Summary
Hier demonstrieren wir mehrere In-vivo-Tests (Flash Visual Evoked Potential, Muster-Elektroretinogramm und optische Kohärenztomographie) an Ziegen- und Rhesusaffen, um die Struktur und Funktion des Sehnervs und seiner Neuronen zu verstehen.
Abstract
Der Sehnerv sammelt Axonsignale von den retinalen Ganglienzellen und überträgt visuelle Signale an das Gehirn. Große Tiermodelle der Sehnervenverletzung sind aufgrund ihrer engeren Ähnlichkeit mit Menschen in Größe und Anatomie unerlässlich, um neuartige therapeutische Strategien von Nagetiermodellen auf die klinische Anwendung zu übertragen. Hier beschreiben wir einige In-vivo-Methoden zur Bewertung der Funktion und Struktur der retinalen Ganglienzellen (RGCs) und des Sehnervs (ON) bei großen Tieren, einschließlich des visuell evozierten Potentials (VEP), des Musterelektroretinogramms (PERG) und der optischen Kohärenztomographie (OCT). In dieser Studie wurden sowohl Ziegen als auch nichtmenschliche Primaten eingesetzt. Durch die schrittweise Präsentation dieser In-vivo-Methoden hoffen wir, die experimentelle Reproduzierbarkeit zwischen verschiedenen Labors zu erhöhen und die Verwendung von Großtiermodellen optischer Neuropathien zu erleichtern.
Introduction
Der Sehnerv (ON), der aus Axonen der retinalen Ganglienzellen (RGC) besteht, überträgt visuelle Signale von der Netzhaut an das Gehirn. ON-Erkrankungen wie Glaukom, traumatische oder ischämische Optikusneuropathie verursachten häufig eine irreversible ON/ RGC-Degeneration und einen verheerenden Sehverlust. Obwohl es derzeit viele Durchbrüche bei der ON-Regeneration und dem RGC-Schutz in Nagetiermodellen gibt1,2,3,4,5,6, blieben die klinischen Behandlungen für die meisten ON-Erkrankungen im letzten halben Jahrhundert im Wesentlichen gleich mit unbefriedigendem Ergebnis7,8 . Um die Lücke zwischen Grundlagenforschung und klinischer Praxis zu schließen, sind translationale Studien mit Großtiermodellen von ON-Krankheiten oft notwendig und vorteilhaft, da sie anatomisch näher am Menschen sind als Nagetiermodelle.
Ziegen- und Rhesusmakaken sind zwei große Tierarten, die in unserem Labor verwendet werden, um die ON-Krankheit des Menschen zu modellieren. Die Größe des Augapfels einer Ziege, ON und der angrenzenden Struktur (Orbital- und Nasenhöhle, Schädelbasis usw.) ähnelt der eines Menschen basierend auf dem Schädel-CT-Scan9. Als solches bietet das Ziegenmodell die Möglichkeit, therapeutische Geräte oder chirurgische Verfahren vor der Anwendung beim Menschen zu bewerten und zu verfeinern. Der Rhesusaffe hat als nichtmenschlicher Primat (NHP) ein menschenähnliches einzigartiges visuelles System, das bei anderen Arten nicht existiert10,11. Darüber hinaus sind die pathophysiologischen Reaktionen auf Verletzungen und Behandlungen bei NHP denen beim Menschen sehr ähnlich12.
In-vivo-Tests zur Beurteilung der Struktur und Funktion von ON und RGC in Längsrichtung sind in Großtierstudien wichtig. Das Musterelektroretinogramm (PERG) wurde verwendet, um die RGC-Funktion zu bewerten. Flash Visual Evoked Potential (FVEP) spiegelt die Integrität des retino-geniculo-kortikalen Weges im visuellen System wider. Somit kann PERG in Kombination mit FVEP die ON-Funktion9,13,14 widerspiegeln. Die retinale optische Kohärenztomographie (OCT) kann die Netzhautstruktur mit hoher zeitlicher und räumlicher Auflösung zeigen, was die Messung der Dicke des retinalen Ganglienkomplexes (GCC) ermöglicht9,15. Für elektrophysiologische Untersuchungen in dieser Studie ist die Überwachung der Vitalparameter (Hitzerate, Bruchrate, Blutdruck) und des Sauerstoffsättigungsgrades (SpO2) vor dem Test von entscheidender Bedeutung, da diese Parameter starke Auswirkungen auf den Augenblutfluss und damit auf die Funktion des visuellen Systems haben. Der Einfachheit halber haben wir jedoch die Vitalfunktionen bei der OCT-Netzhautbildgebung nicht überwacht. Laut unserer vorherigen Studie9 ist die GCC-Dicke, die durch OCT-Netzhautbildgebung gemessen wurde, ziemlich stabil, mit einem Variationskoeffizienten zwischen den Sitzungen in der Nähe von 3%. Diese In-vivo-Tests an Ziegen- und Rhesusaffen wurden in unserer vorherigen Studie ausführlich beschrieben9. Hier stellen wir diese Methoden vor, um die experimentelle Transparenz und Reproduzierbarkeit zu erhöhen.
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Protocol
Die Experimente wurden streng in Übereinstimmung mit den ARRIVE-Richtlinien und dem Leitfaden der National Institutes of Health für die Pflege und Verwendung von Labortieren durchgeführt und entsprechen den Protokollen, die vom Institutional Animal Care and Use Committee der Wenzhou Medical University (WMU) und des Joinn Laboratory (Suzhou) genehmigt wurden. Die männlichen Saanenziegen im Alter von 4 bis 6 Monaten mit einem Gewicht von 19-23 kg wurden in der Tierhaltung der WMU untergebracht. Die männlichen Rhesusmakaken im Alter von 5 bis 6 Jahren mit einem Gewicht von 5-7 kg wurden in der Tierhaltung Joinn untergebracht. Alle Tiere wurden in einem klimatisierten Raum mit kontrollierter Temperatur (21 ± 2 °C) unter einem 12 h Licht-/12 h Dunkelzyklus mit Ad-libitum-Futter gehalten.
