "Gravação" vermelha quando o botão de gravação for ativado. Clique aqui para baixar este Arquivo.

Figura suplementar 2: Preparação e acompanhamento do comportamento da natação. Esta figura mostra uma série de capturas de tela para ajudar na configuração de uma sequência de imagens de vídeo para rastreamento. O protocolo geral para a preparação de uma sequência de vídeo é abrir cada menu de fluxo de trabalho nesta ordem: Importe a Sequência de Imagens | Definir informações de sequência | Ajuste a | de imagem Detectar e rastrear | Salve o Projeto. A janela Analisar dados só pode ser usada depois que um arquivo de projeto for rastreado. (A) mostra um arquivo .avi (vídeo) aberto depois de importar a sequência para o software de dentro do fluxo de trabalho Track. (B) A janela Definir informações de sequência fornece um local para notas, definir/alterar a escala e verificar os metadados para uma sequência de vídeo. Instruções para alterar a escala são encontradas nesta janela e devem ser seguidas quando a câmera é abaixada ou levantada (B). A imagem (C) mostra as configurações da janela Ajustar imagem . (D) Captura de tela mostrando a guia de detecção da janela Detectar e Rastrear . A detecção de worms é usada para treinar o software e deve ser definida para cada sequência de vídeo. Parâmetros de detecção adicionais podem ser definidos aqui, se desejar. (E) Captura de tela da guia Rastreamento da janela Detectar e Rastrear com as configurações recomendadas para rastrear o comportamento de natação. Este é o último passo na configuração de uma sequência de vídeo. Salve a sequência como um projeto usando a janela Salvar projeto . Repita estes passos para cada sequência de vídeo. As configurações podem ser salvas como uma configuração para reduzir a carga de trabalho e garantir que todas as sequências sejam tratadas da mesma forma (não mostradas). Para rastrear arquivos de projeto para análise, navegue até o fluxo de trabalho em lote . (F) mostra o ícone usado para navegar até o fluxo de trabalho do batch e (G) mostra a janela de processamento em lote, destaca os botões de adicionar e iniciar e mostra a aparência esperada de um arquivo de projeto que foi rastreado. Clique aqui para baixar este Arquivo.

Figura suplementar 3: Análise do comportamento da natação. Depois que um arquivo de projeto foi rastreado, ele pode ser aberto usando [Arquivo | Projeto Aberto]. Os vermes aparecerão em verde como mostrado em (A). Esfregando através do vídeo oferece uma verificação rápida de que o vídeo processado como esperado, o destaque verde desaparecerá durante a esfregação. A janela Análise e Plotagem de dados é aberta a partir do item Analisar dados do fluxo de trabalho. (B) mostra a janela Análise de dados e Plotagem com a visualização de posição aberta (padrão), todas as faixas são destacadas. Abaixo os datapoints está um gráfico mostrando a faixa registrada para cada worm destacado. A análise de resumo da faixa é usada para curvas calculadas por minuto. (C-D) mostrar o relatório de resumo da faixa e os detalhes da exportação. (E-F) mostrar o resumo da faixa em uma planilha e como calcular curvas por minuto, a saída medida neste ensaio. Clique aqui para baixar este Arquivo.

Discussão

Locomoção radial:
A resolução deste ensaio é facilmente controlada alterando a variável tempo. O aumento do tempo torna mais fácil observar diferenças entre animais com fenótipos graves, identificando diferenças sutis. No entanto, como este ensaio mede o deslocamento, se o tempo de ensaio for estendido por muito tempo, animais com motilidade normal, como o N2, viajarão para as bordas da placa, e o comportamento de forrageamento levará ao retrocesso. Isso diminuirá artificialmente a medição da distância percorrida. Períodos de tempo muito longos podem resultar no desaparecimento de diferenças entre as cepas, particularmente entre animais com fenótipos motores menos graves, à medida que os animais se dispersam uniformemente pela placa. Encurtar a variável de tempo impedirá que vermes mais ativos encontrem as bordas da placa. Este método não rastreia a distância total percorrida para cada verme, mas comprime a distância percorrida para cada verme a uma distância linear do centro da placa. Como tal, é inerentemente menos robusto do que um método que registra o comprimento total da faixa de vermes individuais. No entanto, o ensaio de locomoção radial requer muito pouco treinamento de pesquisadores, usa reagentes relativamente acessíveis que são comumente disponíveis na maioria dos laboratórios de vermes, e é sensível o suficiente para produzir resultados significativos e reprodutíveis. Para laboratórios que preferem rastreamento automatizado de vídeo, vários métodos foram previamente estabelecidos para rastrear e analisar movimentos de ^{rastreamento12}, ou os parâmetros de software usados para o ensaio de natação neste artigo podem ser alterados para permitir a detecção e análise de rastreamento.

Este experimento é geralmente feito em réplicas independentes triplicadas, com um conjunto de 30-40 worms por réplica. Cada réplica é dividida em duas placas diferentes de 100 mm ou 150 mm, com 15-20 vermes por placa. Usar mais worms do que o recomendado por placa pode dificultar a pontuação eficiente. Um número total de 90+ é suficientemente alimentado para estabelecer significância para prejuízo leve, moderado ou grave de motilidade. Ser consistente com o tempo entre as cepas pontuadas é essencial para a precisão e a reprodutibilidade. 30 minutos é geralmente tempo suficiente para estabelecer diferenças entre fenótipos moderados a graves, como cepas transgênicas expressando tdp-43 mutantes humanos em comparação com vermes do tipo selvagem (Figura 4). Se a variável de tempo for estendida, é aconselhável também aumentar o tamanho da placa de 100 mm para 150 mm. Fatores ambientais como temperatura e umidade podem afetar este ensaio, que normalmente é conduzido à temperatura ambiente, por isso é importante sempre usar um controle do tipo selvagem (N2) ao comparar entre as réplicas. Além disso, este ensaio pode medir a motilidade de algumas cepas que não apresentam comportamento normal de natação em líquido (surra), tornando-se um complemento útil para o ensaio de natação.

