Desenvolvimento de um modelo de co-cultura celular para imitar isquemia cardíaca/reperfusão in vitro

A doença isquêmica do coração é a principal causa de morte e incapacidade em todo o mundo ^1,2. No entanto, o processo de tratamento da reperfusão pode causar a morte por cardiomiócito, conhecido como isquemia miocárdica/reperfusão (IR), para o qual ainda não há remédio efetivo³. Células endoteliais (CE) têm sido sugeridas para proteger cardiomiócitos (CMs) através da secreção de sinais paracrírinos, bem como interações célula-célula⁴.

Modelos de cocultura celular têm sido usados extensivamente para investigar o papel das interações células autocririnas e/ou paracrinas na função celular e diferenciação. Entre os modelos de cocultura, a cocultura mista é a mais simples, onde dois tipos diferentes de células estão em contato direto dentro de um único compartimento de cultura na proporção^{celular desejada 5}. No entanto, tratamentos separados entre tipos celulares e análise a jusante de um único tipo de célula não são facilmente viáveis dada a população mista.

Estudos anteriores indicaram que insultos hipóxicos e isquêmicos causam danos significativos à integridade da membrana celular, medida pela liberação de lactato desidrogenase (LDH). Esta lesão é agravada após a reoxigenação, imitando lesão de reperfusão ^6,7,8. O objetivo do protocolo atual foi testar as hipóteses de que a presença de CE pode atenuar a membrana celular dependente de CMs causada por hipóxia e reoxigenação (HR) e que o efeito protetor das CEs pode ser otimizado variando a distância de contato entre as duas linhas celulares. Assim, empregamos três tipos de inserções de cultura celular e células endotelias da artéria coronária primária do rato e cardiomiócitos de camundongos adultos. As pastilhas, marcadas por Corning, Merck Millipore e Greiner Bio-One, nos permitiram criar três diferentes condições de crosstalk de cultura celular com distâncias de linha intercelular de 0,5, 1,0 e 2,0 mm, respectivamente. 100.000 CEs foram emplacados por inserção em cada caso.

Além disso, para determinar se a densidade de CEs na cocultura contribui para a atenuação de lesões de RH neste modelo, estudamos a relação dose-resposta entre concentração de CE e liberação de LDH por CMs. As CE foram emplacar em 25.000, 50.000 e 100.000 por inserção, respectivamente, na inserção de 2,0 mm.

Este relatório fornece uma abordagem passo a passo para que os investigadores usem este importante modelo a seu favor.

