Artigo de método

In vivo Função de subconjuntos diferenciais de células dendríticas cutâneas para induzir imunidade Th17 na infecção intradérmica por Candida albicans

DOI:

10.3791/62731

⸱

20 de julho de 2021

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Dermatology, Severance Hospital, Cutaneous Biology Research Institute, Yonsei University College of Medicine, 2Brain Korea 21 FOUR Project for Medical Science, Yonsei University College of Medicine, 3Institute for Immunology and Immunological Diseases, Yonsei University College of Medicine

Neste artigo

Resumo

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Aqui, demonstramos a função in vivo de subconjuntos de células dendríticas cutâneas na imunidade Th17 da infecção dérmica profunda por Candida albicans .

Resumo

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

A pele é o órgão de barreira mais externo do corpo, que contém vários tipos de células dendríticas (DCs), um grupo de células apresentadoras de antígenos profissionais. Quando a pele encontra patógenos invasores, diferentes DCs cutâneas iniciam uma resposta imune distinta de células T para proteger o corpo. Entre os patógenos invasores, a infecção fúngica impulsiona especificamente uma resposta imune Th17 produtora de interleucina-17 protetora. Um protocolo foi desenvolvido para diferenciar eficientemente as células Th17 da infecção intradérmica por Candida albicans para investigar um subconjunto de DCs cutâneas responsáveis por induzir a imunidade Th17. As análises de citometria de fluxo e expressão gênica revelaram uma indução proeminente da resposta imune Th17 em linfonodos drenantes da pele e pele infectada. Usando cepas de camundongos que esgotam subconjuntos de DC induzidas por toxina diftérica, as DCs dérmicas CD301b + foram responsáveis pela montagem da diferenciação ideal de Th17 neste modelo. Assim, este protocolo fornece um método valioso para estudar in vivo a função de subconjuntos diferenciais de DCs cutâneas para determinar a imunidade Th17 contra infecções fúngicas profundas da pele.

Introdução

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A pele é o órgão de barreira mais externo, que protege o corpo da invasão de patógenos e estímulos externos1. A pele é composta por duas camadas distintas, incluindo a epiderme - um epitélio estratificado de queratinócitos - e a derme subjacente - uma densa rede de colágeno e outros componentes estruturais. Como tecido de barreira epitelial primária, a pele fornece principalmente barreiras físicas e contribui para barreiras imunológicas adicionais, pois contém numerosas células imunes residentes 2,3. Dentre as células imunes cutâneas, as células dendríticas (DCs) são um tipo de células apresentadoras de antígenos profissionais, que captam ativamente autoantígenos e não autoantígenos e migram para os linfonodos regionais (LNs) para iniciar respostas e tolerância de células T específicas do antígeno de acordo com a natureza dos antígenos4.

A pele abriga células apresentadoras de antígenos epidérmicos, ou seja, as células de Langerhans (LCs) e pelo menos dois tipos de DCs, incluindo DCs convencionais dérmicas tipo 1 (cDC1) e DCs convencionais dérmicas tipo 2 (cDC2)5. As LCs epidérmicas são de origem monocítica embrionária e mantêm seu número celular por autoperpetuação em condições homeostáticas6. Em contraste, cDC1 e cDC2 dérmicos são de origem de células-tronco hematopoiéticas e são continuamente reabastecidos por progenitores comprometidos com DC5. As DCs cutâneas são caracterizadas por seus marcadores de superfície, aproximadamente divididos em populações de Langerina+ (incluindo LCs e cDC1) e CD11b+Langerina- (principalmente cDC2). Além disso, este grupo revelou que a população CD11b+Langerina-DC é classificada em dois subconjuntos de acordo com a expressão de CD301b7.

