Summary
我们使用传输的光显微镜技术呈现一个无标签的实时成像协议，以捕获图像，分析和量化在水下培养物和固体介质中长丝真菌 A.尼杜兰的 生长动力学。此协议可与荧光显微镜配合使用。
Abstract
众所周知，通过比较菌落大小，在凝固介质上对长丝真菌的菌落生长进行宏观估计，主要取决于海眠/肌皮生长速度的变化。然而，在不同的环境/生长条件下（pH值、温度、碳和氮源、抗生素等）定量测量基因不同真菌株或菌株的生长速度是具有挑战性的。因此，为了更好地了解真菌细胞的生长，必须采用补充方法来量化生长动力学。此外，众所周知，丝状真菌，包括阿斯珀吉卢斯花，在固体介质或水下文化的亚空中条件下具有独特的生长和分化模式。在这里，我们详细介绍了一个定量的微观方法，用于分析模型真菌 阿斯珀吉卢斯尼杜兰的生长动力学，使用实时成像在水下文化和固体介质。我们使用开放源、免费的生物图像软件（例如斐济）以可重复和可靠的方式捕获不同真菌菌株的增长率，分析和量化其增长率，无需用户提供任何事先的图像分析专业知识。
Introduction
丝状真菌具有重要的社会经济和生态重要性，作为工业/农业工具，酶和抗生素生产1，2和作物植物的病原体3，害虫昆虫4和人类3。此外，像阿斯珀吉卢斯尼杜兰这样的丝状真菌被广泛用作基础研究的模型生物体，如遗传学、细胞和进化生物学的研究，以及连字符延伸5的研究。纤维真菌是高度两极分化的生物体，通过膜脂质/蛋白质的连续供应和细胞壁在延伸尖端6的脱光合成而拉长。在直写尖端生长和极性维护中的核心作用是名为"斯皮琴科珀"（SPK）的专门结构，这是一种高度有序的结构，主要由细胞骨骼成分和Golgi6、7、8的极化分布组成。
环境刺激/信号，如水-空气接口，光，CO2 浓度和营养状况负责这些模具9的发展决定。在水下（液体）培养物中 ，A.尼杜兰的 分化被抑制，生长通过连字符尖拉长6发生。在植物生长过程中，无性孢子（conidia）通过顶点延伸发芽，形成一个由相互关联的连字符细胞（mycelium）组成的无差别网络，只要有营养和空间，这种细胞就可能无限期地生长。另一方面，在固体介质连字符提示拉长和经过一个明确的植物生长期（发育能力），无性繁殖开始和空中锥形鼻从细胞的专门足细胞延伸。这些产生专门的发展多细胞结构称为针叶，产生长链的黄体针叶10， 可以在有利的环境条件下重新启动生长。
测量丝状真菌生长的一种广泛使用的方法是在培养皿中含有的营养阿加上接种孢子，并在几天后11日宏观测量菌落的直径。殖民地的直径/面积，最依赖于天体生长速度的变化，而较少依赖于圆锥体密度12，然后用作生长值。虽然测量在固体表面生长的真菌种群（科洛尼）大小是相当充分的，但这绝不是最准确的生长量。与种群水平平均值（真菌群大小的平均值）相比，单细胞测量可以捕获细胞群的异质性，并允许识别细胞的新型亚种群，状态13，动力学，通路以及细胞对内源和环境变化作出反应的生物机制14，15。通过延时显微镜监测真菌细胞生长和表型可以说是最广泛采用的定量单细胞观察方法。
在此，我们详细介绍了一个无标签的实时成像协议，使用传输的光显微镜技术（如相对比度、差分干扰对比度 （DIC） 和极化显微镜）来捕捉图像，这些图像独立于荧光显微镜的组合使用，可用于分析和量化水下文化和固体介质中 A. nidulans 菌株的极性生长。
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Protocol
1. 接种准备
注：所有步骤应在层压流柜下执行。
- 摆脱感兴趣的真菌菌株， 从使用无菌接种环的甘油库存 （-80 °C） 到最小介质 （MM） 板，辅以与所检查的菌株相关的适当营养要求 [MM： 10.0 g/L 葡萄糖，20 mL/L 盐溶液（盐溶液：26 克/升 KCl，26 克/升 MgSO4+7H2O， 76 克/升 KH2PO4， 2.0 mL/L 氯仿） 和 1 mL/L 微量元素 （微量元素： 40 毫克/L Na2B4O7•H2O， 400 毫克/升 CuSO4， 8 g/L ZnSO4， 800 毫克/升 MnSO4， 800 毫克/升 FEPO4）， 调整 pH 到 6.8 与 1 M NaOH， 添加 1 % （w/v） agar 和所需的补充， 如在 16和高压灭菌器中描述 ） （图 1）.
