Determinação Analítica da Função Mitocondrial de Homogeneiza tumor sólido excisado

Summary

Desenvolvemos um protocolo prático e abordagem analítica para avaliar a fosforilação oxidativa mitocondrial e a capacidade de transferência de elétrons em homogeneizadores de tumores frescos. Este protocolo pode ser facilmente adaptado para levantamento de várias funções mitocondriais que contribuem para a iniciação do câncer, progressão e resposta ao tratamento.

Abstract

Mitocôndrias são essenciais para o início e progressão do câncer através da produção de energia, regulação reativa de espécies de oxigênio e síntese macromolécula. Adaptações genéticas e funcionais de mitocôndrias ao ambiente tumoral impulsionam o potencial proliferativo e metastático. O advento do sequenciamento de DNA e RNA removeu barreiras críticas à avaliação de mediadores genéticos da tumorigênese. No entanto, até o momento, as abordagens metodológicas para avaliar a função mitocondrial tumoral permanecem evasivas e requerem proficiência técnica limitando a viabilidade, diminuindo o valor diagnóstico e prognóstico tanto em ambientes experimentais quanto clínicos. Aqui, descrevemos um método simples e rápido para quantificar as taxas de fosforilação oxidativa (OXPHOS) e capacidade de transferência de elétrons (ET) em homogeneiza tumores sólidos recém-extirpados usando respirometria de alta resolução. O protocolo pode ser aplicado de forma reprodutivelmente entre espécies e tipos de tumores, bem como adaptado para avaliar uma diversidade de vias et mitocondriais. Usando este protocolo, demonstramos que camundongos portadores de câncer mamário B luminal apresentam respiração ligada à dinucleotida de nicotinamida defeituosa e dependência de succinato para gerar triptofato de adenosina via OXPHOS.

Introduction

Todas as células estão intimamente ligadas à sua necessidade de produzir e consumir triphosfato de adenosina (ATP), a moeda de energia molecular. Como as mutações celulares dão origem à formação de tumores, as mitocôndrias garantem a sobrevivência através da diversificação da produção de energia que muitas vezes é fenotipicamente distinguível do tecido não cancerígeno^1,2,3. Como tal, há uma necessidade crítica de perfil rápido e profundo da função respiratória mitocondrial, a fim de facilitar a classificação do tipo de tumor, iniciação do câncer, progressão e resposta ao tratamento.

Funções respiratórias de amostras de tecido excisado não podem ser avaliadas intactas, pois os substratos primários para OXPHOS não são permeáveis por células. Para superar essa limitação, as mitocôndrias podem ser preparadas por isolamento, permeabilização química ou homogeneização mecânica. O isolamento mitocondrial é considerado um padrão-ouro para a avaliação da função respiratória. No entanto, requer grandes quantidades de tecido, é demorado, e é de baixo rendimento com possível viés de seleção para certas frações de mitocôndrias⁴. A permeabilização consiste na separação mecânica e exposição de seções teciduais ou feixes de fibras a um detergente suave que degrada seletivamente a membrana plasmática⁵. A permeabilização é frequentemente empregada em tecidos estriados, como músculo esquelético e cardíaco, pois os feixes individuais de fibras podem ser provocados à parte. Em comparação com o isolamento, a permeabilização produz mais mitocôndrias em seu ambiente celular nativo e forma física⁵. A permeabilização tem sido aplicada com sucesso em outros tecidos como tumor^6,7 e placenta⁸; no entanto, a reprodutibilidade das preparações de fibras permeabilizadas pode ser difícil devido à consistência dos requisitos de dissecção e oxigênio para superar as limitações de difusão⁹. Além disso, as fibras permeabilizadas podem ser inadequadas em certos tipos de tumores que são densamente celulares e altamente fibrosos. Os homogeneizadores teciduais são gerados através da interrupção mecânica da membrana plasmática e são semelhantes às fibras permeabilizadas em termos de rendimento mitocondrial e^{integridade 10}. Os homogeneizadores teciduais também minimizam as limitações da difusão de oxigênio e podem ser facilmente empregados entre os tipos de tecidos através da otimização da força mecânica^11,12.

Aqui, delineamos um método simples e rápido para quantificar as taxas de fosforilação oxidativa (OXPHOS) e capacidade de transferência de elétrons (ET) em homogeneizadores de tumores sólidos recém-extirpados. O protocolo é projetado para avaliar o tecido fresco usando o respirômetro de alta resolução oxygraph-2k (O2k), que requer conhecimento prévio de configuração instrumental e calibração, mas pode ser adaptado da mesma forma usando qualquer eletrodo do tipo Clark, analisador de cavalo marinho ou leitor de placas. O protocolo pode ser aplicado de forma reprodutivelmente entre espécies e tipos de tumores, bem como adaptado para avaliar uma diversidade de vias et mitocondriais.

Protocol

Todos os experimentos e procedimentos envolvendo animais foram aprovados pelo Pennington Biomedical Research Center Institutional Animal Care and Use Committee.