As características funcionais importantes das DCs cutâneas estão centradas em uma divisão do trabalho, determinada principalmente pela natureza intrínseca de cada subconjunto de DCs, localizações in situ das DCs, microambiente tecidual e pistas inflamatórias locais8. Essas características funcionais das DCs cutâneas requerem a investigação do papel de subconjuntos específicos de DCs durante certos tipos de resposta imune da pele. Após a estimulação antigênica por DCs cutâneas nos LNs de drenagem, as células T CD4+ virgens se diferenciam em subconjuntos específicos de células T auxiliares, que produzem um conjunto de citocinas definidas para exercer sua função efetora9. Entre os subgrupos de células T auxiliares CD4+, as células Th17 produtoras de interleucina-17 (IL-17) desempenham um papel crucial nas doenças autoimunes e na imunidade antifúngica10. Nesse sentido, a infecção fúngica cutânea tem sido um modelo robusto para estudar a imunidade Th17 in vivo 11,12,13. Quando as peles descascadas com fita adesiva são expostas epicutaneamente à levedura Candida albicans (C. albicans), as LCs epidérmicas desempenham um papel fundamental na condução da diferenciação Th17 específica do antígeno14.

A imunidade protetora contra a infecção intradérmica por C. albicans requer imunidade inata, como a atividade fibrinolítica de fibroblastos e fagócitos15. No entanto, pouco se sabe sobre o papel das subpopulações cutâneas de DC no estabelecimento da imunidade Th17 na infecção dérmica profunda por C. albicans . Este trabalho descreve um método de infecção cutânea intradérmica de C. albicans, que produz respostas imunes Th17 locais e regionais. A aplicação de cepas de camundongos com depleção de subconjunto de DC induzida por toxina diftérica (DT) revelou que DCs dérmicas CD301b + são cruciais para a imunidade Th17 neste modelo. A abordagem descrita aqui permite o estudo da resposta Th17 à infecção fúngica invasiva dérmica profunda.

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Protocolo

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NOTA: Todos os experimentos com animais foram aprovados pelo Comitê de Cuidados e Uso de Animais da Instituição (IACUC, ID de aprovação: 2019-0056, 2019-0055). Camundongos fêmeas C57BL/6 de tipo selvagem (WT) de sete a 9 semanas de idade, pesando 18-24 g, foram usados para este estudo. Alguns estudos foram realizados usando camundongos fêmeas do receptor da toxina Langerina-difteria (DTR) e CD301b-DTR da mesma idade e peso. Quatro a seis camundongos foram usados em cada grupo para um experimento, e os dados são representativos de três experimentos independentes. Este trabalho foi realizado em condições de Nível de Biossegurança 3, que também poderia ser realizado em condições de Nível de Biossegurança 2 de acordo com as diretrizes institucionais (temperatura ambiente 23 °C ± 3 °C, umidade 50% ± 10%).

1. Preparação de Candida albicans

NOTA: Os experimentos nesta seção foram realizados em um gabinete de segurança biológica.

  1. Streak C. albicans cepa SC5314 em uma placa de ágar levedura-peptona-dextrose-adenina (YPDA) usando uma alça de inoculação e agulha.
  2. Incubar a placa de cabeça para baixo durante 2 dias a 30 °C.
    NOTA: A placa de ágar YPDA com C. albicans pode ser armazenada a 4 °C por até 1 mês.
  3. Isole uma única colônia da placa para inoculação em 10 mL de meio YPDA em um tubo de 50 mL usando uma ponta de pipeta estéril.
  4. Incubar a 30 °C com agitação a 230-250 rpm durante ~17 h.
  5. Colocar a suspensão de levedura numa cubeta e medir a densidade óptica (DO) a 600 nm de 30 em 30 minutos utilizando um espectrofotómetro UV-VIS até que a DO600 atinja 1,5-2,0.
    NOTA: Esta etapa pode levar de 16 a 18 h.
  6. Gire a suspensão de levedura a 1000 × g por 5 min.
  7. Descarte o sobrenadante e ressuspenda as células de levedura em uma quantidade apropriada de solução salina estéril tamponada com fosfato (PBS).
  8. Conte as células de C. albicans usando um hemocitômetro e gire a suspensão a 1000 × g por 5 min.
  9. Descarte o sobrenadante e ressuspenda as células de C. albicans em PBS a uma concentração de 1 × 107 células em 40 μL de PBS por almofada de pé.
  10. Para a preparação de C. albicans mortos pelo calor (HK), mate as células de levedura aquecendo a 65 °C por 60 min usando um misturador de aquecimento após determinar o número de células.