注：盐溶液、微量元素溶液和补充剂是自动封条的。 - 在 37 °C 下孵育 2-3 天。
- 使用无菌牙签（或接种环），转移少量针叶， 通过轻轻触摸单个菌落，到完整介质 （CM） [CM： 10.0 g/L 葡萄糖，2.0 克/升肽，1.0 克/升酵母提取物，1.0 克/升卡萨米诺酸，20 mL/L 盐溶液，1 mL/L 微量元素，5 mL/L 维生素溶液（维生素溶液： 0.1 克/升核黄素， 0.1 克/升尼古丁胺， 0.01 g/L p-氨基苯甲酸， 0.05 g/L 苯丙胺 HCl， 1.0 毫克/升生物素）， 调整 pH 到 6.8 与 1 M NaOH， 添加 1% （w/v） agar 和所需的补充剂，如16 和高压灭菌器中描述的。在 4 °C 下将维生素溶液自动保存并储存在深色瓶子中。
注意：万一真菌生长过于密集，无法识别和隔离单个菌落，请重新划入新的阿加板，以获得单个菌落。 - 在 37 °C 下孵育 3-4 天。
- 使用无菌牙签（图S1），从生长在CM Agar板上的圆锥形真菌群表面划出1厘米，获得约2×106细胞/mL的圆锥形悬浮。
注意：必要时，用细胞计计算针叶。 - 在无菌的 1.5 mL 离心机管中收获 A. nidulans 的针叶，用 1.0 mL 的自动封装蒸馏水，其中含有 0.05% （v/v） Tween 80，用于减少针叶团的数量。
注：Conidia 可在 4 °C 下存储长达 2-3 周，而不会丧失相关生存能力（A. 阿萨纳索普洛斯和 V. 索菲亚诺普卢，未发布数据）。然而，建议过滤和/或洗锥体悬浮，以去除我的天体部分和营养物质，以防止锥体肿胀。
2. 准备成像在阿加（固体）介质上生长的丝状真菌
注：使用"倒置阿加法17，18"的修改版本。
- 最初，在培养皿（+9 厘米）15 mL 的 MM 上发现 10 微升的大力涡旋锥形（约 2 x10 4细胞/mL），1% （w/v） agar （图 2）。
注：使用"倒置阿加法"的修改版本，可以对真菌样本进行数小时的成像，而不会对生长的海梅产生明显的有害影响。 - 根据拟研究的发展阶段孵化实验文化。
- 用无菌手术刀切出含有菌落的≈0.8毫米2 块的醋。
注：要切出的 Agar 块的尺寸取决于随后放置的设备的尺寸。在当前工作中，使用了 8 个井μ幻灯片（见下文）。 - 倒置，将 agar 块放入μ滑梯或类似 8 室盖玻璃井中，盖片适合实时成像。
注：如果传输的光显微镜将与荧光（标记）显微镜相结合使用，在成像前，Agar 块可以倒置到含有活细胞染料的液体介质液滴上。
3. 准备在液体介质上生长的成像丝状真菌
- 在含有 200 μL （液体） MM 的 8 井μ滑梯的井中转移 10 μL 的大力涡旋锥形悬浮（约 2 x 104 细胞/mL），并配以适当的补充剂（见上文）。
- 在所需温度下孵育所需的时间（图3）。
注：如果传输光显微镜将与荧光（标记）显微镜相结合使用，液体培养物具有巨大的优势，在实验19期间的任何时间点都可以添加荧光染料。
4. 捕获图像
注：显微镜的选择取决于可用的设备。在任何情况下，显微镜设置应包括倒置阶段、环境室或至少具有精确空气温度控制的房间。
