Summary
We presenteren een labelvrij live beeldvormingsprotocol met behulp van microscopietechnieken voor doorgegeven licht om beelden vast te leggen, groeikinetiek van de filamenteuze schimmel A. nidulans in zowel ondergedompelde culturen als vaste media te analyseren en te kwantificeren. Dit protocol kan worden gebruikt in combinatie met fluorescentiemicroscopie.
Abstract
Het is algemeen bekend dat de koloniegroei van filamenteuze schimmels, meestal afhankelijk van veranderingen in de groeisnelheid van schimmeldraden / mycelia-apicale, macroscopisch wordt geschat op gestolde media door de koloniegrootte te vergelijken. Het is echter een uitdaging om de groeisnelheid van genetisch verschillende schimmelstammen of -stammen onder verschillende omgevings- / groeiomstandigheden (pH, temperatuur, koolstof- en stikstofbronnen, antibiotica, enz.) kwantitatief te meten. Het streven naar complementaire benaderingen om groeikinetiek te kwantificeren wordt dus verplicht om de groei van schimmelcellen beter te begrijpen. Bovendien is het bekend dat filamenteuze schimmels, waaronder Aspergillus spp., verschillende manieren van groei en differentiatie hebben onder sub-luchtomstandigheden op vaste media of ondergedompelde culturen. Hier beschrijven we een kwantitatieve microscopische methode voor het analyseren van de groeikinetiek van de modelschimmel Aspergillus nidulans, met behulp van live beeldvorming in zowel ondergedompelde culturen als vaste media. We leggen beelden vast, analyseren en kwantificeren groeisnelheden van verschillende schimmelstammen op een reproduceerbare en betrouwbare manier met behulp van een open source, gratis software voor biobeelden (bijv. Fiji), op een manier die geen voorafgaande beeldanalyse-expertise van de gebruiker vereist.
Introduction
Filamenteuze schimmels zijn van groot sociaaleconomisch en ecologisch belang, omdat ze zowel cruciaal zijn als industriële / agrarische hulpmiddelen voor enzym- en antibioticaproductie1,2 en als pathogenen van gewasplanten3, plaaginsecten4 en mensen3. Bovendien worden filamenteuze schimmels zoals Aspergillus nidulans veel gebruikt als modelorganismen voor fundamenteel onderzoek, zoals studies in genetica, cel- en evolutionaire biologie en voor de studie van hyphal-extensie5. Filamenteuze schimmels zijn sterk gepolariseerde organismen die zich uitstrekken door de continue toevoer van membraanlipiden / eiwitten en de de novo synthese van celwand aan de uitstrekkende punt6. Een centrale rol in de groei en het behoud van de hyphalte tip is een gespecialiseerde structuur genaamd 'Spitzenkorper' (SPK), een zeer geordende structuur die voornamelijk bestaat uit cytoskeletcomponenten en de gepolariseerde verdeling van de Golgi6,7,8.
Omgevingsstimuli/signalen, zoals water-lucht interface, licht, CO2-concentratie en de voedingstoestand zijn verantwoordelijk voor de ontwikkelingsbeslissingen die door deze mallen worden genomen9. In ondergedompelde (vloeibare) culturen wordt de differentiatie van A. nidulans onderdrukt en vindt groei plaats door hyphal tip elongatie6. Tijdens vegetatieve groei ontkiemen aseksuele sporen (conidia) door apicale extensie en vormen ze een ongedifferentieerd netwerk van onderling verbonden hyphalcellen, het mycelium, dat onbeperkt kan blijven groeien zolang voedingsstoffen en ruimte beschikbaar zijn. Aan de andere kant, op solide media hyphal tips verlengen en na een gedefinieerde periode van vegetatieve groei (ontwikkelingscompetentie), wordt aseksuele reproductie geïnitieerd en breiden conidiofore stengels vanuit de lucht zich uit van gespecialiseerde voetcellen van het mycelium6. Deze geven aanleiding tot gespecialiseerde ontwikkelings-meercellige structuren die conidioforen worden genoemd, die lange ketens van haploïde conidia10 produceren die de groei onder gunstige omgevingsomstandigheden kunnen hervatten.
Een veelgebruikte methode voor het meten van filamenteuze schimmelgroei is het inenten van sporen op voedingsagar in een petrischaaltje en het macroscopisch meten van de diameter van de kolonie een paar dagen later11. De diameter /oppervlakte van de kolonie, het meest afhankelijk van veranderingen in myceliale groeisnelheid en minder van conidioforedichtheid 12, wordt dan gebruikt als een waarde van groei. Hoewel het meten van de grootte van schimmelpopulaties (kolonies) die op vaste oppervlakken groeit, voldoende is, is het zeker niet de meest nauwkeurige maat voor groei. Vergeleken met gemiddelden op populatieniveau (gemiddelden van de grootte van schimmelkolonies), kunnen metingen van één cel de heterogeniteit van een celpopulatie vastleggen en identificatie van nieuwe subpopulaties van cellen mogelijk maken, toestanden13, dynamiek, routes en de biologische mechanismen waarmee cellen reageren op endogene en omgevingsveranderingen14,15. Het monitoren van de groei en het fenotype van schimmelcellen door time-lapse-microscopie is misschien wel de meest gebruikte kwantitatieve benadering van eencellige observatie.