1. Flash visual evoked potential (FVEP) bei Ziege
- Allgemeine Betäubung
- Rasieren Sie die Hockhaare mit einem elektronischen Rasierer.
- Bereiten Sie die Haut vor, indem Sie dreimal mit 70% Alkohol einreiben, um die Haut zu reinigen, und legen Sie dann die subkutane Vene frei.
- Führen Sie einen peripheren Venenkatheter intravenös (0,9 mm x 25 mm) ein und injizieren Sie dann Atropin (0,025 mg/kg) und Propofol (5 mg/kg).
- Intubieren Sie die Ziege mit einem 6 mm Trachealschlauch und verbinden Sie sie mit einem künstlichen Beatmungsgerät.
- Halten Sie die Anästhesie mit 3,5% Isofluran in Sauerstoff bei einer konstanten Durchflussrate von 2 l / min aufrecht.
HINWEIS: Die Ziege erholt sich innerhalb von Minuten von der durch Propofol induzierten Anästhesie, also seien Sie schnell, um die Ziege zu intubieren.
- Kardiopulmonale Überwachung
- Platzieren Sie den Temperatursensor unter der Zunge.
- Verbinden Sie das Pulsoximeter mit dem proximalen Ende des Ohres.
- Binden Sie die Blutdruckmanschette an die Basis des Oberschenkels.
- Klemmen Sie die EKG-Clips entsprechend an die Gliedmaßen.
HINWEIS: Die normale Herzfrequenz von Ziegen beträgt 68-150 bpm. Aufgrund der Verwendung von Gasanästhesie wird die Herzfrequenz von Ziegen erhöht. Daher beträgt unsere Herzfrequenz während der Inspektion 170 ± 30 bpm. Der systolische Blutdruck von Ziegen unter normalen Bedingungen beträgt 110-130 mmHg und der diastolische Blutdruck beträgt 50-60 mmHg. Im Zustand des Einatmens von Sauerstoff kann die Sauerstoffsättigung des Ziegenblutes immer bei 99% gehalten werden. Die Atemfrequenz von Ziegen unter Narkose ist mit der des Beatmungsgeräts synchronisiert, die 10 Atemzüge/min beträgt. Da die Temperatur unter der Zunge der Ziege gemessen wurde, nicht die Kerntemperatur, beträgt die Temperatur der Ziege im Allgemeinen 35 ± 2 °C.
- Implantation von Schädelschrauben und Platzierung der Elektroden
- Rasieren Sie die Haare mit einem Haarschneider. Desinfizieren Sie die Haut in der Mitte des Stirnbeins, indem Sie dreimal mit einem in Betadin und 70% Alkohol getränkten Wattebausch reiben.
- Verwenden Sie sterilisierte Schrauben und Scheren.
HINWEIS: Autoklavieren Sie alle chirurgischen Instrumente zur Sterilisation (121 °C, 20 min). - Machen Sie einen 5-mm-Hautschnitt, um den Frontalknochen mit einer Augenschere freizulegen, und implantieren Sie dann eine sterilisierte Schraube in der Mitte des Frontalknochens mit einem Schraubendreher.
- Rasieren Sie die Haare und desinfizieren Sie die Haut am zentralen Hinterhauptbein zwischen zwei Ohren mit Betadin und 70% Alkohol, einem gefolgt von dem anderen, dreimal.
- Machen Sie einen 5-mm-Hautschnitt, um den Okzipitalknochen mit einer Augenschere freizulegen, und implantieren Sie dann eine sterilisierte Schraube in der Mitte des Okzipitalknochens.
HINWEIS: Die geschliffene Nadelelektrode wird subkutan unter die vordere Schädelschraube eingeführt. Die Aktiv- und Referenzelektroden sind mit den Okzipital- bzw. Frontalschrauben mit Krokodilklemmen verbunden, um die Elektrodenimpedanz zu reduzieren16.
- Tierpräparation
- Verwenden Sie ein lichtdichtes Tuch, um das Auge zu bedecken, und fixieren Sie es an der Augenbinde, um ein Auge zu flicken.
- Tragen Sie topische anästhetische Augentropfen (Proparacainhydrochlorid-Augentropfen) auf beide Augen auf. Bilaterale Pupillen werden durch topische Verabreichung von mydriatischen Augentropfen mit Tropicamid (5%) und Phenylephrin (5%) erweitert.
- Legen Sie den Kopf der Ziege in den Ganzfeld-Stimulator und dimmen Sie das Umgebungslicht.
HINWEIS: Es wurde festgestellt, dass Ziegen eine gute Augapfelfixierung unter Narkose aufrechterhalten können, so dass keine zusätzliche Augapfelfixierungsoperation erforderlich ist. - Bedecken Sie den Stimulator und den Kopf der Ziege mit einer schwarzen Decke für 5 minuten zur Anpassung.
- Verwenden Sie Augenlidspekulum, um die bulbäre Bindehaut freizulegen. Falten Sie den oberen Ring, ziehen Sie das obere Augenlid nach oben und führen Sie den oberen Ring zuerst in den Bindehautsack des oberen Augenlids und dann auf ähnliche Weise in das untere Augenlid ein.
- Drücken Sie die Impedanztaste , um die Elektroden-Gewebe-Kontaktimpedanz zu überprüfen, und die Impedanzwerte werden in jedem Kanal angezeigt.
- Stellen Sie sicher, dass die Impedanz für jede Elektrode unter 10 kΩ liegt, um elektromagnetische Störungen durch andere elektrische Geräte im selben Raum zu vermeiden.