- 将恒温显微镜室预热至 37 °C（除非另有说明或适合使用过的真菌物种），以便在开始前稳定温度。该室允许在延时实验期间对显微镜光学元件和样品阶段进行温度调节。请注意，当在37 °C 或以上使用普通浸入油（设计用于 23 °C）油时，会引入光学畸变 20。
注：在预算紧张的情况下，孵化室可以用纸板和绝缘包装材料21或使用3D打印机22。 - 打开显微镜、扫描仪电源、激光电源和计算机，并加载成像软件。将μ滑梯（以前准备）置于显微镜阶段并集中注意力。
- 查找包含隔离/不重叠单元格（或至少没有过度拥挤）的视图字段，以便在图像分析期间促进生长测量。捕获每个样本至少 50 个生长细胞，以便进行可靠的统计分析。
- 选择所需的传输光显微镜方法。减少暴露时间或激光功率和像素停留时间和/或增加针孔直径，以尽量减少真菌细胞的光出血，如其他地方描述23，24。
- 设置显微镜，以在所需的时间间隔获取图像，并开始时间系列采集。
注：要纠正焦点漂移随着时间的推移（特别是长期实验），由于热漂移，不同的细胞大小和细胞运动使用自动对焦策略，如果你的显微镜软件可用。
5. 图像分析
注：本节描述了处理延时显微镜图像的关键步骤，用于测量 A.尼杜兰的生长速度。图像的打开、可视化和处理是通过开源 ImageJ/Fiji 软件25完成的。
- 使用插件将图像导入斐济 |生物格式|来自斐济菜单的生物格式进口商 与默认设置 （图 4A）。
注：检查生物格式导入器是否正确识别图像校准。上部信息场图像窗口中显示的图片尺寸必须等于原始图像尺寸（图 4B）。按 移位 + P 以显示和更改 ImageJ/Fiji 软件中的图像属性。 - 在需要时，使用直方图匹配26 用于不同帧之间的照明校正（图像|调整|漂白剂校正|直方图匹配） （图4C） 。
- 必要时，请使用 SIFT 算法（插件|注册|线性堆栈与 SIFT对齐或匹配图像堆栈 （图4D）。从预期的转换菜单中选择"翻译"应该足以纠正任何 x-y 漂移。
注：其他插件也可用于对齐一叠图像切片，如图像稳定器（https://imagej.net/Image_Stabilizer）或 StackReg（http://bigwww.epfl.ch/thevenaz/stackreg/）。 - 选择与覆盖唇平行生长的催眠，避免倾斜。请务必选择通过极地延伸传播的催眠，避免催眠呈现横向和/或 apal 分支。
- 使用 MTrackJ （插件|MTrackJ） 插件，以跟踪增长的连字符提示 （图4E）27。要添加曲目，请选择工具栏中的 "添加" 按钮，然后使用鼠标的左单击将第一点放在连字符提示处。时间系列将自动移动到下一帧。要完成跟踪过程，请双击鼠标上的最终点（或按 Esc 键）（图 4F）。在初始时间范围内移动到另一个兴趣点（即增加连字符尖端），并通过测量另一个催眠的增长率重新启动程序。
注：要安装 MTrackJ，请按照 https://imagescience.org/meijering/software/mtrackj/ 上提供的说明进行安装 - 单击 MTrackJ 对话 （图4G）中的测量按钮以打开输出表。保存轨道测量 （文件|保存为） 到所需的文件格式 （如 csv）， 分析和绘图他们 （图 4H）.