Hierin beschrijven we een labelvrij live beeldvormingsprotocol met behulp van microscopietechnieken voor doorgegeven licht (zoals fasecontrast, differentieel interferentiecontrast (DIC) en gepolariseerde microscopie) om beelden vast te leggen, die onafhankelijk van het gecombineerde gebruik van fluorescentiemicroscopie kunnen worden gebruikt om de polaire groei van A. nidulans-stammen in zowel ondergedompelde culturen als vaste media te analyseren en te kwantificeren.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Entbereiding
OPMERKING: Alle stappen moeten worden uitgevoerd onder een laminaire flowkast.
- Streep de interessante schimmelstam uit, van een glycerolvoorraad (-80 °C) met behulp van een steriele inentingslus, op platen van minimale media (MM) aangevuld met de juiste voedingsbehoeften die relevant zijn voor de onderzochte stam [MM: 10,0 g/L glucose, 20 ml/l zoutoplossing (zoutoplossing: 26 g/l KCl, 26 g/l MgSO4·7H2O, 76 g/L KH2PO4, 2,0 ml/l chloroform) en 1 ml/l sporenelementen (sporenelementen: 40 mg/l Na2B4O7· H2O, 400 mg/L CuSO4, 8 g/L ZnSO4, 800 mg/L MnSO4, 800 mg/L FePO4), de pH aanpassen tot 6,8 met 1 M NaOH, 1 % (w/v) agar en de vereiste supplementen zoals beschreven in16 en autoclaaf toevoegen (Figuur 1).
OPMERKING: Zoutoplossing, sporenelementenoplossing en supplementen worden geautoclaveerd. - Incubeer gedurende 2-3 dagen bij 37 °C.
- Gebruik een steriele tandenstoker (of een inentingslus), breng een klein aantal conidia over, door voorzichtig een enkele kolonie aan te raken, naar platen met complete media (CM) [CM: 10,0 g / L glucose, 2,0 g / L pepton, 1,0 g / L gistextract, 1,0 g / L casaminozuren, 20 ml / L zoutoplossing, 1 ml / L sporenelementen, 5 ml / L vitamineoplossing (vitamineoplossing: 0,1 g/L riboflavine, 0,1 g/L nicotinamide, 0,01 g/L p-aminobenzoëzuur, 0,05 g/L pyridoxine HCl, 1,0 mg/L biotine), pas de pH aan tot 6,8 met 1 M NaOH, voeg 1 % (w/v) agar en de vereiste supplementen toe zoals beschreven in16 en autoclaaf]. Autoclaaf en bewaar de vitamine-oplossing in een donkere fles bij 4 °C.
OPMERKING: In het geval dat de schimmelgroei te dicht is om individuele kolonies te identificeren en te isoleren, streep dan opnieuw op een nieuwe agarplaat om enkele kolonies te verkrijgen. - Incubeer gedurende 3-4 dagen bij 37 °C.
- Verkrijg een conidiale suspensie van ongeveer 2 x 106 cellen / ml door 1 cm van het oppervlak van een verstopte schimmelkolonie gekweekt op CM-agarplaten te krabben, met behulp van een steriele tandenstoker (figuur S1).
OPMERKING: Tel indien nodig conidia met een hemocytometer. - Oogst conidia van A. nidulans in een steriele centrifugebuis van 1,5 ml met 1,0 ml gedestilleerd water met autoclaaf dat 0,05% (v/v) Tween 80 bevat voor het verminderen van het aantal conidia-klonten.
OPMERKING: Conidia kan tot 2-3 weken bij 4 °C worden bewaard zonder een relevant verlies van levensvatbaarheid (A. Athanasopoulos en V. Sophianopoulou, niet-gepubliceerde gegevens). Het wordt echter aanbevolen om conidiale suspensie te filteren en / of te wassen om myceliale delen en voedingsstoffen te verwijderen, om conidiale zwelling te voorkomen.
2. Voorbereiding voor het afbeelden van filamenteuze schimmels die groeien op agar (vaste) mediums
OPMERKING: Er wordt een aangepaste versie van de 'omgekeerde agarmethode17,18' gebruikt.
- Spot in eerste instantie 10 μL aliquots van krachtig gevortexed conidial (ongeveer 2 x 104 cellen / ml) op verschillende punten op petrischalen (Ø9 cm) 15 ml MM met 1% (w / v) agar (figuur 2).
OPMERKING: Met behulp van de aangepaste versie van de 'omgekeerde agar-methode' is het mogelijk om schimmelmonsters vele uren in beeld te brengen zonder duidelijke schadelijke effecten op groeiende schimmeldraden. - Incubeer de experimentele cultuur volgens het ontwikkelingsstadium dat bedoeld is om te worden onderzocht.
- Snijd een ≈0,8 mm2 blok agar met de kolonie uit met behulp van een steriel scalpel.
OPMERKING: De afmetingen van het uit te snijden agarblok zijn afhankelijk van de afmetingen van de apparatuur die achteraf moet worden geplaatst. In het huidige werk worden 8 goed μ-dia's gebruikt (zie hieronder). - Keer om en plaats het agarblok in een put van een μ-slide of vergelijkbaar 8-kamer afdekglas met coverslip geschikt voor live beeldvorming.