1. Preparação/revestimento experimental

1. Mantenha CMs e CEs de acordo com as instruções do fabricante.
   1. Descongele as duas linhas de celular quando chegarem dos vendedores. Placa em frascos T25 depois de ser lavada com mídia fresca. Recomenda-se a compra de cada mídia de cultura celular dos mesmos fornecedores de onde as células foram compradas. No dia seguinte, refresque as células com mídia e use quando confluente.
   2. Mantenha a incubadora de cultura celular a 37 °C com 21% O₂, 5% CO₂, 74% N₂ e mantenha umidificada.
      NOTA: As células endotelias da artéria coronária primária do rato utilizadas neste protocolo são isoladas das artérias coronárias de camundongos C57BL/6, e os Cardiomiócitos do Rato Adulto são isolados dos corações de camundongos adultos C57BL/6J e obtidos comercialmente (ver Tabela de Materiais).
2. CMs de placa em condições estéreis na parte inferior de placas de 24 poços (camada inferior). 24 h depois, placaS ECs na pastilha (ou porção superior) do bem co-cultura. 24 h após o revestimento ce, coloque as pastilhas EC nas bases das placas CM, iniciando o período de cocultura. Deixe as células co-cultura por pelo menos 12-24 h antes de usar. Estas etapas são descritas em detalhes abaixo.
   1. Estimar a confluência da linha celular CM sob um microscópio leve. Quando as células parecem ser 90%-100% confluentes em frascos de cultura, proceda com revestimento experimental.
   2. Remova a mídia dos frascos contendo culturas celulares confluentes e tente com 3-5 mL de ácido trippsin/ethylenodiaminetetraacético (EDTA) para frascos T25. Agitar o frasco suavemente, incubar a 37 °C por 2-5 min e, em seguida, avaliar o progresso enzimático sob um microscópio leve. Uma vez que as células comecem a arredondar, use um raspador de células para separar as células da superfície.
   3. Após o desprendimento, inative a solução de trippsina adicionando a solução trypsin/célula a um tubo de 50 mL contendo 10 mL de mídia para frascos T25. Centrifugar a suspensão celular a 120 x g por 2 min para obter uma pelota de célula macia. Remova o supernatante e resuspenda a pelota em 5 mL de mídia.
   4. Para realizar a contagem celular e confirmar a viabilidade celular, misture uma alíquota de 10 μL de células resuspended e 10 μL de corante azul trypan. Conte as células vivas usando um contador de células. Diluir as células com novas mídias regulares para alcançar as densidades de semeadura desejadas. Os volumes são calculados dependendo da densidade de sementes desejada e da concentração celular das soluções de estoque. Todo o revestimento deve ser realizado em condições estéreis.
   5. CMs de placa em densidades de semeadura de 300.000 por poço na parte inferior de uma placa de 24 poços pré-revestida com matriz extracelular. Mantenha as células a 37 °C com 21% O_{2 e} 5% DE CO₂ durante a noite.
   6. Após 24h, a placa ECs em inserções a uma densidade ideal de revestimento de 100.000 por inserção (a área de cultura é de 33,6 mm²), (Figura 1). Após 24 horas de revestimento ce, coloque as pastilhas EC dentro dos poços CM, iniciando a cocultura. Permitir que as células co-cultuam por 12-24 h antes de realizar os experimentos.
   7. Certifique-se de que, quando os experimentos forem realizados, tanto os CMs quanto os CEs atingiram 80%-90% de confluência.

2. Hipoxia/reoxigenação para simular isquemia/lesão de reperfusão in vitro

NOTA: As seguintes etapas precisam ser executadas conforme descrito, não faça uma pausa no meio.

1. Prepare a mídia hipóxica derramando ~25 mL de mídia em um tubo cônico de 50 mL. Feche a parte superior com uma membrana de silicone e use uma pipeta esterilizada para fazer um buraco. Crie outro buraco, desta vez deixando a pipeta submersa aproximadamente 2/3 na mídia.
2. Lave a mídia com gás hipóxico (0,0125% O₂, 5% CO₂, 94,99% N₂) por 5 min a uma vazão de 30 L/min. Isso minimiza o O₂ dissolvido na mídia quando a hipóxia começa (passo 2.5).
3. Descarte a mídia das placas de 24 poços ou inserções de cultura contendo células anexadas e lave com 100 μL/well de 10% de Salina Tamponada fosfato (PBS) muito suavemente. Posteriormente, adicione 500 μL da mídia hipoxica recém-preparada a cada poço das placas ou pastilhas.
   NOTA: A hipóxia na mídia é interrompida o mais brevemente possível durante esta etapa antes que a verdadeira hipóxia para células e mídia comece na etapa 2.5.
   1. No grupo de controle normoxic, substitua a mídia original por mídia normal fresca contendo glicose e soro.
4. Umidifice a câmara de hipóxia colocando uma placa de Petri cheia de água estéril dentro da câmara. Em seguida, coloque as placas que compõem os grupos hipóxicos na câmara.
5. Lave a câmara de hipóxia com gás hipóxico (0,0125% O₂, 5% CO₂, 94,99% N₂) por 5 min a um fluxo de 30 L/min. Coloque a câmara na incubadora de 37 °C por 24 horas.
6. Após a hipóxia, cultive CMs e CEs em condições normais. Para isso, descarte a mídia antiga das placas/pastilhas, substitua-a por mídia normal (contendo glicose e soro; 500 μL de cada poço/inserção) e armazene-a na incubadora em condições normais de cultura (21% O₂, 5% CO₂, 74% N₂, 37 °C) por 2 h para imitar reperfusão.
7. Para controlar quaisquer efeitos da substituição da mídia, mude a mídia das células normoxicas ao mesmo tempo em que a mídia hipóxica é alterada.
   NOTA: A Figura 2 fornece uma visão geral esquemática deste protocolo.