1. Preparação do reagente.

1. Prepare a mídia de crescimento celular EO771 com HEPES de 10 mM, 10% soro bovino fetal (FBS), 1% penicilina-estreptomicina (100 U/mL) e 0,2% anfotericina B.
2. Prepare 1 L de solução de preservação da biópsia (BIÓPSia) em um copo de vidro de 1000 mL.
   1. Adicione 3.180 g de NA₂ATP (concentração final de 5,77 mM).
   2. Adicionar 1.334 g de MgCL₂·6H₂O (concentração final de 6,56 mM).
   3. Adicione 2,502 g de Taurina (concentração final de 20 mM).
   4. Adicione 3,827 g de Na₂Phosphocreatine (concentração final de 15 mM).
   5. Adicione 1,362 g de Imidazol (concentração final de 20 mM).
   6. Adicione 0,077 g de Dithiothreitol (concentração final de 0,5 mM).
   7. Adicione 9,76 g de hidratação MES (concentração final de 50 mM).
   8. Adicione 800 mL de H₂O e misture os constituintes usando um agitador magnético a 30 °C.
   9. Adicione 72,3 mL de 100 mM K₂EGTA (concentração final de 7,23 mM).
      1. Dissolver 7.608 g de EGTA e 2,3 g de KOH em 100 mL de H₂O.
      2. Ajuste o pH para 7.0 com 5 M KOH e leve o volume até 200 mL com H₂O.
   10. Adicione 27,7 mL de 100 mM CaK₂EGTA (concentração final de 2,77 mM).
       1. Dissolva 7,608 g de EGTA em 200 mL de H₂O e aqueça a 80 °C (concentração final de 100 mM).
       2. Dissolver 2.002 g de CaCO₃ em 200 mL de solução quente de 100 mM EGTA.
       3. Ao mexer continuamente, adicione 2,3 g de KOH e ajuste o pH para 7,0.
   11. Ajuste o pH para 6,75 a 23 °C (pH 7.1 a 0 °C) com 5 M KOH. Leve o volume até 980 mL com H₂O e misture a solução. Verifique o pH mais uma vez, ajuste se necessário e leve o volume final até 1000 mL com água.
   12. Bióps de 20%em tubos cônicos (15 mL ou 50 mL) e armazenar a -20 °C até usar. Só descongele uma vez, pouco antes do uso.
3. Prepare 1 L de meio de respiração mitocondrial (MiR05) em um copo de vidro de 1000 mL.
   1. Adicionar 0,190 g de EGTA (concentração final de 0,5 mM).
   2. Adicione 0,610 g de MgCL₂·6H₂O (concentração final de 3 mM).
   3. Adicione 2,502 g de Taurina (concentração final de 20 mM).
   4. Adicione 1,361 g de KH₂PO₄ (concentração final de 10 mM).
   5. Adicione 4,77 g de HEPES (concentração final de 20 mM).
   6. Adicione 37,65 g de D-Sacarose (concentração final de 110 mM).
   7. Adicione 800 mL de H₂O e misture os constituintes usando um agitador magnético a 30 °C.
   8. Adicione 120 mL de ácido lactobiônico de 0,5 M (concentração final de 60 mM).
      1. Dissolva 35,83 g de ácido lactobiônico em 100 mL de H₂O.
      2. Ajuste o pH para 7.0 com 5 M KOH e traga volume de até 200 mL com H₂O.
   9. Misture a solução e ajuste o pH para 7.1 com 5 M DE KOH.
   10. Pesar 1 g de BSA, essencialmente livre de ácidos graxos (1 g/L de concentração final), em um tubo cônico de 50 mL. Adicione 40 mL da solução pH 7.1 da etapa 9 ao tubo, inverta suavemente para misturar e evite espumar. Transfira o BSA dissolvido para a solução pH 7.1 restante a partir da etapa 9 e mexa suave e continuamente. Verifique o pH mais uma vez, ajuste se necessário e leve o volume final até 1000 mL com H₂O.
   11. Aliquot o meio MiR05 em tubos cônicos de 50 mL e armazene a -20 °C até usar. Só descongele uma vez, pouco antes do uso.
4. Prepare substratos, desacopladores e inibidores.
   1. Prepare 0,8 M Malate: Dissolva 536,4 mg de ácido L-Malico em 4 mL de H₂O. Neutralize com 5 M KOH para pH 7 e leve o volume até 5 mL com H₂O. Divida em alíquotas e depois armazene a -20 °C.
   2. Prepare 1 M Piruvato: Dissolva 550 mg de sal de sódio ácido piruvico em 4 mL de H₂O. Neutralize com 5 M KOH para pH 7 e leve o volume até 5 mL com H₂O. Divida em alíquotas e depois armazene a -20 °C.
   3. Prepare 0,5 M ADP (adenosina 5′-difosfato): Dissolver 1,068 g de sal de sódio ADP em 4 mL de H₂O. Neutralizar com 5 M KOH para pH 7 e trazer o volume até 5 mL com H₂O. Divida em alíquotas e depois armazene a -20 °C.
   4. Prepare 2 M Glutamato: Dissolva 3,7426 g de monohidrato de ácido L-glutamico em 8 mL de H₂O. Neutralize com 5 M KOH a pH 7 e leve o volume até 10 mL com H₂O. Divida em alíquotas e depois armazene a -20 °C.
   5. Prepare 4 mM Cytochrome c: Dissolva 50 mg de Cytochrome c em 1 mL de H₂O. Divida em alíquotas e depois armazene a -20 °C.
   6. Prepare 1 M Succinato: Dissolva 2,701 g de hexahidrato de sal de succinato em 8 mL de H₂O. Neutralize com 1 N HCl a pH 7 e leve o volume até 10 mL com H₂O. Divida em alíquotas e depois armazene a -20 °C.
   7. Prepare 1 mM FCCP (cianeto carbonil-4-(trifluorometoxy)fenilhydrazone): Dissolver 2,54 mg de FCCP em 10 mL de etanol puro. Divida em alíquotas e, em seguida, armazene a -20 °C.
   8. Prepare 150 μM Rotenone: Dissolva 3,94 mg de Rotenone em 10 mL de etanol puro para preparar 1 mM de estoque, vórtice até totalmente dissolvido. Diluir 225 μL de concentração de estoque rotenone de 1 mM com 1,275 mL de etanol puro para fazer 1,5 mL de 150 μM Rotenone. Proteja contra a luz, divida em alíquotas e, em seguida, armazene a -20 °C.
   9. Prepare 125 μM Antimicina A: Dissolva 11 mg de Antimicina A em 4 mL de etanol puro para preparar 5 mM de concentração de estoque de Antimicina A. Diluir 25 μL de 5 mM De mm antimicina Uma concentração de estoque com 975 μL de etanol puro para fazer 1 mL de 0,125 mM Antimicina A. Divida em alíquotas e depois armazene a -20 °C.
   10. Prepare 0,8 M Ascorbate: Dissolva 1.584 g de sal de sódio Ascorbate em 8 mL de H₂O. Ajuste o pH com ácido ascórbico para pH 6 e leve o volume até 10 mL com H₂O. Proteja da luz, divida em alíquotas e depois armazene a -20 °C.
   11. Prepare 0,2 M TMPD (tetrametil-p-fenilediamina): Dissolva 32,85 mg de TMPD em 987,5 μL de DMSO. Adicione 12,5 μL de 0,8 M de ascorbate (concentração final de 10 mM de ascorbate). Proteja contra a luz, divida em alíquotas e, em seguida, armazene a -20 °C.
   12. Prepare 4 M de azida de sódio: Dissolva 2,6 g de Azide de Sódio em 10 mL de H₂O. Divida em alíquotas e armazene a -20 °C.

2. Crescimento do tumor

1. Cresça células EO771 em mídia de crescimento RPMI 1640 e mantenha as células em uma incubadora umidificada de 37 °C com 5% de CO₂.
2. Camundongos C57BL/6J femininos de quatro semanas de idade, mantenham-nos a 21-22 °C em uma luz de 12 h: ciclo escuro. Forneça aos ratos acesso a ad libitum a comida e água.
3. Uma vez que os camundongos atinjam 10 semanas de idade, prepare as células e os camundongos para a implantação de células cancerosas.
   1. Trypsinize as células, desative a trippsina com a mídia de crescimento e as células centrífugas a 500 x g por 5 minutos à temperatura ambiente. Aspire o supernatante e resuspend e combine as pelotas de célula (conforme necessário) na mídia. Conte células viáveis usando azul trypan e prepare uma diluição celular de 1 x 10⁶ células em um volume total de 60 μL com uma solução 1:1:1 Media/ Basement Membrane Matrix/PBS. Uma vez adicionada a matriz de membrana do porão, misture bem e mantenha a suspensão celular no gelo. Encha as seringas com 60 μL de suspensão celular e coloque-as no gelo. Trabalhe eficientemente e injete células em camundongos dentro de 1,5 h de preparação.
   2. Anestesiar camundongos por inalação de isoflurane (3%-5% para indução e 1%-3% para manutenção). Raspe entre as glândulas mamárias inguinais direitas⁴ e 5. Ortotopicamente injete os camundongos anestesiados com a suspensão celular EO771.
4. Use pinças eletrônicas para monitorar e medir o crescimento do tumor duas vezes por semana durante 4 semanas. Na necropsia, exciso, pesagem e, em seguida, coloque o tumor (ou um mínimo de 60 mg de seção tumoral) imediatamente em 10 mL de BIÓPSia gelada. Mantenha o tubo no gelo molhado.