HINWEIS: Wenn sie über 10 kΩ liegt, schließen Sie die Elektrode wieder an oder ersetzen Sie sie. Die Impedanz kann ungewöhnlich hoch erscheinen, wenn das elektrische Metall-Operationsbett, in dem die Ziege liegt, verstopft ist. Die Impedanz sollte zwischen der aktiven und der Referenzelektrode um weniger als 1 kΩ abweichen, um elektrische Störungen zu reduzieren17. - Drücken Sie die Oscillograph-Taste , um das Grundrauschen ohne Lichtstimulation zu überprüfen.
HINWEIS: Wenn ein großes Grundrauschen auftritt, trennen Sie alle anderen elektrischen Geräte im selben Raum und schalten Sie die Mobiltelefone aus. Wenn das Basisproblem weiterhin besteht, fahren Sie mit Schritt 1.3.10 fort. um zu überprüfen, ob eine typische FVEP-Wellenform hervorgerufen werden kann. Ist dies nicht der Fall, verschieben Sie den FVEP-Test zu einem anderen Zeitpunkt. - Starten Sie die FVEP-Aufnahme, indem Sie die Lichtintensität von 0,025, 0,5 bzw. 3,0 cd·s/m2 im weißen Hintergrundfeld in der oberen rechten Ecke auswählen. Drücken Sie dann die Taste Untersuchung . Beachten Sie, dass die FVEP-Aufzeichnung bei jeder Lichtintensität zweimal durchgeführt wird.
HINWEIS: Wenn die beiden Wellenformen offensichtlich unterschiedlich erscheinen, ist eine weitere Wiederholung erforderlich. - Befeuchten Sie die Hornhaut mit künstlichen Tränentropfen, wenn sie auf der Infrarotkamera trocken erscheint.
HINWEIS: Überwachen Sie die Augenposition vor der Aufnahme mit der integrierten Infrarotkamera, um sicherzustellen, dass der visuelle Blick korrekt ist und die Pupille vollständig belichtet ist (so dass die Feldgröße eines Blitzstimulus 90 ° beträgt). Die Augenposition einer betäubten Ziege kann durch entsprechendes Drehen des Kopfes eingestellt werden. Nach unserer Beobachtung kommt es während der FVEP-Aufnahme (~10 min) bei Ziegen unter Vollnarkose selten zu Blickwanderungen9. Es besteht also keine Notwendigkeit, den Blick während der Aufnahme anzuhalten und neu einzustellen. - Wiederholen Sie die obigen Schritte für das kontralaterale Auge.
- Stoppen Sie die Isofluranzufuhr und erhöhen Sie das Tidalvolumen am Beatmungsgerät leicht, um der Ziege zu helfen, sich von der Vollnarkose zu erholen.
- Behandeln Sie die Ziege nach Vollnarkose mit Gentamicin (4 mg/kg, IM) und Ceftiofur-Natrium (ein Cephalosporin, 2 mg/kg, IM), um eine Infektion zu verhindern.
- FVEP-Messung und quantitative Analyse
HINWEIS: Wie in Abbildung 1A dargestellt, werden die ersten positiven und negativen Peaks in der FVEP-Wellenform als P1 und N1 und der zweite positive Peak als P2 bezeichnet. Die typische implizite Zeit von P1, N1 und P2 liegt bei etwa 40, 60 bzw. 120 ms. P1- und P2-Amplituden werden vom Tiefpunkt der N1-Wellenform bis zu den Spitzen der P1- bzw. P2-Wellenformen gemessen.- Verwenden Sie im Falle einer monokulären Verletzung einen interokularen Vergleich der Amplitude und der impliziten Zeit, um die Variation der Intersession zu reduzieren und die Empfindlichkeit zu erhöhen17.
2. PVEP bei Rhesusaffen
HINWEIS: Muster-VEPs könnten bei Rhesusaffen9 ausgelöst werden und sind in Amplitude und impliziter Zeit stabiler als Flash-VEP17. Daher wurde PVEP verwendet, um die Integrität des retino-geniculo-kortikalen Weges bei nicht-menschlichen Primaten nachzuweisen.
- Tierpräparation
- Betäuben Sie den Affen mit Isofluran (1,5%-2%) nach Induktion mit Zoletil50 (4-8 mg/kg IM, Tiletamin/Zolazepam).
- Positionieren Sie die sterilisierte Masseelektrode am Ohrläppchen. Führen Sie die sterilisierten Aktiv- und Referenzelektroden subkutan entlang der Mittellinie am Frontal- bzw. Okzipitalknochen ein.
- Tragen Sie ein Augenlidspekulum auf, um die bulbäre Bindehaut freizulegen.
- Verwenden Sie klebendes undurchsichtiges schwarzes Klebeband, um das kontralaterale Auge zu flicken.
- PVEP-Aufzeichnung
- Drücken Sie die Impedanztaste , um die Elektroden-Gewebe-Kontaktimpedanz zu überprüfen, und die Werte der Impedanz werden in jedem Kanal angezeigt. Stellen Sie sicher, dass es unter 10k Ω liegt. Wenn nicht, schließen Sie die Elektrode wieder an oder ersetzen Sie sie.
- Überprüfen Sie die Impedanzwerte im Impedanztestfenster und stellen Sie sicher, dass die Impedanz zwischen der aktiven elektroden und der Referenzelektrode um weniger als 1 kΩ voneinander abweicht, um elektrische Interferenzen zu reduzieren17.
- Drücken Sie die Oszillograph-Taste , um das Grundrauschen ohne Stimulation zu überprüfen.
HINWEIS: Wenn ein großes Grundrauschen auftritt, trennen Sie alle anderen elektrischen Geräte im selben Raum und schalten Sie die Mobiltelefone aus. Wenn das Basisproblem weiterhin besteht, wiederholen Sie den PVEP-Test an einem anderen Tag. - Zeichnen Sie pvEP-Antworten des ungepatchten Auges auf, indem Sie die Lichtintensität von 0,5 bzw. 1,0 Zyklus/Grad im weißen Hintergrundfeld in der oberen rechten Ecke auswählen und dann die Taste Untersuchung drücken.