OPMERKING: In het geval dat microscopie van doorgegeven licht zal worden gebruikt in combinatie met fluorescentie (etikettering) microscopie, kan het agarblok worden omgekeerd op een druppel vloeibaar medium met de kleurstof van de levende celkleuring, net voordat het wordt afbeeld.
3. Voorbereiding voor het afbeelden van filamenteuze schimmels die op vloeibaar medium groeien
- Breng 10 μL aliquots van een krachtig gevortexed conidiale suspensie (ongeveer 2 x 104 cellen/ml) over in de putten van een 8 goed μ-slide met 200 μL (vloeibare) MM met de juiste supplementen (zie hierboven).
- Incubeer voor de gewenste tijd bij de gewenste temperatuur(figuur 3).
OPMERKING: Als doorgegeven lichtmicroscopie zal worden gebruikt in combinatie met fluorescentie (etikettering) microscopie, hebben vloeibare culturen het grote voordeel dat fluorescerende kleurstoffen op elk gewenst tijdstip tijdens het experiment kunnen worden toegevoegd19.
4. Leg beelden vast
OPMERKING: De keuze van de microscoop is afhankelijk van de beschikbare apparatuur. In ieder geval moet de microscoopopstelling een omgekeerde fase, een omgevingskamer of op zijn minst een kamer met nauwkeurige luchttemperatuurregeling omvatten.
- Verwarm de thermostatische microscoopkamer voor op 37 °C (tenzij anders aangegeven of geschikt voor de gebruikte schimmelsoorten) om de temperatuur te stabiliseren voordat u begint. Deze kamer maakt temperatuurmodulatie van de microscoopoptiek en monsterfase mogelijk tijdens time-lapse-experimenten. Houd er rekening mee dat optische afwijkingen20 worden geïntroduceerd wanneer normale dompeloliën (ontworpen voor gebruik bij 23 °C) oliën worden gebruikt bij 37 °C of hoger.
OPMERKING: Met een krap budget kunnen incubatiekamers worden gemaakt van karton en isolerend verpakkingsmateriaal21 of met behulp van een 3D-printer22. - Schakel de microscoop, de scannervoeding, de laservoeding en de computer in en laad de beeldbewerkingssoftware. Plaats de μ -dia (eerder voorbereid) in het microscoopstadium en stel scherp.
- Zoek gezichtsvelden die geïsoleerde /niet overlappende cellen bevatten (of in ieder geval niet overvol), om groeimetingen tijdens beeldanalyse te vergemakkelijken. Leg ten minste 50 groeiende cellen per monster vast om een robuuste statistische analyse mogelijk te maken.
- Selecteer de gewenste benadering van doorlatende lichtmicroscopie. Verminder de belichtingstijd of laserkracht en pixelbewoningstijd en/of vergroot de diameters van gaatjes, om fotobleaching van schimmelcellen te minimaliseren, zoals elders beschreven 23,24.
- Stel de microscoop in om beelden met de gewenste tijdsintervallen te verkrijgen en begin met het verwerven van tijdreeksen.
OPMERKING: Om te corrigeren voor focale drift in de loop van de tijd (vooral voor lange experimenten), als gevolg van thermische drift, diverse celgroottes en celbeweging, gebruikt u een autofocusstrategie indien beschikbaar in uw microscoopsoftware.
5. Beeldanalyse
OPMERKING: In deze sectie worden de belangrijkste stappen beschreven voor het verwerken van time-lapse microscopiebeelden voor het meten van de groeisnelheid van A. nidulans. Openen, visualiseren en verwerken van afbeeldingen wordt bereikt met de open source ImageJ / Fiji-software25.
- Importeer de afbeeldingen naar Fiji met behulp van Plugins | Bio-Formaten | Bio-Formats Importeur uit het Fiji menu met standaard instellingen (Figuur 4A).
OPMERKING: Controleer of de import voor bio-indelingen de beeldkalibratie goed herkent. De afbeeldingsmaat die in het bovenste afbeeldingsvenster van het informatieveld wordt weergegeven, moet gelijk zijn aan de oorspronkelijke afbeeldingsafmetingen(figuur 4B). Druk op Shift + P om afbeeldingseigenschappen weer te geven en te wijzigen in ImageJ / Fiji-software. - Gebruik waar nodig histogram26 voor verlichtingscorrectie tussen verschillende frames(Image | | aanpassen Bleekcorrectie | Histogram Matching) (Figuur 4C).
- Gebruik waar nodig het SIFT-algoritme(Plugins | Registratie | Lineaire stapeluitlijning met SIFT) voor het uitlijnen of matchen van afbeeldingsstapels (Figuur 4D). Het selecteren van "Vertaling" in het verwachte transformatiemenu zou voldoende moeten zijn om elke x-y-drift te corrigeren.