3. Configuração e calibração do instrumento

1. Aqueça o meio MiR05 em um banho de água de 37 °C.
2. Ligue o sistema Oroboros O2k, abra o software DATLAB, digite ou selecione Usuário. Clique em Conectar para O2k. Verifique a configuração do O2k e certifique-se de que o instrumento correto seja rotulado para Power-O2k e cada câmara corresponde ao sensor de oxigênio correto; clique em OK. Uma vez que a janela de controle O2k se abra, sob a guia Sistemas, defina a Temperatura do Bloco para 37 °C, a velocidade do Agitador para 750 rpm para ambas as câmaras, ND o intervalo de gravação de dados para 2.0 s. Verifique tanto o Poder do Agitador quanto a Iluminação nas caixas de câmara. Na aba Oxigênio, O2, defina o Gain for Sensor para 1 V/μA (o ganho pode precisar ser ajustado para modelos de instrumentos mais antigos), a Tensão de Polarização para 800 mV e, em seguida, clique em Conectar a O2k. Uma vez que um novo arquivo de experimento seja aberto, nomeie o arquivo e clique em Salvar. Uma vez que o experimento esteja ativo, uma janela de seleção de protocolo será aberta; clique em Cancelar para executar um SUIT personalizado (titulação inibidora de desacoplador substrato).
3. Após a seleção do protocolo, uma janela de amostra será aberta para preencher o código experimental, tipo de amostra, coorte, código de amostra, número de amostra e número de subsample, conforme aplicável. Atribuir a unidade a mg e inserir a concentração de homogeneizar tumores por mL (quantidade por câmara irá preencher automaticamente). Certifique-se de que o medium indicado é MiR05 e o volume da câmara é de 2,00 mL. Adicione comentários conforme necessário na caixa inferior e clique em OK.
4. Retire as rolhas e aspire o etanol de 70% das câmaras. Nunca aspire perto da membrana que está exposta no interior da câmara. Enxágüe quatro vezes com água pura e encha a câmara com 2,25 mL de MiR05.
5. Teste do sensor: Clique no F9 para desligar os agitadores por 30 s. Uma vez que a barra do agitador ligue novamente, certifique-se de que a inclinação O₂ aumente rapidamente monoexponencialmente em cada câmara. Se a câmara falhar no teste do sensor, verifique as conexões elétricas e limpe se os sais tiverem acumulado; repetir o teste. Se o sensor continuar a falhar no teste, remova o conector do sensor de oxigênio polarográfico (POS) para inspecionar a membrana. Se forem observados danos visíveis à membrana, oxidação pesada ou acúmulo significativo de bolhas, interrompa os procedimentos experimentais e prossiga para a manutenção do instrumento.
6. Calibração de oxigênio: Realize a calibração do oxigênio para obter medições precisas de respiração.
   1. Com um movimento de torção, insira as rolhas lentamente à sua posição calibrada de volume. Sifão fora do excesso médio ejetado através da injeção capilar que coleta no poço da rolha. Com um movimento de torção, levante as rolhas apenas o suficiente para encaixar firmemente a ferramenta de esguiçado deixando um volume de gás acima da fase líquida para o equilíbrio final do ar (30-45 min.).
   2. Use o estado estável alcançado ao longo deste período para calibrar o sensor de oxigênio para obter medições precisas da respiração. A inclinação O₂ neg. (inclinação negativa de oxigênio) é 0 ± 2 pmol/s·mL. Se o valor for superior a 2 pmol/s·mL, limpe a câmara e reabastenha-a com MiR05 descongelado recentemente. Se a inclinação estiver instável, proceda à manutenção de instrumentos.
   3. Depois de alcançar um estado estável, selecione a curva de concentração O₂ e destaque a região estável da curva, segurando a tecla shift e o botão do mouse com clique esquerdo. Uma vez selecionada a região, clique em F5, selecione a marca para calibração de ar com a seta de saída e clique em Calibrar e copie para a área de transferência.
7. Calibração de fundo instrumental (opcional)
   1. Após a calibração do ar, certifique-se de que não há volume de gás acima da fase líquida para equilíbrio de fundo de fluxo (~15 min) e feche totalmente as câmaras.
      NOTA: A taxa de estado estável alcançada ao longo desse período representa um fundo instrumental e pode ser subtraída dos dados resultantes para maior precisão analítica. A inclinação O₂ vai inicialmente aumentar ligeiramente e planalto entre ± de 2 a 4 pmol/s·mL.
   2. Se o valor for alto (>6 pmol/s·mL), há potencial contaminação biológica. Neste caso, limpe a câmara e reabastenha-a com MiR05 recém-descongelado. Uma vez alcançado um estado estável, selecione a curva de inclinação O₂ e destaque a região estável da curva segurando a tecla Shift e o botão do mouse com clique esquerdo.
   3. Depois de selecionar a região, clique em F5, selecione a Caixa de Correção da Linha de Base e a marca para Linha de Base com a seta de gotícula e clique em OK.

4. Preparação homogênea do tumor

1. Coloque um homogeneizador de vidro contendo 1 mL de MiR05 e um pilão de vidro bem ajustado no gelo molhado.
2. No momento do estudo, coloque o tecido em 1 mL de BIÓPS em uma placa de Petri gelada.
3. Limpe e disseca o tecido para maximizar o material solúvel, evitar regiões necróticas e remover tecido tumoral marginal. Utilizando um microscópio de dissecção, bisturi e pinça cirúrgica, remova qualquer cabelo, tecido necrosado, tecido conjuntivo periférico e vascular, e gordura adjacente, conforme aplicável. Tome cuidado para manter o tumor em BIÓPS gelado durante a dissecção.
4. Corte o tumor em pequenos pedaços (~5-10 mg cada) e coloque os pedaços restantes do tumor de volta em 10 mL de BIOPS mantidos no gelo. Use este tecido mais tarde para preparações adicionais, se necessário.
   NOTA: Execute as seguintes etapas rapidamente para minimizar a quantidade de tempo que a amostra não está totalmente submersa no BIOPS. Uma vez que a amostra é colocada em MiR05, o tempo é essencial. Mova cuidadosamente o homogeneizar preparado para a câmara calibrada o mais rápido possível.
5. Borrihe as seções teciduais cuidadosamente em um papel filtro, coloque-as em um pequeno barco de pesagem de plástico e registre o peso molhado inicial. Coloque as peças nãoutiladas de volta no tubo cônico de 10 mL de BIOPS para preservação contínua.
6. Submerque as seções teciduais em um homogeneizador gelado contendo MiR05 e regise o peso restante no barco de pesagem, se aplicável.
7. Usando um pilão de vidro (faixa de despejo 0,09-0,16 mm), interrompa suavemente o tecido tumoral completando 5-7 traços para baixo e para cima. Para cada traçado, gire o pilão em um movimento no sentido anti-horário 3 vezes enquanto empurra o pilão para baixo e 3 vezes adicionais enquanto puxa o pilão de volta para cima. Certifique-se de permitir que o tecido se acomode na parte inferior do homogeneizador entre os derrames, mas evite trazer o pilão totalmente acima do volume do fluido para evitar espuma.
   NOTA: A homogeneidade resultante deve parecer nublada com remanescentes mínimos de tecido sólido.
8. Despeje o homogeneizar em um tubo cônico de 15 mL e coloque-o no gelo.
9. Pipeta 1-3 mL de MiR05 fresco sobre o pilão e para o homogeneizador para lavar qualquer tecido restante homogeneizado. Despeje a lavagem miR05 no tubo cônico contendo o homogeneizar. Repita a lavagem do pilão e do homogeneizador 2-3 vezes para garantir a transferência completa do homogeneizado. Tenha em mente a concentração do alvo e o volume necessário para não diluir demais a amostra durante as etapas de lavagem.
10. Para calcular com precisão a concentração homogeneizada do tecido, inspecione cuidadosamente o homogeneizador e o homogeneizado para o material não homogeneizado restante (ou seja, tecido conjuntivo).
    1. Para remover o material não homogeneizado do homogeneizador que não pode ser alcançado com pinças, adicione MiR05 ao homogeneizador, aspire o volume (incluindo o tecido) com uma pipeta e mova o conteúdo para uma placa de Petri.
    2. Para remover o material não homogeneizado do homogeneizado (instalado em pedaços grandes na parte inferior do tubo cônico), aspire as peças grandes com uma pipeta e coloque-as na tampa tecidual do tubo cônico.
    3. Remova o tecido da placa de petri ou da tampa cônica do tubo com pinças e borre-o no papel do filtro. Adicione o homogeneizar restante da tampa cônica do tubo de volta no tubo cônico, tampe-o e, em seguida, inverta para misturar.
    4. Inspecione os homogeneizadores e homogeneize-se para qualquer material não homogeneizado adicional e repita as etapas 4.10.1-4.10.3 para remover o material conforme necessário.
11. Pese e registe a massa do material não homogeneizado recuperado do homogeneizador. Inspecione a preparação homogênea para qualquer tecido grosseiramente intacto transferido. Remova as peças não homogeneizadas e pese conforme necessário.
12. Subtrair o peso tecidual recuperado do barco de pesagem, homogeneizador e homogeneizar (se necessário) do peso molhado inicial para calcular o peso amostral final.
13. Utilizando o peso amostral final, adicione MiR05 adicional para trazer homogeneização à concentração desejada (veja o passo 5 para detalhes sobre experimentos de otimização).
14. Uma vez que a homogeneidade seja ponderada e preparada, proceda ao ensaio o mais rápido possível. Mantenha a amostra armazenada em gelo molhado até que seja transferida para o instrumento.