注：通过选择 电影 按钮，制作一部电影，显示图像和跟踪进度。
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Representative Results
按照这个协议，我们捕获并分析了各种图像对应于不同生长/发育阶段的长丝真菌 A.尼杜兰。本研究中提供的数据是使用斐济软件进行处理和分析的。测量保存为 csv 文件，使用商业统计软件进行统计分析并准备为图形和/或 Python 编程语言使用软件库，如熊猫、笨重、统计模型、马图利布和海出生。更多详情可在引用的原始出版物中找到。
为了解释人口的反应，重要的是确定人口内关键参数的异质性，并有效地识别生理上不同的亚群28。图5显示了阿扎+ngnA+突变菌株的生长，在两个基因中带有缺失，其产物与WT菌株相比，与有毒植物产品L-azetidine-2-碳酸29的解毒和同化有关。测量它们在水下液体培养物中的生长速度，我们检测到双突变体的统计学显著较低增长率相比，WT菌株 （t （715） = 20.61， p = <0，0001） （图 5A-B）。这种生长差异不能只测量这些菌株的菌落面积（图5C-D），强调微观单细胞分析更有效地确定生长速度的微小差异，很难通过对菌落的宏观观察来检测。
单细胞长期活成像对于获取细胞蛋白动力学的空间和时间信息具有重要的价值。长期活细胞成像（图6，视频1）的锥形发芽共同表达GFP标签的核心艾索马尔蛋白PilA和mRFP平石H1显示，PilA30形成静态结构，低流动性的真菌血浆膜31，32。此外，图7显示，荧光染料可用于对生长在阿加介质上的菌株进行实时成像，以研究细胞器和细胞结构的动态。在这里，FM4-6433用于可视化线粒体网络和A.尼杜兰的真空系统。
图1：细胞制备程序的示意图。 请单击此处查看此图的较大版本。
图2：在阿加介质上生长的成像丝状真菌的原理图表示。请点击这里查看此图的较大版本。
图3：在液体介质中生长的成像丝状真菌的原理图表示。请点击这里查看此图的较大版本。
图4：图像分析过程的示意图表示。 处理延时显微镜图像和测量 A.尼杜兰生长速度的步骤。 请单击此处查看此图的较大版本。
图5：将传统人口测量与单细胞测量进行比较。（A） 代表聚焦显微镜图像的azhA +ngnA+双删除和 WT 菌株，生长在水下液体培养物中，其中含有尿素作为唯一氮源在 25 °C 下。 所有菌株在25°C下共孵育18小时，每隔15分钟捕获一帧。使用配备HC计划 APO 63x、N.A. 1.40 油浸泡目标的 TCS SP8 MP（德国莱卡）显微镜收集 2048 × 2048 像素的图像，像素尺寸为 115.02 x 115.02 nm。（B） 测量（A） 绘制在盒和胡须图中。统计意义通过 t 测试进行分析，并用星号 （***） 进行描述，表示 p < 0.001。（C） 生长在 25 °C 的 WT 和双删除应变的固体 MM. 殖民地被拍摄在不同的时间间隔 （18 小时， 36 小时和 72 小时）， 空间校准和手动测量与统治者在 ImageJ 程序.（D）（C） 中所呈现的殖民地面积的测量图被绘制为盒和胡须图。与 WT 菌株 （18h： t （8） = 0.69 相比，双突变体的不同时间点之间的菌落面积差异在统计学上没有显著性。 p = 0.50， 36h： t （6） = 0.27， p = 0.5068， 72h： t （6） = 0.39， p = 0.70） 。请单击此处查看此图的较大版本。
图6：圆锥体发芽的长期活细胞成像与基因编码荧光标签融合而成的兴趣蛋白质。（A） 在z平面上产生的4片、共同表达PilA-GFP和H1-mRFP的菌株的最大强度投影（MIP）。含有针叶的阿加块被切开，放入μ滑的井中，在30°C下孵育共18小时。 帧以每隔 25 分钟拍摄一次，使用 TCS SP8 MP（德国莱卡）显微镜，配备 HC Plan APO 63x，N.A. 1.40 油浸入目标（像素大小为 92.26 x 92.26 nm）。图像由令人兴奋的 GFP 以 488-nm 波长获得，在光谱波段中检测荧光度从 495 到 558 nm 不等，通过令人兴奋的 mRFP 以 561 纳米波长获得，在光谱波段中检测荧光度从 580 到 660 nm 不等。（B） 测量（发芽速度和连字符尖端延伸）（A）被绘制为线图。请单击此处查看此图的较大版本。