OPMERKING: Andere plug-ins kunnen ook worden gebruikt om een stapel afbeeldingssegmenten uit te lijnen, zoals Image Stabilizer (https://imagej.net/Image_Stabilizer) of StackReg (http://bigwww.epfl.ch/thevenaz/stackreg/). - Selecteer schimmeldraden die parallel aan coverslip groeien en vermijd de schimmels die gekanteld zijn. Zorg ervoor dat u schimmeldraden selecteert die zich voortplanten door polaire extensie en vermijd dat schimmeldraden laterale en / of apicale vertakkingen vertonen.
- Gebruik MTrackJ(Plugins | MTrackJ) plugin om groeiende hyphal tips te volgen (Figuur 4E)27. Als u een track wilt toevoegen, selecteert u de knop Toevoegen in de werkbalk en plaatst u het eerste punt op een hyphalpunt met de linkermuisklik. De tijdreeks gaat automatisch naar het volgende frame. Om het trackingproces te voltooien, dubbelklikt u met de muis op het laatste punt (of drukt u op de Esc-toets) (Figuur 4F). Ga naar een ander aandachtspunt (d.w.z. groeiende hyphal tip) in het eerste tijdsbestek en start de procedure opnieuw door de groeisnelheid van een andere hypha te meten.
OPMERKING: Om MTrackJ te installeren, volgt u de instructies op https://imagescience.org/meijering/software/mtrackj/ - Klik op de knop Meten in het dialoogvenster MTrackJ (Figuur 4G) om de uitvoertabel te openen. Trackmetingen opslaan(bestand | Opslaan als) in het gewenste bestandsformaat (bijv. csv), analyseer en plot ze(Figuur 4H).
OPMERKING: Door de knop Film te selecteren, wordt een film geproduceerd met de afbeelding en de voortgang van het spoor.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Volgens dit protocol hebben we verschillende beelden vastgelegd en geanalyseerd die overeenkomen met verschillende groei- / ontwikkelingsstadia van de filamenteuze schimmel A. nidulans. De gegevens die in deze studie werden gepresenteerd, werden verwerkt en geanalyseerd met behulp van de Fiji-software. Metingen werden opgeslagen als csv-bestanden, statistisch geanalyseerd en voorbereid als grafieken met behulp van commerciële statistische software en / of Python-programmeertaal met behulp van softwarebibliotheken zoals panda's, numpy, statsmodels, matplotlib en seaborn. Meer details zijn te vinden in de geciteerde originele publicaties.
Om de respons van populaties te interpreteren, is het belangrijk om de heterogeniteit van belangrijke parameters binnen de populaties te bepalen en om fysiologisch verschillende subpopulaties efficiënt te identificeren28. Figuur 5 toont de groei van de azhAΔ ngnAΔ mutante stam, met deleties in twee genen, waarvan de producten betrokken zijn bij de ontgifting en assimilatie van het toxische fytoproduct L-azetidine-2- carbonzuur29, in vergelijking met de WT-stam. Door hun groeisnelheid in ondergedompelde vloeibare culturen te meten, detecteren we een statistisch significant lagere groeisnelheid van de dubbele mutant in vergelijking met deWT-stam(t(715) = 20,61, p = <0,0001) (Figuur 5A-B ). Dit verschil in groei was niet detecteerbaar door alleen het koloniegebied van deze stammen te meten (Figuur 5C-D), wat benadrukt dat microscopische eencellige analyse effectiever is in het bepalen van kleine verschillen in groeisnelheden die moeilijk te detecteren zijn met macroscopische observatie van de kolonie.
Single cell long-term live imaging is van grote waarde in de inspanning om ruimtelijke en temporele informatie van cellulaire eiwitdynamica te verkrijgen. Langdurige live celbeeldvorming (Figuur 6, Video 1) van conidiale kiemkracht die het GFP-gelabelde kerneidosomale eiwit PilA en het mRFP-histon H1 co-tot expressie brengen, toont aan dat PilA30 statische structuren vormt met lage mobiliteit bij schimmelplasmamembraan31,32. Bovendien laat figuur 7 zien dat fluorescerende kleurstoffen kunnen worden gebruikt voor live beeldvorming van stammen die op agarmedium zijn gekweekt, om de dynamiek van organellen en celstructuren te bestuderen. Hier werd FM4-6433 gebruikt om het mitochondriale netwerk en het vacuolaire systeem in A. nidulans te visualiseren.
Figuur 1: Schematische weergave van de entbereidingsprocedure. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 2: Schematische weergave van de gevolgde procedure voor het afbeelden van filamenteuze schimmels die op agarmedium groeien. Klik hier voor een grotere versie van deze figuur.