5. Substrato, desacoplador, protocolo de titulação inibidor (SUIT)

1. Uma vez calibrado o instrumento, e a amostra é preparada, remova as rolhas com um movimento de torção e aspire o MiR05 das câmaras (evitando a membrana exposta dentro da câmara). Misture bem a homogeneizar e adicione 2,25 mL do homogeneizar à câmara. Se adicionar uma homogeneizar a várias câmaras, pipeta 1 mL de cada vez em cada câmara, ao mesmo tempo em que mistura o homogeneizado para garantir a distribuição igualitária do tecido. Clique em F4 para nomear e carimbar o evento e, em seguida, clique em OK.
2. Encha uma seringa de 50 mL com oxigênio de um tanque de oxigênio com um regulador e tubos de gás usando uma agulha de 18 G. Hiperoxigenar as câmaras a ~500 μM de oxigênio. Para isso, injete oxigênio diretamente nas câmaras. Insira livremente as rolhas e espere fechar até que o oxigênio atinja ~480 μM. Com um movimento de torção, feche lentamente a câmara e permita que a respiração se equilibre (~15-20 min). Encha o capilar central da rolha com MiR05, se necessário.
3. Determinação analítica da capacidade oxphos e ET (estado de transferência de elétrons) da atividade n-ligada e ns-linked e CIV (Complex IV): Usar microsyringes dedicados para injetar substratos, desacopladores e inibidores em câmaras totalmente fechadas. Clique em F4 com cada injeção para nomear e marcar os eventos para cada câmara em tempo real. Ao longo do estudo, selecione F6 para ajustar a concentração de O₂ e as escamas de inclinação O_2, conforme necessário. Após cada injeção, lave as seringas 3 vezes em água (para compostos solúveis em água) ou 70% de etanol (para compostos dissolvidos em etanol ou DMSO).
   NOTA: N-linked: O₂ flux suportado por combinações de substratos geradoras de NADH definidas, NS-linked: O₂ flux suportado pela convergência de combinações de substratos nadh-gerar e succinato definidos.
   1. Adicione 5 μL de 0,8 M Malate (concentração final de 2 mM) e prossiga imediatamente para a próxima injeção. Lave a seringa de injeção 3 vezes na água.
   2. Adicione imediatamente 5 μL de 1 M Pyrunato (concentração final de 2,5 mM) e aguarde a respiração para estabilizar. Lave a seringa de injeção 3 vezes na água.
   3. Adicione 10 μL de 0,5 M ADP (concentração final de 2,5 mM) e aguarde que a resposta ADP se estabilize. Lave a seringa de injeção 3 vezes na água.
      NOTA: Pode-se exigir que a ADP adicional (2,5-10 mM) seja necessária para garantir que as concentrações de adenilato não sejam limitantes aos fluxos respiratórios.
   4. Adicione 5 μL de 2 M glutamato (concentração final de 5 mM) e aguarde a respiração para estabilizar. Lave a seringa de injeção 3 vezes na água.
   5. Adicione 5 μL de 4 mM Cytocroome c (concentração final de 10 μM) e aguarde a respiração estabilizar. Lave a seringa de injeção 3 vezes na água.
   6. Adicione 20 μL de 1 M Succinato (concentração final de 10 mM) e aguarde a respiração para estabilizar. Lave a seringa de injeção 3 vezes na água.
   7. Titule 0,5-1 μL incrementos de 1 mM FCCP (concentração final de 2-20 μM) e aguarde que a respiração se estabilize após cada injeção, continue até que não haja aumento adicional na respiração. Lave a seringa de injeção 3 vezes em 70% de etanol.
   8. Adicione 2 μL de 150 μM Rotenone (concentração final de 150 nM-2 μM) e aguarde a respiração estabilizar. Adicione mais 1 μL de Rotenone para garantir que não haja mais inibição. Se houver diminuição da respiração, continue com injeções adicionais até que não haja diminuição na respiração. Lave a seringa de injeção 3 vezes em 70% de etanol.
   9. Adicione 2 μL de 125 μM Antimicina A (concentração final de 125 nM-5 μM) e aguarde a respiração estabilizar. Adicione mais 1 μL de Antimicina A para assegurar que não há mais inibição. Se houver diminuição da respiração, continue com injeções adicionais até que não haja diminuição na respiração. Lave a seringa de injeção 3 vezes em 70% de etanol.
   10. Verifique a concentração de oxigênio da câmara; se a concentração estiver abaixo de 125 μM, reoxigenar ao ar ambiente ou levemente hiperoxigenato para garantir que o oxigênio não limite o fluxo respiratório. Adicione 5 μL de 0,8 M Ascorbate (concentração final de 2 mM). Lave a seringa de injeção 3 vezes em 70% de etanol.
   11. Adicione imediatamente 10 μL de 0,2 M TMPD (concentração final de 1 mM) espere por um aumento lento na respiração. Lave a seringa de injeção 3 vezes em 70% de etanol.
   12. Adicione 25 μL de 4 M de Azida de Sódio (concentração final de 50 mM) imediatamente quando o fluxo respiratório dos platôs ascorbate/TMPD. Lave a seringa de injeção 3 vezes em 70% de etanol.
   13. Final do estudo- clique em Arquivo, Salvar e Desconectar. Continue lavando a câmara e a seringa seguindo as etapas 9.2-9.3.

6. Protocolo de sensibilidade ADP

1. Uma vez calibrado o instrumento e a amostra é preparada, remova as rolhas com um movimento de torção e aspire o MiR05 das câmaras (evitando a membrana exposta no interior da câmara). Misture bem a homogeneizar e adicione 2,25 mL do homogeneizar à câmara. Suponha adicionar uma homogeneizar a várias câmaras, pipeta 1 mL de cada vez em cada câmara enquanto mistura o homogeneizado para garantir a distribuição igualitária do tecido. Clique em F4 para nomear e carimbar o evento e clique em OK.
2. Insira as rolhas e, com um movimento de torção, feche lentamente a câmara e permita que a respiração se equilibre (~15-20 min). Encha o capilar central da rolha com MiR05, se necessário.
3. Determinação analítica da sensibilidade ADP mitocondrial ligada ao succinato: Clique em F4 com cada injeção para nomear e marcar os eventos para cada câmara em tempo real. Ao longo do estudo, selecione F6 para ajustar a concentração de O₂ e as escamas de inclinação O_2, conforme necessário.
   1. Adicione 2 μL de 150 μM Rotenone (concentração final de 150 nM).
   2. Adicione imediatamente 20 μL de 1 M Succinato (concentração final de 10 mM) e aguarde a respiração para estabilizar.
   3. Titrate ADP por adição passo a passo de concentrações subsaturadas até atingir a taxa de resposta máxima (V_MAX; concentração final de 2,5-10 mM).
      NOTA: A taxa pode subir após a injeção devido a uma pequena mudança na concentração de ADP, aumentando assim a concentração de injeção após cada platô e continuar com a titulação até que não haja mais aumento na respiração mesmo com um aumento da dobra na concentração de injeção de ADP.