图7： FM4-64 在固体介质上生长的催眠标签。 WT 菌株的康尼迪亚在 30 °C 下在 1% 的 agar MM 培养皿上栽培，16 小时。 生长的细菌孵育20分钟，10微升的MM含有10μM FM4-64。孵化后，一个含有染色细菌的方块被切开，放置在8 μ滑梯中，然后在30°C处追逐47分钟。 帧每 7 分钟在 30 °C 下使用配备 HC Plan APO 63x 的 TCS SP8 MP 显微镜捕获一次，该显微镜具有 1.40 个油浸入目标（像素大小为 184.52 x 184.52 nm）。图像由令人兴奋的FM4-64获得，波长为514-nm，在光谱带中检测荧光度从596到682纳米不等。FM4-64 荧光信号显示为倒置图像。 请单击此处查看此图的较大版本。
图8：WT菌株的初期阶段，在30°C的136小时的阿加介质上培养，切开并放入μ滑的井中。每 20 分钟捕获一次帧。使用 TCS SP8 MP（德国莱卡）显微镜收集 2048 × 2048 像素的图像，像素大小为 245.2 x 245.2 nm，配备 HC 计划 APO 63x，N.A. 1.40 油浸入目标。图像显示了锥形囊泡（黑箭头）的形成以及甲基苯甲酸（蓝色箭头）的形成（棕色箭头）和成熟。（B） 测量（发芽速度和单极连字符尖端延伸）（A）被绘制为线图。请单击此处查看此图的较大版本。
视频 1： 圆锥体发芽的长期活细胞成像共同表达 Pila - Gfp 和 H1 - mrfp 。 请点击这里下载此视频。
视频 2：尼杜兰人形成圆锥体的早期阶段，请点击这里下载此视频。
图S1：准备锥形悬架。 通过用无菌牙签刮一个约1厘米2 表面的圆锥形板，获得约2×106 针叶/毫升的悬架。 请点击这里下载此文件。
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Discussion
通过延时显微镜监测真菌细胞生长和表型是实时、定量和准确地评估细胞行为的有力方法，它能够确定特定的药物治疗和/或基因干预是否导致可检测到的细胞生长或表型差异。
在这项研究中，描述了一个可靠的活细胞成像方法来测量和定量分析真菌的发展，包括细菌管的动态和直肠尖生长在 A.尼杜兰。使用传输的光显微镜技术监测随着时间推移的形态变化，对于识别有压力、死亡或死亡的细胞非常有帮助。在单细胞一级详细了解这种动态过程，可以评估细胞混合种群中的异质性，从长远来看，可以确定细胞对内源和环境信号作出反应的途径和详细机制。
这种方法的一个优点是，它基于无标签成像方法（尽管如此，它很容易与荧光显微镜相结合），它使用细胞固有的光折射特性来创建图像对比度，而不引入染料/标签，这可能会混淆结果。虽然荧光标记可用于标记细胞室和蛋白质，并显著促进细胞的分割和跟踪，但传输的光显微镜规避了基因工程细胞的需求，使研究人员能够避免成本和耗时的染料/标签优化，并避免荧光成像13，34可能产生的光毒性影响。
本协议适用于研究形成催眠或伪水眠的真菌的生长动力学。此外，这种方法非常适合成像不同菌株的不同细胞结构，并处于不同的发育阶段。在 图8 和 视频2中，我们介绍了 A.尼杜兰斯 圆锥体（即带有无性孢子的结构）发展的初始阶段。然而，必须指出，这种方法不是最适合成像锥体形成，因为碳/氮饥饿和空气暴露，这两者都是针叶素开发所必需的，不能通过我们的方法35标准化。
此外，本协议不太适合跟踪真菌生物膜，这些生物膜受垂直延伸的影响，形成由丝状催眠、伪水母细胞、酵母状细胞和各种形式的细胞外基质36组成的密集异质、表面相关菌落。该技术的另一个局限性是，虽然无标签微观分析代表了对发芽/分化动力学进行定性和定量分析的精确方法，但人工评估此类数据非常耗时，尤其是在检查许多菌株或/和条件时。因此，高通量延时成像显微镜的数据应通过适当的计算软件进行分析，从而能够自动或半自动图像分析连字符发育和锥形发芽37，38，39。
综上所述，我们提出了一个协议，用于以可重复和可靠的方式分析真菌生长动力学，而无需用户提供任何先前的图像分析经验。该协议允许客观和准确地量化真菌生长和分化，并提供了一个补充成像方法来研究真菌生命周期和真菌致病性37。
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Disclosures
作者没有什么可透露的。
Acknowledgments
这项工作部分得到了"希腊可视化和监测基本生物过程研究基础设施"项目（MIS 5002755）的支持，该项目是在"加强研究和创新基础设施"行动下实施的，该项目由"竞争力、创业和创新"业务方案（NSRF 2014-2020）资助，由希腊和欧盟共同资助。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| µ-Slide 8 Well | Ibidi | 80826 | Imaging slides |
| 4-Aminobenzoic acid | Merck | A9878 | |