Figuur 3: Schematische weergave van de gevolgde procedure voor het afbeelden van filamenteuze schimmels die in vloeibaar medium groeien. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 4: Schematische weergave van de beeldanalyseprocedure. Stappen voor het verwerken van time-lapse microscopie beelden en het meten van de groeisnelheid van A. nidulans. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 5: Vergelijking van traditionele populatiemetingen met eencellige metingen. A) Representatieve confocale microscopiebeelden van azhAΔ ngnAΔ dubbeldeletie- en WT-stammen, gekweekt in ondergedompelde vloeibare culturen die ureum als enige stikstofbron bij 25 °C bevatten. Alle stammen werden geïncubeerd gedurende een totaal van 18 uur, bij 25 °C en frames werden vastgelegd met intervallen van 15 minuten. Beelden van 2048 × 2048 pixels werden verzameld met een pixelgrootte van 115,02 x 115,02 nm met behulp van een TCS SP8 MP (Leica, Duitsland) microscoop uitgerust met HC Plan APO 63x, N.A. 1.40 olie-onderdompelingsobject. (B) Metingen van (A) worden uitgezet in box-and-whiskers percelen. Statistische significantie werd geanalyseerd via t-Test en is afgebeeld met sterretjes (***), wat aangeeft dat p < 0,001. (C) Groei bij 25 °C WT en dubbele deletiebelasting op vaste MM. Kolonies werden gefotografeerd met verschillende tijdsintervallen (18 h, 36 h en 72 h), ruimtelijk gekalibreerd en handmatig gemeten met een liniaal in het ImageJ-programma. D) Metingen van het gebied van kolonies gepresenteerd in (C) worden uitgezet als doos-en-snorharen percelen. Verschillen in de oppervlakte van kolonies waren niet statistisch significant tussen de verschillende tijdspunten van de dubbele mutant in vergelijking met de WT-stam (18h: t(8) = 0,69, p = 0,50, 36h: t(6) = 0,27, p = 0,5068, 72h: t(6) = 0,39, p = 0,70 ). Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 6: Langdurige live celbeeldvorming van conidiale kiemkracht co-expressie-eiwitten van belang gefuseerd met genetisch gecodeerde fluorescerende tags. (A) Maximale intensiteitsprojecties (MIP) van 4 plakjes gegenereerd in het z-vlak, van een stam die PilA-GFP en H1-mRFP co-expresseert. Conidia werden gespot op agarmedium en gedurende ongeveer 1 uur bij 30 °C geïncubeerd om de hechting van de cellen aan de agar te helpen. Het agarblok met conidia werd uitgesneden, in putten van een μ-slide geplaatst en in totaal 18 uur bij 30 °C geïncubeerd. Frames werden vastgelegd met intervallen van 25 minuten, met behulp van een TCS SP8 MP (Leica, Duitsland) microscoop uitgerust met HC Plan APO 63x, N.A. 1.40 olie-onderdompelingsobject objectief (met een pixelgrootte van 92,26 x 92,26 nm). Beelden werden verkregen door spannende GFP op een golflengte van 488 nm en het detecteren van fluorescentie in de spectrale band variërend van 495 tot 558 nm, en door het opwinden van mRFP bij een golflengte van 561 nm en het detecteren van fluorescentie in de spectrale band variërend van 580 tot 660 nm. (B) Metingen (kiemsnelheid en hyphal tip extension) van (A) worden uitgezet als lijngrafiek. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 7: FM4-64 etikettering van schimmeldraden die op vast medium groeien. Conidia van een WT-soort werden gekweekt op 1% agar MM Petrischalen gedurende 16 uur bij 30 °C. De groeiende kiemen werden gedurende 20 minuten geïncubeerd met 10 μL MM met 10 μM FM4-64. Na incubatie werd een agarblok met gekleurde kiemen uitgesneden, in 8 μ-slide geplaatst, gevolgd door een achtervolging van 47 minuten bij 30 °C. Frames werden elke 7 minuten bij 30 °C vastgelegd met behulp van een TCS SP8 MP microscoop uitgerust met HC Plan APO 63x, N.A. 1.40 olie-onderdompelingsobject objectief (met een pixelgrootte van 184,52 x 184,52 nm). Beelden werden verkregen door spannende FM4-64 bij een golflengte van 514 nm en het detecteren van fluorescentie in de spectrale band variërend van 596 tot 682 nm. Het FM4-64 fluorescentiesignaal wordt weergegeven als omgekeerd beeld. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 8: Vroege stadia van conidiofore vorming. (A) Conidia van WT-stam werden gedurende 136 h bij 30 °C op agarmedium gekweekt, uitgesneden en in putten van een μ-slide geplaatst. Frames werden elke 20 minuten vastgelegd. Beelden van 2048 × 2048 pixels werden verzameld met een pixelgrootte van 245,2 x 245,2 nm met behulp van een TCS SP8 MP (Leica, Duitsland) microscoop, uitgerust met HC Plan APO 63x, N.A. 1.40 olie-onderdompelingsobject. Afbeeldingen tonen de vorming van conidiofore blaasjes (zwarte pijl) evenals de vorming (bruine pijl) en rijping van metulae (blauwe pijl). (B) Metingen (kiemsnelheid en unipolaire hyphal tip extensie) van (A) worden uitgezet als lijngrafiek. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Video 1: Langdurige live celbeeldvorming van conidiale kiemkracht die PilA-GFP en H1-mRFP co-expressie geeft. Klik hier om deze video te downloaden.
Video 2: Vroege stadia van conidiofore vormingin A. nidulans. Klik hier om deze video te downloaden.