7. Experimentos de otimização recomendados

1. Determine a homogeneidade ideal e concentração de oxigênio para o protocolo.
   1. Execute o protocolo SUIT (etapas 5.1-5.3) em concentrações múltiplas de tecido (por exemplo, 30 mg/mL, 20 mg/mL, 10 mg/mL, 5 mg/mL, 2,5 mg/mL, 1 mg/mL e/ou 0,5 mg/mL).
   2. Selecione uma concentração que maximize o fluxo respiratório ao mesmo tempo em que limita a frequência de reoxigenações (não mais do que 1-2). Se forem necessárias reoxigenações mais frequentes, diminua a concentração do homogeneizar.
2. Determine o número ideal de derrames com o homogeneizador.
   1. Execute o protocolo SUIT (etapas 5.1-5.3) em múltiplos níveis de homogeneização (por exemplo, 5 traçados, 10 traçados, 15 tacadas, 20 traçados).
   2. Como há dados insuficientes na literatura para determinar um limiar do aumento percentual do citocromo c com preparação homo homogeneizada do tumor, escolha a preparação com resposta c citocromática limitada, mas respiração adequada energizada pelo substrato(s) de interesse.
3. Determine as concentrações de substrato, ADP, desacoplador e inibidora necessárias para fluxos respiratórios quantitativos e reprodutíveis.
   1. Realize o protocolo SUIT (etapas 5.1-5.3.9) na concentração de tecido escolhida (etapa 7.1). Titule cada substrato, desacoplador, inibidor e ADP até que nenhuma resposta adicional seja observada. Titular a inibição com azida de sódio em experimentos separados.
      1. Adicione 5 μL de 0,8 M Malate (concentração final de 2 mM) e prossiga imediatamente para a próxima injeção.
      2. Titule 1 μL incrementos de 1 M Piruvato e espere a respiração estabilizar após cada injeção, continue até que não haja aumento adicional na respiração.
      3. Titule 2 μL incrementos de 0,5 M ADP e espere a respiração estabilizar após cada injeção, continue até que não haja aumento adicional na respiração.
      4. Titule 1 μL incrementos de 2 M glutamato e espere que a respiração se estabilize após cada injeção, continue até que não haja aumento adicional na respiração.
      5. Adicione 5 μL de 4 mM Cytocroome c (concentração final de 10 μM) e aguarde a respiração estabilizar.
      6. Titule 5 μL incrementos de 1 M Succinato e espere que a respiração se estabilize após cada injeção, continue até que não haja aumento adicional na respiração.
      7. Titule 5 μL incrementos de 0,5 M ADP e espere a respiração estabilizar após cada injeção, continue até que não haja aumento adicional na respiração.
      8. Titule 0,5 μL incrementos de 1 mM FCCP e espere a respiração estabilizar após cada injeção, continue até que não haja aumento adicional na respiração.
      9. Titule 1 μL incrementos de 150 μM Rotenone e espere que a respiração se estabilize após cada injeção, continue até que não haja aumento na respiração.
      10. Titule 1 μL incrementos de 125 μM Antimicina A e espere a respiração estabilizar após cada injeção, continue até que não haja diminuição adicional na respiração.
      11. Adicione 5 μL de 0,8 M Ascorbate (concentração final de 2 mM).
      12. Adicione imediatamente 5 μL de 0,2 M TMPD (concentração final de 0,5 mM) espere por aumento lento na respiração. Em um experimento separado, adicione 10 μL de 0,2 M TMPD (concentração final de 1 mM).
      13. Em experimentos separados adicionam, 10 μL, 25 μL, 50 μL e 100 μL de 4 M de Azida de Sódio (20 mM, 50 mM, 100 mM, concentração final de 200 mM, respectivamente) imediatamente quando o fluxo respiratório dos platôs ascorbate/TMPD.
   2. Escolha as concentrações do substrato e do inibidor que estão saturando dentro da primeira injeção para melhorar o tempo do experimento. Use ADP em concentrações saturadas ou subsaturais para combinar avaliações de sensibilidade ADP com protocolos tradicionais de SUIT.
   3. Use concentrações sub-máximas de desacoplamento para demonstrar a responsividade da dose sem inibição do fluxo respiratório.

8. Análise de dados

1. Análise de TERNO
   1. Selecione as taxas de estado estável ou pico de cada titulação e exportação para redução analítica.
   2. Expresse os dados como pmol O₂ por segundo por mg de tecido (pmol/s/mg).
   3. Alcançar a redução analítica de PM-L, PM-P, PMG-P, PMGS-P e PMGS-E subtraindo a taxa insensível de antimicina A da respectiva taxa (ou seja, taxa estável obtida após a adição de ADP).
      NOTA: PM: Piruvato + Malate; PMG: Piruvato + Malato + Glutamato; PMGS: Piruvato + Malato + Glutamato + Succinato; -L:Estado de vazamento; -P: Estado de fosforilação oxidativa, -E: Estado de transferência de elétrons.
   4. Obtenha a redução analítica do CIV-E subtraindo a taxa insensível do azida de sódio a partir da taxa de ascorbate/TMPD.
   5. Alcançar a redução analítica do PMG-E subtraindo a taxa insensível rotenona da taxa PMGS-E.
   6. Alcançar a redução analítica do S-E subtraindo a taxa insensível antimicina A da taxa insensível rotenona.
   7. Alcançar a redução analítica da eficiência de controle do citocromo c, um marcador de intactidade da membrana externa, pela seguinte equação:
      _{j c} = ((J_CHNOc - J_CHNO)/J_CHNO) x 100
      Na equação, j_c é o % de aumento após a adição de citocromo c, J_CHNOc é o fluxo de oxigênio após a adição de citocromo c, e J_CHNO é o fluxo de oxigênio antes da adição de citocromo c.
2. Análise de sensibilidade ADP
   1. Determinar analiticamente a cinética para a sensibilidade ADP em relação à taxa de vazamento de succinato + rotenona (não a taxa do tecido homogeneizar).
   2. Plote o fluxo O₂ (eixo Y) contra a concentração relativa de ADP (eixo X). Determine a velocidade respiratória máxima (V_máx)conforme a taxa de pico alcançada sobre a titulação ADP.
   3. Determine a cinética Michaelis-Menten usando um software de montagem de curva (PRISM, versão 10.1) para revelar a concentração de ADP na qual 1/2 V_MAX é alcançado (Aparente K_M).

9. Controle de qualidade instrumental

1. Execute o fundo instrumental O₂ sobre a faixa de concentração de oxigênio desejada (0-600 μM) e zero calibração.
   1. Etapas completas 3.1 e 3.2
   2. Retire as rolhas e aspire o etanol de 70% das câmaras (evitando a membrana exposta no interior da câmara). Enxágüe 4 vezes com H₂O destilado duplo, e encha a câmara com 2,25 mL de MiR05
   3. Hiperoxigenar as câmaras a ~600 μM de oxigênio.
   4. Insira as rolhas lentamente à posição totalmente fechada. Sifão fora do excesso médio ejetado através da injeção capilar e coletado no poço da rolha e permitir que o sinal de oxigênio se estabilize (30-45 min).
   5. Para realizar a calibração do oxigênio, selecione a região onde a concentração de oxigênio e a inclinação estão estáveis, abra a janela de calibração para a respectiva câmara e selecione a marca R1.
   6. Prepare a solução de dithionita dissolvendo 20 mg de hidrossulfeto de sódio em 0,5 mL de água. Limitar a exposição ao ar como dithionita é oxidada ao longo do tempo com exposição ao oxigênio.
   7. Uma vez estabilizado o sinal de oxigênio, injete 1 μL e observe o declínio na concentração de oxigênio. Ajuste a potência da solução dithionita conforme necessário.
   8. Injete solução dithionita suficiente para diminuir a concentração de oxigênio para 450 μM, 300 μM, 225 μM, 150 μM, 75 μM e 0 μM, respectivamente. A cada injeção, permita que o oxigênio estabilize e selecione uma marca para a inclinação de estado estável. Uma vez que a concentração de oxigênio seja ~0 μM, marque a concentração de oxigênio.
   9. Para executar a correção instrumental O₂ de fundo, selecione a janela de fluxo/inclinação para a respectiva câmara, selecione Calibração de fundo O₂ e clique em Calibrar para obter as marcas de interesse.
   10. Para realizar a calibração zero, abra a janela de calibração para a respectiva câmara e selecione a marca R0 alcançada após a titulação de dithionite.
2. Limpeza de instrumentos
   1. Enxágue rapidamente cada câmara com água pura três vezes. Para a primeira lavagem, aspire a homogeneizar, encha a câmara totalmente com água e, em seguida, aspire a água. Para a segunda lavagem, encha a câmara 3/4 cheia de água, insira as rolhas para forçar a água através da injeção capilar, aspire um pouco da água através da capilar de injeção e, em seguida, remova as rolhas para aspirar a lavar completamente.
   2. Lave as câmaras com 70% de etanol por 5 min.
   3. Sobre uma pia ou béquer, limpe as rolhas com água pura, 70% etanol e 100% etanol, forçando o fluido através dos capilares de injeção usando uma garrafa de lavagem.
   4. Enxágue rapidamente cada câmara com água pura duas vezes.
   5. Incubar as câmaras com 2 mL de PBS contendo ~2 mg de mitocôndrias congeladas, lise celular ou fibroblastos vivos por 15 minutos.
   6. Lave as câmaras com água pura por 5 minutos e duas vezes.
   7. Lave as câmaras com 70% de etanol por 5 min duas vezes.
   8. Lave as câmaras com 100% de etanol por 10 minutos.
   9. Encha as câmaras com 70% de etanol.
      1. Se executar um experimento consecutivo, deixe as câmaras em 70% de etanol por 5 minutos e, em seguida, continue a etapa 3.3.
      2. Se os experimentos estiverem completos, coloque as tampas nas rolhas e desligue o instrumento.
3. Após cada uso, limpe corretamente as seringas de injeção e mantenha as seringas dedicadas ao uso específico de compostos para evitar a bagagem.
   1. Insira a seringa no fluido de lavagem e submerse totalmente a agulha de injeção.
   2. Desenhe o fluido de lavagem na seringa até o volume máximo.
   3. Retire a seringa do recipiente de lavagem, ejete o fluido de lavagem em um béquer e, em seguida, borre a seringa em uma toalha de papel.
   4. Repita as etapas 9.3.1-9.3.3 três vezes o mais rápido possível após cada uso.