HINWEIS: Für jede Aufnahme werden 64 Spuren gemittelt, um eine Wellenform zu erhalten. Für jede Frequenz werden mindestens zwei Aufzeichnungen erfasst, um die Reproduzierbarkeit von PVEP-Signalen zu überprüfen. - Wiederholen Sie den Vorgang für das kontralaterale Auge.
- Sobald Sie fertig sind, stellen Sie die Isofluranzufuhr ein, um den Affen zu wecken.
- Behandeln Sie den Affen nach Vollnarkose mit Gentamicin (4 mg/kg IM) und Ceftiofur-Natrium (2 mg/kg IM), um eine Infektion zu verhindern.
- PVEP-Messung und quantitative Analyse
- Wie in Abbildung 1B gezeigt, wurden die ersten negativen und positiven Peaks in der PVEP-Wellenform als N1 und P1 bezeichnet, die typischerweise bei etwa 50 und 90 ms auftreten. Die P1-Amplitude wird vom Tiefpunkt von N1 bis zum Peak von P1 gemessen.
- Verwenden Sie im Falle einer monokulären Verletzung einen interokularen Vergleich von Amplitude und impliziter Zeit, um die Intersessionsvariation zu reduzieren und die Empfindlichkeit zu erhöhen17.
3. Muster ERG (PERG) bei Ziege
HINWEIS: In der vorherigen Studie wurde bei Ziegen kein interokulares Übersprechen des PERG-Signals beobachtet, so dass PERG-Reaktionen gleichzeitig von beiden Augen aufgezeichnet werden können9.
- Prüfungsvorbereitung
- Betäuben Sie die Ziege mit Xylazin (3 mg / kg, IM) und legen Sie sie auf einen Untersuchungstisch.
- Legen Sie einen Temperatursensor unter die Zunge der Ziege.
- Schließen Sie das Pulsoximeter an das proximale Ende des Ziegenohrs an.
- Binden Sie die Blutdruckmanschette an den Oberschenkel.
- Klemmen Sie die EKG-Clips an den Gliedmaßen entsprechend fest.
- Um die Elektrodenimpedanz zu reduzieren, legen Sie eine sterilisierte Schädelschraube auf den Frontalknochen und verbinden Sie sie mit einer Krokodilklemme mit der Bodenelektrode.
- Platzieren Sie zwei sterilisierte Nadelreferenzelektroden subkutan 1 cm hinter dem seitlichen Canthi auf beiden Seiten.
- Verwenden Sie das Augenlidspekulum, um die bulbäre Bindehaut freizulegen.
- Platzieren Sie zwei desinfizierte ERG-Jet-Aufnahmeelektroden nach topischer Anwendung eines künstlichen Risses in der Mitte der bilateralen Hornhaut.
- Stellen Sie zwei 47,6 cm x 26,8 cm große LED-Monitore mit einem Betrachtungsabstand von 50 cm vor beide Augen.
- Stellen Sie jeden Monitor so ein, dass er parallel zur Pupillenebene auf derselben Seite verläuft, und richten Sie die Mitte des Monitors an der Pupillenebene aus.
- Stellen Sie sicher, dass das kontrastumkehrende Schachbrett (zeitliche Frequenz, 2,4 Hz) auf beiden Monitoren angezeigt wird und ein maximales Seitenverhältnis von 4:3 aufweist, das durch die Geräteeinstellungen eingestellt wird.
- Stellen Sie sicher, dass der Kontrast zwischen weißen und schwarzen Karos 96% beträgt und die mittlere Leuchtdichte 200 cd/m2 (Candela pro Quadratmeter) beträgt, was durch den Leuchtdichtemesser überprüft wird.
HINWEIS: Laut ISCEV ist beim Menschen eine mittlere photopische Leuchtdichte von 40-60 cd/m2 erforderlich17. In einer anderen Studie mit Mäusemodell blieb das Muster bei einer mittleren Leuchtdichte von 800 cd/m2,18. Für einen Standard-PERG-Test am Menschen wird eine Feldgröße von mindestens 15° in der engsten Dimension benötigt17. Stellen Sie die Position der Hornhautelektrode ein, wenn sie sich nicht in der Mitte der Hornhautoberfläche befindet.
- PERG-Aufzeichnung
- Dimmen Sie das Umgebungslicht und drücken Sie die Impedanztaste , um die Elektroden-Gewebe-Kontaktimpedanz zu überprüfen. Die Werte der Impedanz werden in jedem Kanal angezeigt.
- Überprüfen Sie die Impedanzwerte im Impedanztestfenster und stellen Sie sicher, dass die Impedanz unter 10 kΩ liegt. Wenn nicht, schließen Sie die Elektrode wieder an oder ersetzen Sie sie.
- Drücken Sie die Oscillograph-Taste , um das Grundrauschen ohne Lichtstimulation zu überprüfen.
HINWEIS: Achten Sie darauf, die zerbrechlichen ERG-Jet-Aufzeichnungselektroden zu schützen. Das Basisrauschen in PERG ist normalerweise kleiner als das in FVEP bei Ziegen. - Starten Sie die PERG-Aufzeichnung von beiden Augen gleichzeitig mit den Raumfrequenzen von 0,1, 0,3, 1,0, 3,0 und 12,6 Zyklen / Grad nacheinander. Für jede Ortsfrequenz werden 64 Spuren gemittelt, um eine Anzeige zu erhalten.
- Schalten Sie schließlich den Monitor aus, um PERG ohne visuellen Reiz als Negativkontrolle aufzuzeichnen.