2. Infecção da pata do rato com C. albicans

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Figura 1: Diagrama esquemático do modelo intradérmico de infecção por Candida albicans . (A) As patas traseiras dos camundongos foram injetadas por via intradérmica com 1 × 107 C. albicans. Após 7 dias, as patas dos camundongos foram reexpostas a 1 × 107 HK C. albicans por injeção intradérmica, e a resposta de hipersensibilidade do tipo retardado foi medida 24 h após o desafio do antígeno. A resposta imune local durante a sensibilização de C. albicans foi analisada após 7 dias em LNs que drenam a pele. (B, C) Imagens de almofadas de pé antes da injeção intradérmica de C. albicans. (D, E) Injeção de C. albicans na derme profunda da pata direita. (F, G) Sinais clínicos de vermelhidão e inchaço após injeção da pata direita. (H) Um esboço mostrando as vias linfáticas da almofada do pé para os LNs poplíteos após a injeção de C. albicans . (I) LNs poplíteos expostos localizados atrás do joelho 7 dias após a injeção de C. albicans e (J) sem injeção. Abreviaturas: HK = morto pelo calor; LNs = linfonodos. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

  1. Anestesiar os camundongos com isoflurano em uma câmara de indução até que os camundongos tenham uma frequência respiratória lenta e não apresentem respostas de abstinência aos beliscões dos dedos dos pés ou da cauda.
    NOTA: Durante a anestesia, recomenda-se pomada ocular para evitar olhos secos, especialmente para anestesias com duração superior a 5 min.
  2. Remova a tampa de uma agulha de 31 G e carregue a seringa de insulina de 0,3 mL com o C. albicans preparado da etapa 1.9 após misturar as células.
  3. Remova o camundongo anestesiado da câmara de indução e injete suavemente 40 μL das células de levedura (1 × 107 células) na derme profunda da pata direita para sensibilização a C. albicans .
    NOTA: O volume máximo que pode ser injetado em uma almofada de pé é de 50 μL.
  4. Retire a agulha da seringa lentamente do local da injeção.
  5. Coloque cada camundongo sozinho em uma gaiola até que ele se recupere totalmente da anestesia e, em seguida, devolva-o com segurança à gaiola de casa.
  6. Para desenvolver uma resposta específica do antígeno a C. albicans , desafie a pata direita dos camundongos com a HK C. albicans preparada por injeção intradérmica 7 dias após a sensibilização, conforme descrito anteriormente (1 × 107 células; 40 μL por pata; repita as etapas 2.1-2.5).
  7. Colher LNs drenantes de pele 7 dias após a sensibilização de C. albicans ou tecidos lesionais do coxim 24 h após o desafio do antígeno após a eutanásia em uma câmara de CO2 .

3. Depleção de células dendríticas induzida por toxina diftérica in vivo

NOTA: Neste estudo, os camundongos Langerin-DTR e CD301b-DTR foram tratados com DT 1 dia antes e depois da sensibilização intradérmica a C. albicans.

  1. Preparar uma solução de 10 μg/ml de DT em PBS.
  2. Remova a tampa da agulha de uma seringa de insulina de 1 mL, misture o TD e encha a seringa com o DT.
  3. Contenha adequadamente os ratos em uma posição de cabeça para baixo.
  4. Desinfete o lado ventral dos camundongos com etanol a 70%.
  5. Injete lentamente em cada camundongo 100 μL de 1 μg DT por via intraperitoneal no quadrante inferior esquerdo do abdômen para esgotar subconjuntos específicos de células dendríticas.
    NOTA: Tenha cuidado para não danificar os órgãos durante a injeção.
  6. Aguarde 5 s; Em seguida, remova lentamente a agulha.