Results

Estudos iniciais revelaram que os tumores EO771 eram humildemente oxidativos e, portanto, necessitavam de altas concentrações homogeneizantes para avaliação adequada do fluxo O_2. Foram realizados experimentos de otimização para determinar a faixa de concentração homogênea ideal do tecido para o estudo. Os homogeneizadores tumorais foram inicialmente preparados a 40 mg/mL e, em seguida, diluídos linearmente. O fluxo O₂ normalizado para massa tecidual foi consistente entre as concentrações(Figuras 1A-D). Observou-se que 40 mg/mL resultaram em rápido esgotamento do oxigênio e não foram adequados para experimentação(Figura 1A). O consumo de oxigênio desacelerou substancialmente com 30 mg/mL e 20 mg/mL, mas ainda diminuiu rapidamente em pouco tempo na ausência de substratos ou ADP (Figura 1B,C). A concentração de 10 mg/mL resultou na taxa de consumo ideal de oxigênio (Figura 1D) que suportaria um protocolo SUIT mais longo de 90 min.

Foi utilizado um protocolo SUIT para avaliar o NADH- e o Succinate-linked OXPHOS e ET, bem como a atividade CIV(Figura 2A). Piruvato e malato foram adicionados ao homogeneado tecidual na ausência de ADP para conduzir vazamento (L) através de NADH. Adp saturante foi então adicionada para conduzir OXPHOS (P) ligada ao NADH, seguida pela adição de glutamato. Cytocromo c foi então adicionado para garantir a integridade da membrana externa; o aumento da taxa de respiração foi inferior a 20% em todas as amostras (Figura 2B). Dada a resposta muito baixa aos substratos ligados ao NADH, a liberação do citocromo c também foi avaliada na presença de succinato e rotenona e observou estimulação c mínima de citocromo (Figura 2B). Curiosamente, o OXPHOS ligado ao NADH foi insignificante nos tumores EO771(Figura 2C). O succinato foi então adicionado na presença de piruvato, malato e glutamato para estimular o fluxo de elétrons através da desidrogenase succina. A FCCP foi então titulada para conduzir o fluxo máximo de elétrons (E), que revelou que em tumores EO771, a fosforilação em vez de oxidação limitava-se à respiração(Figura 2C). Rotenona e antimicina A foram posteriormente titulados para inibir o complexo I e o complexo III, respectivamente. Ascorbate e TMPD foram então adicionados para conduzir o fluxo máximo de elétrons através do CIV, que é então inibido por azida de sódio. A Tabela 1 ilustra equações de redução analítica dos dados brutos(Tabela 2) para quantificar os parâmetros respiratórios traçados na Figura 2C. No geral, os perfis respiratórios homogeneizados do tumor (Figura 2C) são semelhantes aos das células EO771 não implantadas(Figura 2D),com exceção da diminuição da transferência de elétrons máximos suportadas por substratos ligados a N e S no tumor.

Como a respiração ligada ao NADH era insignificante, a cinética respiratória do succinato foi ainda mais avaliada por titulações stepwise de ADP subsaturante até que a taxa máxima (V_MAX) fosse alcançada(Figura 3A,3B). A concentração semi-máxima (K_M) de ADP na presença de succinato + rotenona foi de 37,5 μM, enquanto o V_MAX foi ~10,5 pmol/s/mg(Figura 3C). Assim, apesar das taxas de oxidação relativamente baixas, os tumores EO771 eram altamente sensíveis à ADP e sustentavam a síntese de ATP em concentrações relativamente baixas de ADP.

A seleção de regiões apropriadas dos dados brutos para extração é fundamental para a reprodutibilidade de experimentos e quantificação precisa. Para citocromo c,uma marca precisa ser selecionada no estado estável imediatamente antes da injeção(Figura 4A, marca 1). Muitas vezes há um artefato de injeção inicial que pode ser seguido por um período de tempo (cerca de 5-10 min) onde o fluxo O₂ não é estável. A avaliação da eficiência c citocromática é feita fazendo uma seleção adicional uma vez que o fluxo O₂ tenha estabilizado(Figura 4A, marca 2). Seleções após a adição de substratos, ADP ou a maioria dos inibidores também são feitas após o artefato de injeção e uma vez que o fluxo O₂ se estabilizou(Figura 4B). A seleção utilizada para determinar a respiração maximal não acoplada é feita no pico de aumento alcançado durante a titulação do FCCP, que muitas vezes não é a última injeção feita(Figura 4C). A seleção para TMPD é feita após tanto ascorbate quanto TMPD terem sido adicionados e no pico de aumento da respiração (Figura 4D, marca 1). Logo após esse pico, acrescenta-se o inibidor, azida de sódio, que diminui rapidamente a respiração, mas também muitas vezes tem um artefato de injeção menor do que a taxa de respiração inibida(Figura 4D). A marca inibidora é feita imediatamente após o artefato de injeção(Figura 4D, marca 2). O fluxo O₂ normalmente não se estabilizará e continuará a diminuir.

Tabela 1: Notação respiratória e derivação analítica. Clique aqui para baixar esta Tabela.

Tabela 2: Características amostrais e respiratórias do tumor mamário luminal B homogeneiza. Clique aqui para baixar esta Tabela.

Figura 1: Otimização da concentração homogeneizada do tumor. O₂ Flux (vermelho) e O₂ Concentração (azul) em tumor mamário homogeneiza preparado em (A) 40 mg/mL,(B) 30 mg/mL, (C) 20 mg/mL, e (D) 10 mg/mL. Thom: Respiração homogeneizada de tecido. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 2: Avaliação da capacidade de OXPHOS e ET por respirometria de alta resolução em homogeneizadores de tumores recém-extirpados. (A) Parcela representativa do consumo de oxigênio (vermelho) e concentrações (azul) ao longo de um protocolo substrato, inibidor, não-adesora. PM: Piruvato + Malate, D: ADP, G: Glutamato, c: Cytochrome c, S: Succinate, F: FCCP, Rot: Rotenone, Ama: Antimicina A, Asc/TMPD: Ascorbate/Tetramethyl-p-phenylenediamine. (B) Aumento percentual no fluxo O₂ após a adição de citocromo c. (C-D) Respiração suportada por malato, piruvato, glutamato e succinato na presença de ADP, FCCP e ascorbate/TMPD em(C) EO771-derivado tumor homogeneiza e(D)células não implantadas EO771 digitonin-permeabilized. Thom: Respiração homogeneizada por tecidos; PM: Piruvato + Malate; PMG: Piruvato + Malato + Glutamato; PMGS: Piruvato + Malato + Glutamato + Succinato; CIV: Complexo IV; -L: Estado de vazamento; -P: Estado de fosforilação oxidativa, -E: Estado de transferência de elétrons; N-linked: O₂ flux suportado por combinações de substratos geradoras de NADH definidas; NS-linked: O₂ flux suportado pela convergência de combinações de substrato de geração de NADH e succinato definidos. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 3: Os tumores mamários EO771 apresentaram alta sensibilidade adp (adenosina 5′-diphosphate). (A) Parcela representativa do consumo de oxigênio (vermelho) e concentrações (azul) através de um protocolo de titulação ADP vinculado ao S. Thom: Respiração homogeneizada por tecidos; S/Rot: Succinate/Rotenone; D: ADP. (B) Respiração suportada por succinato na presença de rotenona e concentrações crescentes de ADP (0 μM ADP = S/Rot-L). (C) Taxa máxima (V_MAX) e concentração meia-máxima (K_M) de ADP na presença de succinato + rotenona. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 4: Rastreamento representativo ilustrando seleção de marca bruta O₂ para extração de dados. (A) Seleção Cytochrome c: seleção número 1 antes da injeção cytocromo c e seleção número 2 após a injeção quando o fluxo O₂ se estabilizou. c Citocromo c. (B) Substrato, ADP e seleção inibidora: seleção número 1 após a injeção (succinato nesta parcela representativa) onde o fluxo O₂ se estabilizou. S: Succinato. (C) Seleção de desacoplamento: seleção número 1 no pico de respiração durante a titulação uncoupler. Neste gráfico de titulação fccp representativo, a terceira injeção diminui ligeiramente a respiração e, portanto, não é usada para seleção. F: ACCP. (D) Seleção TMPD: seleção número 1 no pico de aumento da respiração após as injeções ascorbate e TMPD. Seleção de azida de sódio: seleção número 2 após o artefato de injeção aguda quando a respiração diminui inicialmente. As/Tm: Ascorbate/TMPD; Azd: Azide. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Discussion