HINWEIS: PERG-Signale sind normalerweise stabil und müssen nicht wiederholt werden. - Entfernen Sie die vordere Schädelschraube und wecken Sie die Ziege, indem Sie Idzoxan (1,5 mg/kg) injizieren, das ein Xylazin-Antagonist ist.
- Behandeln Sie die Ziege nach Vollnarkose mit Gentamicin (4 mg/kg IM) und Ceftiofur-Natrium (2 mg/kg IM), um eine Infektion zu verhindern.
- PERG-Messung und quantitative Analyse
- Stellen Sie den Bandpassfilter auf 1 bis 75 Hz ein. Für 3,0 cpd PERG ist der Bandpassfilter auf 1 bis 50 Hz eingestellt, um die Leiterbahn zu glätten, ohne ihre Amplitude zu beeinträchtigen.
- Wie in Abbildung 1C gezeigt, werden die ersten positiven und negativen Peaks in der Wellenform als P1 (typischerweise etwa 25 ms) und N1 (typischerweise etwa 55 ms) bezeichnet. Die PERG-Amplitude wird von N1 bis P1 gemessen.
- Im Falle einer monokulären Verletzung verwenden wir den interokularen Vergleich von Amplitude und impliziter Zeit, um die Intersessionsvariation zu reduzieren und die Empfindlichkeit zu reduzieren17.
4. PERG bei Rhesusaffen
HINWEIS: Es ist unklar, ob es ein interokulares Übersprechen des PERG-Signals im Rhesusaffen gibt, so dass PERG-Reaktionen von beiden Augen separat aufgezeichnet werden.
- Prüfungsvorbereitung
- Betäuben Sie den Affen mit Isofluran (1,5%-2%) nach Injektion von Zoletil50 (4-8 mg/kg IM, Tiletamin/Zolazepam) und Trachealintubation.
- Legen Sie eine sterilisierte Bodenelektrode subkutan auf den Frontalknochen. Führen Sie eine sterilisierte Nadelreferenzelektrode subkutan ein, 1 cm hinter dem seitlichen Canthus auf der gleichen Seite.
- Legen Sie nach topischer Anwendung des künstlichen Risses eine desinfizierte ERG-Jet-Aufnahmeelektrode auf die zentrale Hornhaut.
HINWEIS: Stellen Sie die Position der Hornhautelektrode ein, wenn sie sich nicht in der Mitte der Hornhautoberfläche befindet. - Verwenden Sie selbstklebendes undurchsichtiges schwarzes Klebeband, um ein Auge zu flicken.
- Stellen Sie einen Monitor (47,6 x 26,8 cm) in einem Betrachtungsabstand von 50 cm auf.
- Stellen Sie sicher, dass der Monitor so eingestellt ist, dass er parallel zur Pupillenebene verläuft. Richten Sie die Mitte des Monitors an der Pupillenebene aus.
- Stellen Sie sicher, dass sich das Schwarz-Weiß-Schachbrett mit einer Frequenz von 2,4 Hz umkehrt und das Seitenverhältnis 4:3 beträgt, das durch die Geräteeinstellungen festgelegt wird.
- Stellen Sie sicher, dass der Kontrast zwischen den weißen und schwarzen Prüfern 96% beträgt und die gemittelte Leuchtdichte 200 cd/m2 beträgt, was durch die Leuchtdichteanzeige überprüft wird.
- PERG-Aufzeichnung
- Dimmen Sie das Umgebungslicht und überprüfen Sie die Elektroden-Gewebe-Kontaktimpedanz.
- Stellen Sie sicher, dass die Impedanz unter 10 kΩ liegt. Wenn nicht, schließen Sie die Elektrode wieder an oder ersetzen Sie sie.
- Überprüfen Sie das Grundrauschen ohne Lichtstimulation.
- Flicken Sie ein Auge und starten Sie die PERG-Aufzeichnung vom anderen Auge aus bei Raumfrequenzen von 0,1, 0,3, 1,0, 3,0 und 12,6 Zyklen / Grad nacheinander.
- Wiederholen Sie die Schritte 4.2.1-4.2.4 für das kontralaterale Auge.
- Stoppen Sie die Isofluranversorgung, um den Affen zu erwecken.
- Behandeln Sie den Affen nach Vollnarkose mit Gentamicin (4 mg/kg IM) und Ceftiofur-Natrium (2 mg/kg IM), um eine Infektion zu verhindern.
- PERG-Messung und quantitative Analyse
- Wie in Abbildung 1D gezeigt, werden die ersten positiven und negativen Peaks in der Wellenform als P1 (typischerweise etwa 40 ms) und N1 (typischerweise etwa 85 ms) bezeichnet. Die PERG-Amplitude wird von N1 bis P1 gemessen.
- Im Falle einer monokulären Verletzung verwenden wir den interokularen Vergleich von Amplitude und impliziter Zeit, um die Variation zwischen den Volumina zu reduzieren und die Empfindlichkeit zu erhöhen17.
5. OCT bei Ziege
- Tierpräparation
- Anästhesieren Sie die Ziege mit Xylazin (3 mg / kg, IM) und intubieren Sie dann.
- Erweitern Sie die Pupille durch topische Verabreichung von mydriatischen Augentropfen mit Tropicamid (5%) und Phenylephrin (5%).
- Verwenden Sie das Augenlidspekulum, um die Pupille vollständig freizulegen.
- Legen Sie den Kopf der Ziege auf die Kinnstütze.
HINWEIS: Obwohl keine Gasanästhesie durchgeführt wird, intubieren Sie die Ziege regelmäßig, um die Atemwege vor der Kompression durch die Kinnstütze zu schützen.