4. Reação em cadeia da polimerase quantitativa em tempo real

  1. Coloque o mouse em uma câmara de CO2 até que nenhum movimento respiratório seja observado.
  2. Desinfete o camundongo com etanol a 70% e corte a lesão da pele da pata traseira em pequenos pedaços usando uma pinça e uma tesoura.
  3. Mergulhe completamente os tecidos fatiados no reagente de isolamento de RNA.
  4. Homogeneizar as amostras usando um homogeneizador de tecidos de acordo com as instruções do fabricante (2 ciclos de 3 min a 30 Hz).
    NOTA: Grânulos de aço inoxidável foram usados para lise tecidual neste estudo.
  5. Gire a 10.000 × g por 5 min, 4 °C.
  6. Transferir cuidadosamente o sobrenadante para um novo tubo.
  7. Isole o RNA total da pele lesionada usando um kit de isolamento de RNA total.
  8. Determinar a concentração de RNA com um espectrofotómetro UV-Vis.
  9. Sintetize o cDNA usando um kit de transcrição reversa para reação em cadeia da polimerase quantitativa em tempo real (qPCR).
  10. Realize qPCR em tempo real com o sistema de PCR em tempo real, monitorando a síntese de DNA de fita dupla durante os ciclos de PCR usando corante fluorescente verde.
    NOTA: Neste estudo, os resultados foram normalizados para o nível de hipoxantina-guanina fosforibosiltransferase (Hprt). As sequências de primers estão listadas na Tabela 1, e o protocolo de PCR é o seguinte: desnaturação inicial a 95 ° C por 30 s, amplificação por 42 ciclos (95 ° C por 5 s, 60 ° C por 30 s).

5. Isolamento celular e análise por citometria de fluxo

  1. Após a eutanásia de CO2 , disseque os camundongos usando fórceps e tesouras, expondo e colhendo cuidadosamente os LNs que drenam as patas chamados LNs poplíteos, localizados atrás do joelho.
  2. Preparar suspensões unicelulares a partir dos LNs de drenagem das patas de cada camundongo, filtrando os tecidos através de um filtro de 70 μm após homogeneização usando o êmbolo de uma seringa de 3 mL.
  3. Lave as células com PBS e centrifugue a 500 × g durante 5 min a 4 °C.
  4. Descarte o sobrenadante e lave as células com PBS novamente.
  5. Centrifugar a 500 × g durante 5 min a 4 °C.
  6. Rejeitar o sobrenadante e ressuspender as células em meio RPMI-10 completo contendo 55 μM de β-mercaptoetanol, 50 ng/ml de forbol 12-miristato 13-acetato (PMA) e 500 ng/ml de ionomicina numa placa de 24 poços para estimulação de células T.
  7. Após 1 h, adicione 10 μg/mL de brefeldina A e 1000x monensina à suspensão celular e cultura por mais 5 h.
  8. Colha as células e lave-as com tampão de classificação de células ativadas por fluorescência (FACS).
  9. Centrifugar a 500 × g durante 5 min a 4 °C e rejeitar o sobrenadante.
  10. Manchar as células mortas com um corante corante de coloração de células mortas corrigível e incubar durante 30 min a 4 °C.
  11. Lave as amostras com tampão FACS e centrifugue-as a 500 × g durante 5 min a 4 °C.
  12. Descarte o sobrenadante e cove as células com anticorpos marcadores de superfície conjugados com fluorocromo e bloqueador do receptor Fc por 30 min a 4 ° C.
  13. Lave as amostras com tampão FACS e centrifugue-as a 500 × g durante 5 min a 4 °C.
  14. Rejeitar o sobrenadante e ressuspender as células peletizadas em solução de fixação e permeabilização durante 15-20 min a 4 °C para coloração intracelular.
  15. Lave as amostras com 1x tampão de lavagem e gire-as a 500 × g por 5 min a 4 °C.
  16. Descarte o sobrenadante e faça a coloração intracelular de citocinas por 30 min a 4 ° C.
  17. Lave as amostras com 1x tampão de lavagem e centrifugue a 500 x g durante 5 min a 4 °C.
  18. Ressuspenda as células no volume apropriado (200-300 μL) de tampão FACS.
  19. Analise a expressão de proteínas usando citometria de fluxo.

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Resultados

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Aqui, demonstramos um modelo de infecção intradérmica de C. albicans para estudar o papel da resposta imune Th17 cutânea mediada por DC in vivo. Após uma injeção intradérmica inicial com C. albicans na pata, os LNs de drenagem da pele foram aumentados (Figura 2A). Durante o período de sensibilização, a proporção de células T efetoras CD4+ para CD8+ aumentou notavelmente (Figura 2B,C). Além disso, ...