As abordagens para avaliar a respiração mitocondrial no câncer têm sido em grande parte limitadas aos modelos in vitro ^13,14,15,16. Algum sucesso foi alcançado na medição da respiração mitocondrial em tumores usando permeabilização química^6,7,17, mas não há uma abordagem uniforme e padrão-ouro que possa ser universalmente aplicada e comparada entre os tipos de tumores. Além disso, a falta de análise e relatório de dados consistentes tem generalizabilidade e reprodutibilidade de dados limitados. O método aqui descrito fornece uma abordagem simples e relativamente rápida para medir a respiração mitocondrial¹⁸ em preparações mitocondriais de amostras de tumores sólidos recém-extirpados. Os tumores foram cultivados a partir de murina luminal b, ERα-negativo EO771 células cancerígenas mamárias¹⁹.

A diligência e o cuidado com o manuseio de tecidos melhorarão muito a precisão e a normalização das taxas de consumo de oxigênio. O tecido e as mitocôndrias podem ser facilmente danificados se a amostra não for mantida fria, não estiver consistentemente submersa em meios de preservação, ou for excessivamente manuseada, resultando em rotina subótima e taxas de OXPHOS. Além disso, o peso úmido preciso do tecido homogeneizado é de importância crítica, pois este é o método primário de normalização. Outros métodos de normalização podem ser considerados, como proteína total ou marcadores específicos mitocondriais, como a atividade de sinthase citrato²⁰. Além disso, a heterogeneidade tecidual precisará ser abordada, com decisões sobre regiões tumorais para incluir em experimentos feitos a priori. O tecido necrosado, fibroso e conjuntivo não pode homogeneizar e/ou respirar bem e deve ser evitado a menos que intencionalmente testenize essas regiões tumorais. Notavelmente, o tumor pode ser muito pegajoso dependendo do tipo e região de excisão, tornando a pesagem precisa e a transferência mais desafiadora. O número de derrames utilizados para homogeneizações deve ser otimizado para garantir a preparação completa das mitocôndrias, ao mesmo tempo em que mitiga danos às membranas mitocondriais externas.

Para maior precisão e reprodutibilidade, recomendamos que sejam realizados experimentos de otimização para o número de derrames para preparação homo homogene, concentração de tecido e substrato, desacoplador, inibidor. Estudos podem comparar o número diferente de derrames e como correspondem à resposta à adição de citocromo c dentro do estudo, bem como a capacidade respiratória mitocondrial máxima ²¹. Embora exista uma aceitação geral de que a resposta c menos citocromocômo é melhor, pois um aumento no consumo de oxigênio após a adição de citocromo c pode indicar danos à membrana mitocondrial externa, não há padrão-ouro quanto ao que é esse limiar para cada tecido e deve ser investigado experimentalmente para garantir que o tecido não esteja sendo sobrecarregado ou despreparado. Neste tecido tumoral, verificou-se que uma resposta citocromática c em ~30% não prejudicou a função respiratória. O uso do citocromo c torna-se fundamental para uma quantificação precisa da capacidade respiratória se o teste for positivo. Neste caso, a adição repõe citocromo endógeno c, o que, se esgotado, causará uma subestimação das taxas respiratórias.

Experimentos de titulação de concentração de tecidos podem ser realizados em uma série de concentrações viáveis e, idealmente, seriam feitos com SUITs que serão investigados durante o estudo. A capacidade respiratória vai variar de acordo com o tipo de tumor e composição. Assim, tumores densos com mitocôndrias ou alta capacidade respiratória exigirão concentrações mais baixas (0,5-5 mg/mL). Tumores com poucas mitocôndrias ou baixa capacidade respiratória exigirão concentrações mais elevadas (7-12 mg/mL). Além disso, os SUITs que são longos ou têm substratos altamente consumidos podem precisar de menos tecido para evitar a reoxigenação da câmara ou limitação de ADP. Alguns tecidos terão uma relação linear no consumo de oxigênio, enquanto outros mostrarão melhor sensibilidade e oxidação máxima em determinadas faixas de concentração. A concentração de tecido escolhida deve ser otimizada para maximizar o fluxo de oxigênio, limitando o número de eventos de reoxigenação. Além disso, muitas vezes é melhor superestimar a necessidade ou mirar para a extremidade superior da faixa de concentração. Os inibidores, essenciais para a quantitação de fluxos respiratórios, são mais precisos quando usados em piscinas maiores de mitocôndrias.

Outra consideração essencial é a concentração das drogas que são utilizadas durante os protocolos. Alterações na concentração homogeneizado podem alterar as concentrações de substratos, desacopladores e inibidores necessários para a resposta máxima. Assim, uma vez escolhida a faixa de concentração ideal, deve ser realizado um teste de experimentos das doses necessárias para o protocolo SUIT. ADP adicional pode ser adicionado para garantir que as concentrações de adenilato não sejam limitantes a fluxos respiratórios. Desacopladores químicos como FCCP ou CCCP inibirão a respiração em concentrações mais elevadas²². Como tal, é essencial titular em pequenas quantidades para revelar a taxa máxima alcançada. Inibidores, como rotenona e antimicina A, são melhor utilizados quando saturados dentro da primeira injeção. Embora as concentrações ideais tenham sido determinadas em experimentos preliminares, também observamos diferenças relacionadas ao tratamento em resposta aos inibidores e, portanto, muitas vezes adicionamos uma injeção adicional de inibidores para demonstrar inibição máxima, pois as taxas resultantes servem como base para quantificação. A inibição química do Ascorbate/TPMD é essencial para uma redução analítica precisa, pois o TMPD sofre autooxidação²³. Controlamos a auto-oxidação de ascorbate/TMPD/citocromo c através da adição de azida de sódio, um inibidor de CIV estabelecido. Para os estudos do Km, a adição de rotenona na presença de succinato por si só previne o acúmulo de oxaloacetato que pode inibir a atividade desidrogenase de succinato em baixas concentrações²⁴. O volume e a concentração de ADP são altamente dependentes da sensibilidade das mitocôndrias à combinação de substrato predominante. Preparações mitocondriais altamente sensíveis ao ADP exigirão concentrações iniciais mais baixas. Além disso, produtos químicos validados e preparação adequada de medicamentos com atenção ao pH, sensibilidade à luz, se aplicável, e temperatura de armazenamento são essenciais para experimentos bem sucedidos.

A configuração dos instrumentos e os cuidados rotineiros são de fundamental importância para o sucesso desses experimentos. A limpeza adequada e adequada das câmaras é essencial para a reprodutibilidade e prevenção da contaminação biológica, proteica, inibidora ou desacopladora. Eletrodos do tipo Clark e sistemas O2k utilizam câmaras de reação de vidro, o que é uma vantagem significativa de custo para sistemas baseados em placas que dependem de consumíveis. No entanto, as câmaras de vidro devem ser vigorosamente limpas e podem ser uma fonte de contaminação inibidora em estudos subsequentes. A incubação com espécimes ricos em mitocôndrias durante o processo de lavagem (mitocôndrias isoladas do coração ou fígado, por exemplo) pode reduzir o risco de contaminação experimental e é recomendada, além de procedimentos de diluição e lavagem à base de álcool. Se são realizados estudos consecutivos, a limpeza com etanol e mitocôndrias minimiza a possibilidade de contaminação inibidora. A calibração do sensor de oxigênio é recomendada antes de cada experimento para obter medições precisas da respiração em relação à pressão parcial predominante do oxigênio. Se várias calibrações não forem viáveis, uma calibração por dia pode ser suficiente se a concentração de oxigênio permanecer estável e consistente após o procedimento de lavagem.