- OCT-Bildgebung
HINWEIS: Die retinale OCT-Bildgebung wird in dieser Studie mit dem OCT-System bei einer Wellenlänge von 870 nm durchgeführt. Die optische axiale Auflösung des OCT-Scanners beträgt 12 μm. Der kreisförmige Scanmodus wird verwendet, um den Sehnervenkopf (ONH) mit hochauflösendem Modus zu scannen. 100 Bilder werden gemittelt, um die Bildqualität zu optimieren. Der detaillierte Schulungsleitfaden ist online verfügbar (siehe Materialtabelle).- Anfängliches OAT-Scannen (Baseline-Prüfung)
- Klicken Sie auf die Schaltfläche Start , um die Erkennungsschnittstelle aufzurufen. Warten Sie, bis das Gerät fertig geladen ist, und drücken Sie dann die gelbe Starttaste, um die Bildgebung zu starten.
- Richten Sie die Ziege mit der Infrarotkamera aus, um das ONH im konfokalen Bild der Scanning Laser Ophthalmoscopy (cSLO) zu zentrieren, indem Sie ihre Kopfposition ändern.
- Stellen Sie den Joystick so ein, dass das gesamte Infrarotbild gleichmäßig ausgeleuchtet wird, um die Bildqualität zu verbessern.
- Bewegen Sie den Joystick nach vorne, bis ein aufrechtes retinales OCT-Bild auf dem aufrechten Bildschirm angezeigt wird.
- Ändern Sie den Joystick so, dass er ein gleichmäßig dichtes und horizontal platziertes retinales OCT-Bild erhält.
- Drücken Sie die Taste am Joystick, um das Bild automatisch aufzunehmen, und halten Sie den Joystick gedrückt, um die Bildqualität auf dem Livebildbildschirm beizubehalten, bis die Bildaufnahme abgeschlossen ist. Drücken Sie dann auf Erwerben.
- Wecken Sie die Ziege durch Injektion von Idzoxan (1,5 mg/kg), einem Xylazin-Antagonisten.
HINWEIS: Die Zentrierung des ONH in der Baseline-Untersuchung hilft, den Baseline-Scan und den Follow-up-Scan entsprechend unserer Erfahrung auszurichten.
- Follow-up-OCT-Scans
- Wählen Sie ein hochwertiges OCT-Ausgangsbild aus. Klicken Sie mit der rechten Maustaste, und wählen Sie Referenz festlegen aus.
- Initiieren Sie die OCT-Bildgebung wie oben erwähnt.
- Drücken Sie die Nachverfolgungstaste , um die automatische Übereinstimmung des aktuellen Scans mit dem Referenzscan zuzulassen.
- Drücken Sie nach dem Abgleich (der kreisförmige Scanring wird grün) die Taste am Joystick, um das automatische Echtzeit-Tracking zu aktivieren.
- Wecken Sie die Ziege durch Injektion von Idzoxan (1,5 mg/kg), einem Xylazin-Antagonisten.
HINWEIS: Um den Prozess des Matchings zu erleichtern, (1) bewegen Sie das ONH im Live-Fenster, indem Sie den Kopf entsprechend drehen, oder (2) drehen Sie das ONH im Live-Fenster, indem Sie den Kopf neigen, damit das aktuelle cSLO-Bild dem Basislinienbild ähnlicher erscheint. Dieser vestibulo-okuläre Reflex wirkt gut unter Xylazin-Anästhesie19.
- Anfängliches OAT-Scannen (Baseline-Prüfung)
- OCT-Messung
- Klicken Sie auf die Schaltfläche Messung , um das Messfenster aufzurufen.
- Wählen Sie das Radiergummi-Werkzeug und löschen Sie die RNFL-Linie, die vom Programm automatisch beschriftet wird.
- Wählen Sie das Linienzeichnungswerkzeug , um die Berandung zwischen IPL und INL manuell zu umreißen (Abbildung 2).
HINWEIS: Die GCC-Dicke in sechs peripapillaren Regionen (T, TS, TI, N, NS, NI) und die gemittelte GCC-Dicke um das ONH (G) können auf dem Bildschirm abgelesen werden (Abbildung 2). Der Schülertest, die Einweg-ANOVA oder die Zwei-Wege-ANOVA können verwendet werden, um die OCT-Daten im Falle einer Normalverteilung zu quantifizieren.
6. OCT bei Rhesusaffen
- Führen Sie eine retinale OCT-Bildgebung bei Rhesusaffen mit der gleichen Ausrüstung und dem gleichen Verfahren durch wie bei ziegen.
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Representative Results
Abbildung 1A zeigt repräsentative Ergebnisse von FVEP bei Ziegen. Obwohl die Wellenformen bei gleicher Blitzintensität eine relative Ähnlichkeit aufweisen, empfehlen wir dennoch, die Wellenformen zweimal zu untersuchen. Elektromagnetische Wellen, die von elektronischen Geräten erzeugt werden, stören die gesammelten elektrischen Signale, was zu einem hohen Grundlinienrauschen und einer schlechten Wiederholbarkeit der Wellenform führt. Daher wird empfohlen, sicherzustellen, dass während der elektrophysiologischen Untersuchung keine redundanten elektronischen Geräte an die Umgebung angeschlossen werden, um solche Interferenzen zu vermeiden, und es wird empfohlen, mindestens zwei Messungen zu wiederholen, um die Stabilität und Wiederholbarkeit der experimentellen Ergebnisse zu bestimmen. Beim Flicken beider Augen sind die Wellenformen auf beiden Augen völlig flach, was zeigt, dass die Wellenformen sicherlich von unserem Blitzreiz ausgehen. Abbildung 1B zeigt repräsentative Ergebnisse von PERG bei Ziegen. Aufgrund seiner Stabilität und seines hohen Signals erfassen wir eine zuverlässige Wellenform nur durch einmalige Messung bei jeder Ortsfrequenz. Wenn die Ortsfrequenz zunimmt, übersteigt die Größe des Schachbretts allmählich die Erkennung der Augen der Ziege. Wir können also sehen, dass die PVEP-Wellenform bei 12,7 cpd stark gesunken ist. Analog zu FVEP verschwindet die Wellenform, wenn wir den Bildschirm schließen. Abbildung 1C zeigt repräsentative Ergebnisse von PVEP bei Rhesusaffen. Wir wiederholen die Messung zweimal bei jeder Ortsfrequenz. Wenn die Ortsfrequenz zunimmt, nimmt die Amplitude ab. Dies liegt daran, dass die Ortsfrequenz die Wahrnehmung des Auges übersteigt. Abbildung 1D zeigt repräsentative Ergebnisse von PERG bei Rhesusaffen. Der Grund, warum die Amplitude mit der Ortsfrequenz abnimmt, ist derselbe wie oben beschrieben. Bei der Analyse dieser Daten können Sie die Amplitude zwischen den Spitzen und Tälern oder die Latenzzeit der Spitzen oder Täler als Statistik analysieren.