3. Avaliação do ponto final

1. Transfira a mídia de cultura celular da placa de 24 poços para uma placa de 96 poços. Use 200 μL de mídia de cada poço da placa de 24 poços e distribua igualmente em quatro poços da placa de 96 poços, em conformidade. Use uma placa cada para normoxia versus hipóxia versus HR.
2. Determine o grau de lesão celular, por exemplo, medindo a absorvência para LDH usando um kit de ensaio de citotoxicidade seguindo as instruções do fabricante. Execute o ensaio em uma placa de 96 poços como instruído no protocolo de ensaio.

4. Estatísticas

1. Exibir os dados paramétricos como desvio médio/padrão e dados não paramétricos como gráficos de caixa com intervalo mediano/interquartil. Testes de comparações paramétricas e não paramétricas adequadas com testes pós-hoc aceitáveis para diminuir a chance de um erro tipo 1 devem ser realizados. O significado é tipicamente definido em um alfa de 0,05 (duas caudas).
2. Para todos os experimentos realizados no presente estudo, realize pelo menos três bem-replicações dentro de um experimento. Houve três a seis repetições de cada experimento utilizado para análise estatística.

Todos os três tipos de pastilhas (A, B, C) utilizadas neste experimento têm o mesmo tamanho de poros de 0,4 μm. A única diferença entre eles é a altura insert-to-base, que permite que as distâncias entre as duas camadas de células co-cultivadas sejam 0,5, 1,0 e 2,0 mm, respectivamente, (Figura 3) e que são de diferentes fornecedores (para detalhes ver Tabela de Materiais).

Para estabelecer um modelo de co-cultura in vitro com camadas separadas de duas linhas celulares submetidas ao RH para simular lesões de IR, examinamos a integridade da membrana celular de CMs co-cultivados com ou sem CE. A utilização de uma inserção separada para CEs que podem ser colocadas a distâncias variadas acima da camada cm permitiu também avaliar os efeitos diferenciais da distância da camada celular sobre a gravidade dos danos causados pela membrana nos CMs. Em um conjunto separado de experimentos, variamos a densidade das CE e, portanto, a razão de CEs para CMs. Além disso, para diferenciar isquemia simulada da lesão de IR simulada, foram realizados experimentos em condições de 1) normoxia, 2) apenas hipoxia e 3) HR. Para este modelo, utilizamos 24 h de hipóxia, seguida de reoxigenação de 2h.

Distâncias variáveis
Distância de 0,5 mm entre as camadas celulares (Inserir A)
Quando os CMs foram cultivados sozinhos, a hipóxia levou a um aumento significativo da liberação de LDH em comparação com a normoxia, consistente com nossos estudos anteriores (Figura 4A)6. No entanto, o LDH só aumentou ligeiramente após a reoxigenação de 2h em comparação com o grupo somente de hipóxia. Quando os CES e os CMs foram co-cultivados a uma distância de 0,5 mm, o aumento da liberação de LDH por hipóxia apenas não foi atenuado indicando que as CES não apresentaram nenhum efeito protetor (em comparação com o grupo apenas de CMs sob as condições somente de hipóxia). No entanto, as CES exerceram uma proteção leve, mas significativa, sobre os CMs durante o RH.

Distância de 1,0 mm entre as camadas celulares (Inserir B)
O mesmo experimento foi realizado como acima, exceto que a distância entre as duas camadas celulares foi aumentada para 1,0 mm (Figura 4B). Descobrimos que a liberação de LDH também foi significativamente aumentada em CMs somente por hipoxia. No entanto, ao contrário da inserção de 0,5 mm, o aumento do LDH apenas em CMs foi potencializado pelo RH apenas por causa da hipóxia. Além disso, essa potencialização foi mais inibida e quase abolida pela presença das CE durante a reoxigenação em comparação com o grupo somente CMs.