Figuur S1: Bereiding van conidiale suspensie. Door met een steriele tandenstoker een oppervlak van ongeveer1 cm 2 van een vernauwde plaat te schrapen, wordt een suspensie van ongeveer 2 x10 6 conidia/ml verkregen. Klik hier om dit bestand te downloaden.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Het monitoren van schimmelcelgroei en fenotype door time-lapse microscopie is een krachtige benadering om cellulair gedrag in realtime en kwantitatief en nauwkeurig te beoordelen of een bepaalde medicamenteuze behandeling en / of genetische interventie resulteert in detecteerbare celgroei of fenotypische verschillen in de loop van de tijd.
In deze studie werd een betrouwbare live-cell imaging methodologie beschreven om de ontwikkeling van schimmels te meten en kwantitatief te analyseren, inclusief de dynamiek van kiembuis- en hyphal tipgroei in A. nidulans. Het monitoren van morfologische veranderingen in de loop van de tijd, met behulp van microscopietechnieken voor doorgegeven licht, kan zeer nuttig zijn om cellen te identificeren die gestrest, stervend of dood zijn. Een gedetailleerde kennis van dergelijke dynamische processen op het niveau van één cel maakt het mogelijk om heterogeniteit binnen een gemengde populatie van cellen te beoordelen en in een langetermijnperspectief, maakt de identificatie van routes en gedetailleerde mechanismen mogelijk waarmee cellen reageren op endogene en omgevingssignalen.
Een voordeel van deze methode is dat het gebaseerd is op een labelvrije beeldvormingsbenadering (die niettemin gemakkelijk kan worden gecombineerd met fluorescentiemicroscopie) die inherente lichtbrekingseigenschappen van cellen gebruikt om beeldcontrast te creëren zonder kleurstoffen / labels te introduceren, wat de resultaten kan verstoren. Terwijl fluorescerende markers kunnen worden gebruikt om cellulaire compartimenten en eiwitten te labelen en de segmentatie en tracking van cellen aanzienlijk te vergemakkelijken, omzeilt doorgezonden lichtmicroscopie de behoefte aan genetisch gemanipuleerde cellen, waardoor onderzoekers de kosten en de tijdrovende kleurstof / labeloptimalisatie kunnen vermijden en ook om waarschijnlijke fototoxiciteitseffecten afkomstig van fluorescentiebeeldvorming te voorkomen13,34.
Dit protocol is geschikt om de groeikinetiek van schimmels te bestuderen die schimmeldraden of pseudohyphae vormen. Bovendien is deze aanpak zeer geschikt voor het in beeld brengen van verschillende celstructuren van verschillende stammen en in verschillende ontwikkelingsstadia. In figuur 8 en video 2presenteren we de beginstadia van de ontwikkeling van A. nidulans conidiophore (d.w.z. structuren met aseksuele sporen). Er moet echter worden opgemerkt dat deze methode niet de meest geschikte is voor het afbeelden van conidiofore vorming, omdat koolstof / stikstofgebrek en blootstelling aan lucht, beide noodzakelijk voor de ontwikkeling van conidioforen, niet kunnen worden gestandaardiseerd door onze benadering35.
Bovendien is dit protocol slecht geschikt om schimmelbiofilms te volgen, die onderhevig zijn aan verticale uitbreiding die een dichte heterogene, oppervlakte-geassocieerde kolonie vormt die bestaat uit filamenteuze schimmeldraden, pseudohyphale cellen, gistvormige cellen en verschillende vormen van extracellulaire matrix36. Een andere beperking van de techniek is dat, hoewel labelvrije microscopische analyse een nauwkeurige methode is voor de kwalitatieve en kwantitatieve analyse van kiem-/differentiatiedynamiek, handmatige evaluatie van dergelijke gegevens tijdrovend is, vooral wanneer veel stammen en/of omstandigheden worden onderzocht. Gegevens van high-throughput time-lapse imaging microscopie moeten dus worden geanalyseerd door geschikte computationele software die geautomatiseerde of semi-geautomatiseerde beeldanalyse van hyphal-ontwikkeling en conidiale kieming37,38,39mogelijk maakt .
Samenvattend presenteren we hierin een protocol voor het analyseren van schimmelgroeikinetiek op een reproduceerbare en betrouwbare manier zonder de noodzaak van enige voorafgaande beeldanalyse-ervaring van de gebruiker. Dit protocol maakt objectieve en nauwkeurige kwantificering van schimmelgroei en -differentiatie mogelijk en biedt een aanvullende beeldvormingsbenadering om schimmellevenscycli en schimmelpathogeniteit te bestuderen37.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
De auteurs hebben niets te onthullen.