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Discussão

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Este trabalho descreve um método de infecção intradérmica por C. albicans que permite o estudo do papel das DCs cutâneas na resposta imune Th17 in vivo. Ao aplicar a análise de citometria de fluxo multiparamétrica com cepas de camundongos induzidas por DT, descobrimos que as DCs dérmicas CD301b + são um subconjunto cutâneo crucial de DC para iniciar a imunidade Th17 contra a infecção dérmica profunda por C. albicans . Além disso, os resultados mostra...

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Divulgações

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Os autores não têm conflitos de interesse a declarar.

Agradecimentos

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Esta pesquisa foi apoiada pela bolsa de pesquisa da Faculdade Samjung-Dalim da Faculdade de Medicina da Universidade Yonsei (6-2019-0125), por um Programa de Pesquisa em Ciências Básicas por meio da Fundação Nacional de Pesquisa da República da Coreia financiado pelo Ministério da Educação (2019R1A6A1A03032869) e Ministério da Ciência e Tecnologia da Informação e Comunicação (2018R1A5A2025079, 2019M3A9E8022135 e 2020R1C1C1014513) e pelos Centros de Controle e Prevenção de Doenças da Coreia (KCDC, 2020-ER6714-00).

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Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo
NomeEmpresaNúmero de catálogoComentários
Seringa de insulina de 0,3 mL (31 G)  BD328822
1x  Tampão de perm/lavagemBD554723
seringa de 1 mL (30 G) seringa de insulina  BD328818
24 placas de poçoFalcon353047
tubo cônico de 50 mLFalcon50050
70 μ m filtroFalcon352350
70% etanol
ABI StepOnePlus sistema de PCR em tempo realApplied Biosystems
Câmara de anestesiaHarvard Apparatus
Brefeldin ABDBD
β-MercaptoethanolGibco21985023
Candida albicans cepa SC5314fornecida por Daniel Kaplan na Universidade de Pittsburgh
CD3BioLegend100216Clone 17A2
CD301b-DTR camundongosfornecidos por Akiko Iwasaki na Universidade de Yale
CD4BioLegend100408Clone GK1.5
CD44eBioscience47-0441-80Clone IM7
CD8aBD Biosciences553031Clone 53.6.7
de clicker
de centrífuga
CubetaKartellKA.1938
Solução Cytofix/CytopermBD554722
Toxina diftérica (DT)Solução
Dulbecco (DPBS)WelgeneLB001-02
FACS (classificação de células ativadas por fluorescência) TampãoBloqueador interno
receptor FcBD553142
Soro bovino fetal (FBS)WelgeneS101-07
FórcepsRobozpara colheita de amostra
HemocitômetroFisher Scientific267110
Kit de RNA total Hybrid-RGeneAll Biotechnology305-101
hidroxietil piperazina ácido etano sulfônico (HEPES)Gibco15630-080
IL-17A (citocina intracelular)BioLegend506912Clone TC11-18H10.1
IonomicinaSigmaI0634
Isoflurano
Langerina-DTRfornecido por Heung Kyu Lee no Instituto Avançado de Ciência e Tecnologia da Coreia
Kit de Coloração de Células Mortas Aqua Fixável LIVE/DEADInvitrogenL34957
Loop e AgulhaSPL90010
MonensinBDBD554724
NanoDrop 2000Thermo Scientific
Penicilina  Gibco15140-122
Placa de PetriSPL10090
Phorbol 12-miristato 13-acetato (PMA)SigmaP8139
PrimeScript RT Master MixTakara BioRR360A
RPMI 1640Gibco11875-093
TesouraRobozpara colheita de amostras
Contas de aço inoxidável, 5 mmQIAGEN69989
de pipeta estéril
SYBR Green Premix Ex Taq IITakara BioRR820A
TCRβBioLegend109228Clone H57-597
ThermoMixer  CEppendorf
TissueLyserQIAGEN
UV-VIS espectrofotômetroPerkinElmer
Wild-type C57BL/6  camundongosOrient Bio7 a 9 semanas de idade foram usados
levedura-peptona-dextrose-adenina (YPDA) meio, líquido, estéril (1% de extrato de levedura, 2% de bacto peptona, 2% de dextrose)
Placa de ágar YPDA, estéril (1% de extrato de levedura, 2% de bactopeptona, 2% de dextrose, 2% de ágar Bacto)
555029 Contador salina tamponada com fosfato de Sigma doPonta de

Referências

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
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