Os procedimentos descritos acima alavancam o instrumento Oroboros O2k para medir o consumo de oxigênio no tecido tumoral dentro de 4 horas após a excisão tumoral utilizando solução de preservação previamente projetada e otimizada e mídia de respiração^25,26,27. Vários parâmetros neste protocolo podem ser modificados para aplicações subsequentes. A configuração e calibração do instrumento, os homogeneizadores utilizados para a preparação do tecido e a ótima concentração de oxigênio homogêneo e de câmara podem ser adaptados para uso em outros instrumentos com potencial de monitoramento de oxigênio. Por exemplo, as câmaras foram ligeiramente preenchidas ao adicionar homogeneização, e assim, quando a câmara está totalmente fechada, a câmara capilar permanece cheia. Isso vai consumir um pouco de oxigênio na câmara, mas com a otimização da concentração amostral, podemos explicar esse consumo na determinação do nível de oxigênio para começar. Alternativamente, a amostra pode ser permitida a equilibrar-se com oxigênio ambiente antes que a câmara seja fechada, mas isso muitas vezes aumentará a quantidade de tempo antes do experimento começar e atrasará a adição de substratos. Embora os homogeneizadores utilizados neste protocolo sejam amplamente acessíveis, outras técnicas de homogeneização comercial poderiam ser empregadas, como um triturador de tecido ou homogeneizador automatizado²⁸.

Além disso, os procedimentos de preparação e instrumento tecidual podem ser utilizados com uma série de SUITs diferentes para estudar o controle respiratório por uma diversidade de estados de acoplamento e controle de vias²⁹. Estes protocolos SUIT foram desenvolvidos para medir a capacidade funcional e, portanto, a contribuição de substratos endógenos potenciais não tem impacto na medição da capacidade. Explicamos analiticamente o consumo não mitocondrial de oxigênio e/ou o consumo residual do homogeneizar através da subtração da antimicina A-rotenona, ou taxas insensíveis de azida de sódio, conforme apropriado. Mitocôndrias podem permanecer viáveis em BIOPS ou soluções de preservação construídas da mesma forma por longos períodos de tempo (>24 h) dependendo do tipo de tecido e da intactidade^30,31. Estudos podem ser realizados com antecedência para determinar os limites de armazenamento temporal, pois o OXPHOS de certos substratos pode ter limitações diferentes. Isso é essencial se o experimento não puder ser realizado dentro de várias horas de excisão/biópsia tecidual. 37°C é uma temperatura ótima e fisiológica para a avaliação da função respiratória na maioria dos sistemas de mamíferos. No entanto, se a temperatura do ensaio parecer interferir na avaliação^32,estudos comparativos podem ser realizados em uma ampla faixa de temperatura (25-40 °C) para garantir a resposta adequada. Restrições instrumentais podem limitar a capacidade de realizar tais estudos.

As principais limitações do método acima descritas são 1) o potencial de dano às mitocôndrias através da homogeneização mecânica, 2) presença de ATPases ou outros bioquímicos subcelulares em preparações homogeneizadas que podem interferir na determinação simultânea de ATP ou outras variáveis de interesse e podem exigir métodos adicionais de correção ou uso inibidor³³ , e 3) a avaliação de muitas amostras e/ou SUITs múltiplos por amostra é demorada, pois um instrumento pode acomodar dois experimentos por vez e requer limpeza e configuração entre experimentos sucessivos. Experimentos de otimização e preparação consistente de amostras podem minimizar danos mitocondriais substanciais que contribuiriam para dados inconsistentes.

A significância do método em relação aos métodos existentes/alternativos é a melhor viabilidade em comparação com a quantidade de material inicial, desafio de isolar mitocôndrias ou desafio técnico no tecido permeabilizante. A preparação dos homogeneizadores é mais rápida, o oxigênio não é tão limitador, e é menos suscetível à variabilidade entre o pessoal em comparação com o tecido permeabilizado. É importante ressaltar que quase todos os tipos de amostra são adequados para a preparação homogênea que permite a análise comparativa entre tecidos. Respirometria de alta resolução é a medida padrão-ouro de OXPHOS mitocondrial e ET. A aplicação desse método em pesquisas pré-clínicas e clínicas de câncer tem a capacidade de expandir as investigações in vitro atuais para estudos ex vivo. Além disso, oferece aplicações potenciais em configurações clínicas e diagnósticas.

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Hidrato de ácido 2-(N-morfolino)etanossulfônico	Sigma-Aldrich	M8250
Sal de sódio de adenosina 5-difosfato	Sigma-Aldrich	A2754
Hidrato de sal dissódico de adenosina 5'-trifosfato	Sigma-Aldrich	A2383
Anfotericina B	Gibco	15290018
Antimicina A	Sigma-Aldrich	A8674
Ascorbato	Sigma-Aldrich	A4544
Albumina de soro bovino, fração V, choque térmico, livre de ácidos graxos	Sigma-Aldrich	3117057001	Roche
BD Seringa Luer-Lok de 50 mL	Fisher Scientific	13-689-8
BD  Agulhas de seringa de uso geral Vacutainer	Fisher Scientific	23-021-020
Carbonato de cálcio	Sigma-Aldrich	C4830
Cianeto de carbonila 4-(trifluorometoxi)fenilhidrazona	Sigma-Aldrich	C2920
Citocromo c do coração equino	Sigma-Aldrich	C2506
Datlab 7.4 software	Oroboros Instruments
Dimetilsulfóxido	Amresco	N182
Ditiotreitol	Sigma-Aldrich	D0632
D-Sacarose	Sigma-Aldrich	S7903
Dumont # 5 Fórceps	Fine Science Tools	11251-30	Dumoxel, autoclavável
Dumont # 7 Fórceps	Fine Science Tools	11271-30	Dumoxel, autoclavável
Paquímetro Digital 150 mm/6 in	World Precision Instruments	501601
células EO771	CH3 BioSystems	SKU:  94APV1-vial-prem	Testado para Patógenos
Ethylene glycol-bis(2-aminoethylether)-N,N,N′,N′ Ácido -tetracético	Sigma-Aldrich	E4378
Camundongos fêmeas C57BL/6J	Estoque de Laboratório Jackson	#000664
HEPES	Sigma-Aldrich	H4034
Imidazole	Sigma-Aldrich	56750
Kimwipes	Fisher Scientific	34120
L-(−)-Ácido málico	Sigma-Aldrich	G1626
Ácido lactobiônico	Sigma-Aldrich	L2398
Malato	Sigma-Aldrich	M6413
Matriz Matrigel	Corning	354248
MgCl· 6H2O	Sigma-Aldrich	M2670
Microsseringas	Hamilton	87919, 80383, 80521, 80665, 80765, 80865, 87943
N,N,N′,N′-Tetrametil-p-fenilenodiamina	Sigma-Aldrich	T7394
Oxygraph-2k	Oroboros Instruments	10023-03
Oxygraph-2k FluoRespirometer	Oroboros Instrumentos	10003-01
PBS	Gibco	10010023
Penicilina-Estreptomicina	Gibco	15140122
Hidrato de sal dissódico de fosfocreatina	Sigma-Aldrich	P7936
Hidróxido de potássio	Sigma-Aldrich	P1767
Fosfato de potássio monobásico	Sigma-Aldrich	P5655
Rotenona	Sigma-Aldrich	R8875
RPMI 1640	Gibco	21875034
Azida de sódio	Sigma-Aldrich	S2002
Piruvato de sódio	Sigma-Aldrich	P5280
Succinato (dissódico)	Sigma-Aldrich	W327700
Taurina	Sigma-Aldrich	T0625
Papel de Filtro Whatman, grau 5	Sigma-Aldrich	1005-090
7 mL	Duran Wheaton Kimble	357424
Bisturi Não-Segurança Roboz
Agulha de Precisão BD 18 G x 1	de		Becton, Dickinson and Company
	Becton, Dickinson and Company	309659
Pyrex, 60 mm	Thermo Fisher Scientific	316060
Dieta de Roedores Muito Alta em Gordura,  60% kcal de gordura, 20% kcal de proteína, e 20% kcal de carboidrato	Dieta de Pesquisa	D12492
Vidro de Relógio Pyrex, 100 mm	Thermo Fisher Scientific	S34819