Acknowledgments
Dit werk werd gedeeltelijk ondersteund door het project "A Greek Research Infrastructure for Visualizing and Monitoring Fundamental Biological Processes (BioImaging-GR)" (MIS 5002755) dat wordt uitgevoerd in het kader van de actie "Versterking van de onderzoeks- en innovatie-infrastructuur", gefinancierd door het operationele programma "Concurrentievermogen, ondernemerschap en innovatie" (NSRF 2014-2020) en medegefinancierd door Griekenland en de EU.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| µ-Slide 8 Well | Ibidi | 80826 | Imaging slides |
| 4-Aminobenzoic acid | Merck | A9878 | |
| azhAΔ ngnAΔ | Genotype: zhAΔ::pyrGAf; ngnAΔ::pyrGAf; pyroA4 pantoB100 / References:Laboratory collection, Athanasopoulos et al., 2013 | ||
| Bacto Casamino Acids | Gibco | 223030 | |
| Biotin | Merck | B4639 | |
| Chloroform | Merck | 67-66-3 | |
| Copper(II) sulfate pentahydrate | Merck | C8027 | |
| Glucose | Merck | G8270 | |
| GraphPad Prism 8.0 | GraphPad Software | Statistical Software | |
| ImageJ | NIH | Image processing and analysis software | |
| Inoculating Loop | Merck | I8263-500EA | |
| Iron(III) phosphate | Merck | 1.03935 | |
| Leica Application Suite X | Leica Microsystems | Microscope software | |
| Magnesium sulfate heptahydrate | Merck | 63138 | |
| Manganese(II) sulfate monohydrate | Merck | M7899 | |
| Microscope Leica TCS SP8 | Leica Microsystems | ||
| Nicotinamide (Niacinamide) | Supelco | 47865-U | |
| Peptone | Millipore | 68971 | |
| Petri Dishes for Microbiology Culture | KISKER | G090 | |
| Potassium chloride | Merck | P4504 | |
| Potassium phosphate monobasic | Merck | P5655 | |
| Pyridoxine hydrochloride | Merck | P6280 | |
| Quali - Microcentrifuge Tubes, 1,7 mL, DNase-, RNase and pyrogen free, sterile | KISKER | G052-S | |
| Quali - Microcentrifuge Tubes, 2.0 mL, sterile | KISKER | G053-S | |
| Quali - Standard Tips, Bevelled, 100-1000 µL | KISKER | VL004G | |
| Quali - Standard Tips, Bevelled, 1-200 µL | KISKER | VL700G | |
| Quali Microvolume Tips, DNase-, RNase free, 0,1-10 µL/clear | KISKER | GC.TIPS.B | |
| Riboflavin (B2) | Supelco | 47861 | |
| Scalpel blades NO. 11 | OdontoMed2011 | S2771 | |
| Sodium chloride | Merck | S7653 | |
| Sodium hydroxide | Merck | S8045 | |
| Sodium tetraborate decahydrate | Merck | S9640 | |
| VS151 (PilA-GFP and H1-mRFP) | Genotype: pyrG89; pilA::sgfp::AfpyrG+ argB2 nkuAΔ::argB+ pyroA4 hhoA::mrfp::Afribo+ riboB2 / References:Laboratory collection, Biratsi et al., 2021 | ||
| WT | Genotype: nkuAΔ::argB; pyrG89; pyroA4;pyrG89 / References: TN02A3 -FGSC A1149 | ||
| Yeast Extract | Millipore | 70161 | |
| ZnSO4 |
References
- Kumar, A. Aspergillus nidulans: A Potential Resource of the Production of the Native and Heterologous Enzymes for Industrial Applications. International Journal of Microbiology. 2020, 8894215 (2020).
- Kück, U., Bloemendal, S., Teichert, I. Putting Fungi to Work: Harvesting a Cornucopia of Drugs, Toxins, and Antibiotics. PLoS Pathogens. 10 (3), (2014).
- Paterson, R. R. M., Lima, N. Filamentous Fungal Human Pathogens from Food Emphasising Aspergillus, Fusarium and Mucor. Microoraganism. 5 (3), (2017).
- Wang, C., Wang, S. Insect Pathogenic Fungi: Genomics, Molecular Interactions, and Genetic Improvements. Annual Review of Entomology. 62, 73-90 (2017).
- Etxebeste, O., Espeso, E. A. Aspergillus nidulans in the post-genomic era: a top-model filamentous fungus for the study of signaling and homeostasis mechanisms. International Microbiology. 23 (1), 5-22 (2020).
- Riquelme, M., et al. Fungal Morphogenesis, from the Polarized Growth of Hyphae to Complex Reproduction and Infection Structures. Microbiology and Molecular Biology Reviews MMBR. 82 (2), (2018).
- Athanasopoulos, A., André, B., Sophianopoulou, V., Gournas, C.
- Pantazopoulou, A., Peñalva, M. A. Organization and Dynamics of the Aspergillus nidulans Golgi during Apical Extension and Mitosis. Molecular Biology of the Cell. 20 (20), 4335-4347 (2009).
- Bayram, Ö, Feussner, K., Dumkow, M., Herrfurth, C., Feussner, I., Braus, G. H. Changes of global gene expression and secondary metabolite accumulation during light-dependent Aspergillus nidulans development. Fungal Genetics and Biology. 87, 30-53 (2016).
- Yu, J. -H. Regulation of Development in Aspergillus nidulans and Aspergillus fumigatus. Mycobiology. 38 (4), 229-237 (2010).
- Tomkins, R. G. Measuring growth: The petri dish method. Transactions of the British Mycological Society. 17 (1-2), 150-153 (1932).
- Gifford, D. R., Schoustra, S. E. Modelling colony population growth in the filamentous fungus Aspergillus nidulans. Journal of Theoretical Biology. 320, 124-130 (2013).
- Kasprowicz, R., Suman, R., O'Toole, P. Characterising live cell behaviour: Traditional label-free and quantitative phase imaging approaches. The International Journal of Biochemistry & Cell Biology. 84, 89-95 (2017).