Abbildung 2 zeigt die repräsentativen Ergebnisse der OCT bei Ziegen. Das Bild ganz links zeigt ein Fundusfoto, das mit einer Infrarotkamera aufgenommen wurde. Dicht rechts befindet sich ein Tomogramm der Netzhaut, das die Gesamtdicke der Netzhaut um das ONH und die Dicke jeder Schicht zeigt. Wie auf dem Bild gezeigt, können wir deutlich sehen, dass Ziegen größere netzhautliche Blutgefäße haben als Affen. Die grünen Scheiben ganz rechts sind eine quantitative Analyse der Dicke des GCC um das ONH. G steht für allgemein, T steht für temporale Seite, N steht für nasale Seite, S steht für superior und I steht für inferior. Die schwarze Schrift stellt den GCC-Dickenmesswert in Mikrometern dar, und die grüne Schrift ist der klinische Referenzmesswert für den Menschen, nicht als Referenz für dieses Experiment.
Abbildung 1: Repräsentative elektrophysiologische Wellenformen bei Ziegen- und Rhesusmakaken. (A) Repräsentative FVEP-Wellenformen mit unterschiedlichen Lichtintensitäten von einer einzelnen Ziege innerhalb derselben Anästhesiesitzung. (B,D) Repräsentative PERG-Wellenformen bei unterschiedlichen Raumfrequenzen von einer einzelnen Ziege (B) oder einem Rhesusaffen (D) innerhalb derselben Anästhesiesitzung. (C) Repräsentative PVEP-Wellenformen mit unterschiedlichen Raumfrequenzen von einem einzelnen Rhesusaffen innerhalb derselben Anästhesiesitzung. Die typische implizite Zeit jeder Wellenform wird im Abschnitt Protokoll erwähnt. n = 1 Probanden für jeden Test. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 2: OCT-Ergebnisse. Repräsentative retinale OCT-Bilder um den Sehnervenkopf (linkes Bild) und die Dicke des GCC in verschiedenen Peripapillarregionen (rechtes Bild) bei Ziege (A) und Rhesusmakake (B). n = 1 Probanden für jeden Test. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
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Discussion
In dieser Studie stellen wir ein Protokoll von VEP, PERG und OCT bei Ziegen und Rhesusaffen vor. Diese In-vivo-Methoden können in großen Tiermodellen verschiedener Optikusneuropathien wie Glaukom, ischämische oder traumatische Optikusneuropathie und Optikusneuritis9 angewendet werden.
PVEP ist stabiler und empfindlicher als FVEP17; es kann jedoch nicht in Ziege9 ausgelöst werden. Daher wird FVEP bei Ziegen und PVEP bei Rhesusaffen in unserem Labor durchgeführt, um die Integrität des retino-geniculo-kortikalen Signalwegs zu bewerten. Der Mechanismus, der der Beobachtung zugrunde liegt, dass PERG, aber nicht PVEP, bei Ziegen induziert werden kann, ist nach unserem Kenntnisstand noch unklar. Es ist möglich, dass sich die Funktion und Struktur des Sehnervs von der Ziege von der des Menschen unterscheidet.
Da die Amplitude von FVEP durch Pupillengröße und Umgebungslicht beeinflusst werden kann, erweitern wir die Pupille und legen während der FVEP-Aufnahme eine schwarze Decke über den Kopf der Ziege. Es sollte beachtet werden, dass eine Pupillenerweiterung für FVEP in Kliniken nicht erforderlich ist17. Obwohl die Dunkeladaption für die FVEP-Aufnahme in Kliniken nicht erforderlich ist, fanden wir heraus, dass eine 5-minütige Anpassung an das Umgebungslicht vor der FVEP-Aufzeichnung die Wiederholbarkeit der Amplitude innerhalb der Sitzung erhöhen kann.
Es wird angenommen, dass das PERG-Signal von den RGCs stammt und daher seine Amplitude verwendet werden könnte, um die Funktion der RGCs abzuschätzen13,20. Im Vergleich zu einigen speziellen Flash-ERG-Komponenten wie der skotopischen Schwellenreaktion (STR) und der photopischen negativen Reaktion (PhNR) ist PERG empfindlicher gegenüber RGC-Dysfunktion13. Mögliche Einschränkungen des PERG-Tests in dieser Studie sind wie folgt. Erstens empfiehlt ISCEV die Verwendung eines klassischen CRT-Stimulators (Kathodenstrahlröhre) für die PERG-Aufnahme, um die mittlere Leuchtdichte konstant zu halten. Der klassische CRT-Stimulator ist jedoch weniger verfügbar als die Flüssigkristallanzeige (LCD). Obwohl der BILDSCHIRM des LCD normalerweise während der Musterumkehr transiente Luminanzänderungen aufweist, die möglicherweise ein Luminanzartefakt verursachen17, trug er nach unserem vorherigen Ergebnis nicht zur Amplitude von PERG bei Ziege bei: Die Amplitude von PERG bei der Ortsfrequenz von 12,6 cpd ist im Vergleich zu denen bei niedrigeren Ortsfrequenzen normalerweise vernachlässigbar9 . Eine weitere Einschränkung ist, dass wir den Brechungsfehler vor dem PERG-Test der Einfachheit halber nicht korrigiert haben. Um diese Einschränkung auszugleichen, sollte die Basis-PERG-Amplitude als Referenz aufgezeichnet werden.