Distância de 2,0 mm entre as camadas celulares (Inserir C)
Quando foram utilizadas inserções de cocultura que criam uma distância de 2,0 mm entre as duas linhas celulares (Figura 4C), também encontramos um aumento significativo da liberação de LDH apenas por CMs durante a hipóxia, no mesmo grau que nos experimentos de 0,5 mm e 1,0 mm. Curiosamente, no entanto, o aumento adicional na liberação de LDH por reoxigenação foi ainda mais acentuado do que nos experimentos de 1,0 mm. Ambos os aumentos foram atenuados, embora não abolidos, pela presença de CEs, indicando que diferente do uso de pastilhas de 0,5 ou 1,0 mm, as CES protegiam significativamente os CMs de lesões sob condições de hipóxia e DE RH.

Intensidades variáveis de CE
Em um conjunto diferente de experimentos, a concentração de CEs emplacados em pastilhas de 2,0 mm foi titulada para 25.000, 50.000 e 100.000 células por inserção, respectivamente. A liberação do LDH foi medida após 24 h de hipóxia seguida de reoxigenação de 2 h. Nossos resultados mostraram que o aumento da intensidade da CE na cocultura levou a uma atenuação dependente de dose da liberação de LDH causada pelo RH (Figura 5); nenhum efeito desse tipo foi visto sob condições normóxias.

Figura 1: Esquema de inserção dentro do poço. As pastilhas com os CES (até 100.000 células por inserção) são transferidas para as placas de 24 poços com os CMs (300.000 por poço) em seu fundo. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 2: Design experimental. As células são cultivadas em condições normais de oxigênio (21% O2), e depois divididas em dois grupos: um grupo de controle normóxico continuará a ser cultivado em condições normais por mais 24 h, enquanto o grupo de hipóxia será cultivado em uma câmara de hipóxia por 24 h com apenas 0,01% O2 e sem glicose. Após essas intervenções de 24h, ambos os grupos de células são atualizados com mídia e cultivados continuamente em um ambiente O 2 de2 por mais 2 h, a fase de reoxigenação, antes de eventualmente realizar o ensaio final(s), por exemplo, análise LDH. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 3: Imagens e esquemas das três pastilhas diferentes. A distância entre as células endoteliais na pastilha e os cardiomiócitos na parte inferior do poço pode ser variada usando diferentes pastilhas. Todos os três tipos de pastilhas utilizadas aqui têm o mesmo tamanho de poros de 0,4 μm. A única diferença entre eles é a altura insert-to-base, que permite que as distâncias entre as duas camadas de células co-cultivadas sejam 0,5 (A), 1,0 (B) e 2,0 mm (C), respectivamente. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 4: Comparação de três tipos de inserções culturais na avaliação da liberação de lactato de desidrogenase (LDH; em unidades de absorção [au]) sob condições normóxicas (esquerda), apenas hipoxia (centro) e hipoxia/reoxigenação (direita) apenas para cardiomiócitos (CM; branco), células endoteliais sozinhas (CE; preto) e co-culturas de CM com EC (padrão de verificação). (A) 0,5 mm de distância, (B) 1,0 mm de distância, (C) distância de 2,0 mm entre as duas camadas celulares diferentes. Os CE foram banhados a uma densidade de 100.000 células por inserção, CMs a uma densidade de 300.000 células por poço. Os dados são ± desvio padrão, n = 4 por grupo. Estatísticas: ANOVA seguido pelo teste pós-hoc student-Newman-Keuls. P < 0,05 (duas caudas) indicadas por barras horizontais entre cada par comparado. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 5: Concentração de células endoteliais co-cultivadas (CE; 25: 25.000 células por inserção; 50: 50.000 células por inserção; 100: 100.000 células por inserção) dose dependente de proteção dependente de cardiomócitos (CM) contra hipoxia/reoxigenação lesão (direita) em comparação com as condições normóxicas (esquerda) como evidenciado pela liberação de lactato dehidrogênioase (LDH; inance absorb unidades [au]). As CES não tiveram efeito na liberação de LDH sob condições normoxic. Os dados são ± desvio padrão, n = 4 por grupo. Estatísticas: ANOVA seguido pelo teste pós-hoc student-Newman-Keuls. P < 0,05 (duas caudas) indicadas por barras horizontais entre cada par comparado. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Os autores não declaram conflitos de interesse.