- Aknoun, S., et al. Quantitative phase microscopy for non-invasive live cell population monitoring. Scientific Reports. 11, (2021).
- Chessel, A., Carazo Salas, R. E. From observing to predicting single-cell structure and function with high-throughput/high-content microscopy. Essays in Biochemistry. 63 (2), 197-208 (2019).
- Todd, R. B., Davis, M. A., Hynes, M. J. Genetic manipulation of Aspergillus nidulans: meiotic progeny for genetic analysis and strain construction. Nature Protocols. 2 (4), 811-821 (2007).
- Hickey, P. C., Swift, S. R., Roca, M. G., Read, N. D. Live-cell Imaging of Filamentous Fungi Using Vital Fluorescent Dyes and Confocal Microscopy. Methods in Microbiology. 34, 63-87 (2004).
- Trinci, A. P. J. A Kinetic Study of the Growth of Aspergillus nidulans and Other Fungi. Journal of General Microbiology. 57 (1), 11-24 (1969).
- Lichius, A., Zeilinger, S. Application of Membrane and Cell Wall Selective Fluorescent Dyes for Live-Cell Imaging of Filamentous Fungi. Journal of Visualized Experiments. (153), e60613 (2019).
- Oomen, L. C. J. M., Sacher, R., Brocks, H. H. J., Zwier, J. M., Brakenhoff, G. J., Jalink, K. Immersion oil for high-resolution live-cell imaging at 37°C: optical and physical characteristics. Journal of Microscopy. 232 (2), 353-361 (2008).
- Distel, M., Köster, R. In Vivo Time-Lapse Imaging of Zebrafish Embryonic Development. CSH protocols. 2007, (2007).
- Walzik, M., et al. A portable low-cost long-term live-cell imaging platform for biomedical research and education. Biosensors and Bioelectronics. 64, (2014).
- Frigault, M. M., Lacoste, J., Swift, J. L., Brown, C. M. Live-cell microscopy - tips and tools. Journal of Cell Science. 122 (6), 753-767 (2009).
- North, A. J. Seeing is believing? A beginners' guide to practical pitfalls in image acquisition. The Journal of Cell Biology. 172 (1), 9-18 (2006).
- Schindelin, J., et al. Fiji: an open-source platform for biological-image analysis. Nature Methods. 9 (7), 676-682 (2012).
- Miura, K. Bleach correction ImageJ plugin for compensating the photobleaching of time-lapse sequences. F1000Research. 1000, 1494 (2020).
- Meijering, E., Dzyubachyk, O., Smal, I. Methods for Cell and Particle Tracking. Methods in Enzymology. 504, 183-200 (2012).
- Strovas, T. J., Lidstrom, M. E. Population heterogeneity in Methylobacterium extorquens AM1. Microbiology. 155, Pt 6 2040-2048 (2009).
- Biratsi, A., Athanasopoulos, A., Kouvelis, V. N., Gournas, C., Sophianopoulou, V. A highly conserved mechanism for the detoxification and assimilation of the toxic phytoproduct L-azetidine-2-carboxylic acid in Aspergillus nidulans. Scientific Reports. 11 (1), 7391 (2021).
- Athanasopoulos, A., Boleti, H., Scazzocchio, C., Sophianopoulou, V. Eisosome distribution and localization in the meiotic progeny of Aspergillus nidulans. Fungal Genetics and Biology. 53, 84-96 (2013).
- Vangelatos, I., Roumelioti, K., Gournas, C., Suarez, T., Scazzocchio, C., Sophianopoulou, V. Eisosome Organization in the Filamentous AscomyceteAspergillus nidulans. Eukaryotic Cell. 9 (10), 1441-1454 (2010).
- Athanasopoulos, A., Gournas, C., Amillis, S., Sophianopoulou, V. Characterization of AnNce102 and its role in eisosome stability and sphingolipid biosynthesis. Scientific Reports. 5 (1), (2015).
- Peñalva, M. A. Tracing the endocytic pathway of Aspergillus nidulans with FM4-64. Fungal Genetics and Biology. 42 (12), 963-975 (2005).
- Versari, C., et al. Long-term tracking of budding yeast cells in brightfield microscopy: CellStar and the Evaluation Platform. Journal of The Royal Society Interface. 14 (127), 20160705 (2017).
- Adams, T. H., Wieser, J. K., Yu, J. -H.
- Lagree, K., Desai, J. V., Finkel, J. S., Lanni, F.
- Brunk, M., Sputh, S., Doose, S., van de Linde, S., Terpitz, U. HyphaTracker: An ImageJ toolbox for time-resolved analysis of spore germination in filamentous fungi. Scientific Reports. 8 (1), 1-13 (2018).
- Baum, T., Navarro-Quezada, A., Knogge, W., Douchkov, D., Schweizer, P., Seiffert, U. HyphArea-Automated analysis of spatiotemporal fungal patterns. Journal of Plant Physiology. 168 (1), 72-78 (2011).
- Barry, D. J., Williams, G. A., Chan, C. Automated analysis of filamentous microbial morphology with AnaMorf. Biotechnology Progress. 31 (3), 849-852 (2015).