Unsere vorherige Studie hatte die Intra- und Inter-Session-Variation von VEP und PERG9 bewertet und optimiert. Wir fanden heraus, dass Isofluran im Vergleich zu Xylazin zu mehr wiederholbarem FVEP, aber variableren PERG-Wellenformen bei Ziegen führte9. Daher haben wir Isofluran im FVEP-Test und Xylazin im PERG- und OCT-Test bei Ziegen verwendet. Darüber hinaus ist die VEP-Aufzeichnung im Vergleich zu PERG möglicherweise variabler. Daher wiederholen wir regelmäßig die VEP-Aufzeichnung bei jeder Lichtintensität oder Ortsfrequenz, um die Intrasessionsvariation zu überprüfen. Im Gegensatz dazu sind PERG-Wellenformen viel stabiler. Daher wiederholen wir in der Regel keine PERG-Aufnahmen. Obwohl die wiederholte Aufnahme an einem anderen Tag zum gleichen Thema im Allgemeinen empfohlen wird, wiederholen wir aus Gründen der Einfachheit und Tierethik nicht regelmäßig VEP- oder PERG-Aufnahmen zum selben Thema an einem anderen Tag. Dennoch sind FVEP- und PERG-Aufnahmen ohne Wiederholung zwischen den Sitzungen empfindlich genug, um Sehnervverletzungen gemäß unserer vorherigen Studie zu erkennen9.
Die retinale OCT-Bildgebung ist eine bequeme, zuverlässige und nicht-invasive Technik zur longitudinalen Überwachung und Quantifizierung dynamischer Veränderungen der Netzhautstruktur. Im Vergleich zu PERG und VEP hat die OCT-Bildgebung eine viel bessere Intersessionswiederholbarkeit9. Darüber hinaus kann die OCT-Bildgebung die gesamte Sehnervenfaser innerhalb von Minuten ohne Probenahmefehler erfassen und quantifizieren, was eine viel billigere und effektivere Möglichkeit bietet, die Netzhautstruktur zu untersuchen als die herkömmliche histologische Analyse. Die räumliche Auflösung der aktuellen OCT-Bildgebung ist jedoch immer noch zu begrenzt, um einzelne RGC-Soma oder Sehnervenfasern zu erkennen. Darüber hinaus sollte beachtet werden, dass ein dickerer GCC, gemessen mit OCT, nicht unbedingt eine intaktere innere Netzhaut bedeutet, da eine GCC-Verdickung durch Netzhautödeme oder Blutungen verursacht werden kann.
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Disclosures
Die Autoren haben keine Interessenkonflikte offenzulegen.
Acknowledgments
Diese Studie wurde durch die folgenden Zuschüsse finanziert: National Key R&D Program of China (2021YFA1101200); Medizinisches Forschungsprojekt von Wenzhou (Y20170188), National Key R&D Program of China (2016YFC1101200); Nationale Naturwissenschaftliche Stiftung Chinas (81770926;81800842); Wichtiges F&E-Programm der Provinz Zhejiang (2018C03G2090634); und Key R&D Program des Wenzhou Eye Hospital (YNZD1201902). Der Sponsor oder die Förderorganisation hatte keine Rolle bei der Gestaltung oder Durchführung dieser Forschung.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 47.6 x 26.8 cm monitors | DELL Inc. | E2216HV | The visual stimuli of contrast-reversal black-white checkerboards were displayed on screens |
| 6.0 mm tracheal tube | Henan Tuoren Medical Device Co., Ltd | PVC 6.0 | ensure the airway |
| alligator clip | |||
| atropine | Guangdong Jieyang Longyang Animal pharmaceutical Co.,Ltd. | reduce bronchial secretion and protect heart from vagal nerve activation | |
| Carbomer Eye Gel | Fabrik GmbH Subsidiary of Bausch & Lomb | moisten the cornea and stabilize the recording electrodes | |
| ERG-Jet recording electrodes | Roland Consult Stasche&Finger GmbH | 2300 La Chaux-De-Fonds | ERG recording |
| eye speculum | Shanghai Jinzhong Medical Device Co., Ltd | ZYD020 | open palpebral fissure |
| Heidelberg Spectralis OCT system | Heidelberg Engineering | OCT system | |
| Imaging | (https://www.heidelbergengineering.com/media/e-learning/Totara-US/files/pdf-tutorials/2238-003_Spectralis-Training-Guide.pdf) | ||
| isoflurane | RWD Life Science Co., Ltd | R510-22 | isoflurane anesthesia |
| male Saanen goats | Caimu Livestock Company, country (Hangzhou, China) | The male Saanen goats, aged from 4 to 6 months with weight of 19–23 kg | |
| needle electrode | Roland Consult Stasche&Finger GmbH | U51-426-G-D | use for FVEP ground electrode and PERG reference electrodes |
| periphery venous catheter intravenously | BD shanghai Medical Device Co., Ltd | 383019 | intravenous access for atropine and propofol |
| propofol | Xian Lipont Enterprise Union Management Co.,Ltd. | induce Isoflurane anesthesia in goat | |
| Tropicamide Phenylephrine Eye Drops | SANTEN OY, Japan | 5% tropicamide and 5% phenylephrine hydrochloride | |
| visual electrophysiology device | Gotec Co., Ltd | GT-2008V-III | use for FVEP & PERG |
| xylazine | Huamu Animal Health Products Co., Ltd. | xylazine anesthesia: intramuscular injection of xylazine 3mg/kg | |
| zoletil50 | Virbac | induce Isoflurane anesthesia in monkey |
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