Ensaio de natação:
O uso do sistema de imagem e aquisição para automatizar o rastreamento e a análise da natação de vermes permite dados rigorosos e imparciales. No entanto, existem vários fatores durante a configuração inicial do experimento que precisam ser controlados entre as amostras. Estes incluem o tempo para se aclimatar ao líquido antes de começar a gravar, condições ambientais (ou seja, temperatura, umidade) e configurações consistentes de luz e gravação. No palco de gravação, existem vários recursos que ajudam a reduzir a variabilidade entre as placas. Estes incluem uma câmera integrada montada na faixa e um estágio de campo brilhante que torna a gravação de vídeo consistente entre as placas, blindagem ao redor do palco que impede reflexos, brilho e movimentos de ar durante a gravação, e um pacote de software robusto que detecta de forma confiável worms e permite a correção manual de faixas no pós-processamento de vídeo. Neste protocolo, vídeos de uma placa de 35 mm com worms são gravados por 1 minuto e, em seguida, processados usando o pacote de software. Após o processamento, a correção manual das faixas garante que os comportamentos dos worms sejam registrados com precisão sem confundir erros de rastreamento. A contagem de turnos e os dados de duração da faixa são usados para determinar voltas por minuto como uma leitura final. Para garantir a reprodutibilidade, os dados são coletados ao longo de um mínimo de 3 experimentos independentes de replicação, cada um com 40-50 animais pontuados, para alcançar um número final combinado de animais 120-150. Este número é suficiente para discriminar pequenas diferenças no comportamento de natação dos vermes de controle. Alguns vermes têm déficits motores muito severos para serem capturados por ensaios de natação. Por exemplo, se os animais colocados em um cacho médio líquido em vez de realizar a resposta de surra esperada, este ensaio não registrará esses movimentos com precisão e outro ensaio de movimento, como a locomoção radial, poderá capturar melhor esses defeitos de motilidade. O protocolo fornecido usa um sistema de imagem comercialmente disponível (ver Tabela de Materiais para obter mais detalhes), mas outros sistemas de rastreamento de worms podem fornecer um utilitário semelhante, sendo alguns de código ^aberto12. Métodos publicados anteriormente descrevem pontuação manual de worm ^thrashing13. Embora a análise automatizada produza uma série de métricas para cada verme individual, a detecção de dobras corporais que é medida em thrashes por minuto, fornece resultados consistentes entre experimentos e trilhas bem com pontuação convencional de vermes por olho.

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
C. elegans	Caenorhabditis Genetics Center (CGC)	-	Adquira suas cepas conforme desejado, N2 é uma cepa de controle útil
Pipetas pasteur descartáveis, vidro borossilicato	VWR	14673-010	Pipeta de vidro usada para criar picareta de minhoca - segure a pipeta de vidro em uma mão e ~1" de fio de platina (segurado por um alicate) na outra sobre uma chama para unir.
Placas de Petri descartáveis, 35x10mm	VWR	10799-192	Placas de ensaio para WormLab Imaging System
Placas de Petri descartáveis, 60x15mm	VWR	25384-090	Placas de estoque para minhocas
Placas de Petri descartáveis, 100x15mm	VWR	25384-302	Placa de ensaio de locomoção radial padrão
Placas de Petri descartáveis, 150x15mm	VWR	25384-326	Período de tempo radial mais longo placa de ensaio de locomoção
Microscópio de dissecação	Leica	M80	Escopo para manutenção de vermes e configuração de ensaios de locomoção radial
Marcadores de ponta fina	VWR	52877-810	Precisa de pelo menos 2 cores para ensaios de locomoção radial. Pontas finas necessárias para precisão.
Scanner de mesa	Amazon	Epson Perfection V850	Opcional para ensaio de locomoção radial. O protocolo pressupõe uma resolução de 300 dpi, a maioria dos scanners funcionaria bem
ImageJ		NIH-Software	livre opcional fornecido pelo NIH -
https://imagej.nih.gov/ij/ M9 buffer	VWR	IC113037012	Medium usado para ensaio de natação. Pode ser feito do zero, consulte WormBook: Manutenção de C. elegans
NGM (Meio de Crescimento de Nematóides)	VWR	76347-412	Meio usado para cultivar C. elegans. Pode ser feito do zero, veja WormBook: Manutenção de bactérias C. elegans
OP50	Caenorhabditis Genetics Center (CGC)	OP50	Fonte primária de alimento para C. elegans
p1000 pipetador	VWR	76207-552	Pipettor, usado em ensaio de natação
p1000 pontas	VWR	83007-384	Pontas para pipetador, usado em ensaio de natação
Fio de platina, diâmetro de 0,2032mm	VWR	BT136585-5M Fio de	platina de calibre fino usado para criar picareta de minhoca - segure a pipeta de vidro em uma mão e ~1" de fio de platina (segurado por um alicate) na outra sobre uma chama para unir.
Régua	VWR	56510-001	Necessidade de pontuar ensaios de locomoção radial
Sistema de imagem WormLab	MBF Bioscience	WormLab	O sistema de imagem inclui hardware WormLab (platina de campo brilhante, câmara e caixa) e software WormLab. https://www.mbfbioscience.com/wormlab-imaging-system