| azhAΔ ngnAΔ | Genotype: zhAΔ::pyrGAf; ngnAΔ::pyrGAf; pyroA4 pantoB100 / References:Laboratory collection, Athanasopoulos et al., 2013 | ||
| Bacto Casamino Acids | Gibco | 223030 | |
| Biotin | Merck | B4639 | |
| Chloroform | Merck | 67-66-3 | |
| Copper(II) sulfate pentahydrate | Merck | C8027 | |
| Glucose | Merck | G8270 | |
| GraphPad Prism 8.0 | GraphPad Software | Statistical Software | |
| ImageJ | NIH | Image processing and analysis software | |
| Inoculating Loop | Merck | I8263-500EA | |
| Iron(III) phosphate | Merck | 1.03935 | |
| Leica Application Suite X | Leica Microsystems | Microscope software | |
| Magnesium sulfate heptahydrate | Merck | 63138 | |
| Manganese(II) sulfate monohydrate | Merck | M7899 | |
| Microscope Leica TCS SP8 | Leica Microsystems | ||
| Nicotinamide (Niacinamide) | Supelco | 47865-U | |
| Peptone | Millipore | 68971 | |
| Petri Dishes for Microbiology Culture | KISKER | G090 | |
| Potassium chloride | Merck | P4504 | |
| Potassium phosphate monobasic | Merck | P5655 | |
| Pyridoxine hydrochloride | Merck | P6280 | |
| Quali - Microcentrifuge Tubes, 1,7 mL, DNase-, RNase and pyrogen free, sterile | KISKER | G052-S | |
| Quali - Microcentrifuge Tubes, 2.0 mL, sterile | KISKER | G053-S | |
| Quali - Standard Tips, Bevelled, 100-1000 µL | KISKER | VL004G | |
| Quali - Standard Tips, Bevelled, 1-200 µL | KISKER | VL700G | |
| Quali Microvolume Tips, DNase-, RNase free, 0,1-10 µL/clear | KISKER | GC.TIPS.B | |
| Riboflavin (B2) | Supelco | 47861 | |
| Scalpel blades NO. 11 | OdontoMed2011 | S2771 | |
| Sodium chloride | Merck | S7653 | |
| Sodium hydroxide | Merck | S8045 | |
| Sodium tetraborate decahydrate | Merck | S9640 | |
| VS151 (PilA-GFP and H1-mRFP) | Genotype: pyrG89; pilA::sgfp::AfpyrG+ argB2 nkuAΔ::argB+ pyroA4 hhoA::mrfp::Afribo+ riboB2 / References:Laboratory collection, Biratsi et al., 2021 | ||
| WT | Genotype: nkuAΔ::argB; pyrG89; pyroA4;pyrG89 / References: TN02A3 -FGSC A1149 | ||
| Yeast Extract | Millipore | 70161 | |
| ZnSO4 |
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