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Artigo de método

Preparação e implantação de eletrodos para kindling elétrico de camundongos VGAT-CRE para gerar um modelo para epilepsia do lobo temporal

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DOI:

10.3791/62929

⸱

17 de agosto de 2021

 ,  ,  , 
1Department of Pharmacology, University of Virginia, 2UVA Brain Institute, University of Virginia

Neste artigo

Resumo

Este relato descreve os métodos para gerar um modelo de epilepsia do lobo temporal baseado no kindling elétrico de camundongos VGAT-Cre transgênicos. Camundongos VGAT-Cre acesos podem ser úteis para determinar o que causa epilepsia e para rastrear novas terapias.

Resumo

Descobriu-se que o kindling elétrico de camundongos VGAT-Cre levou a convulsões motoras e eletrográficas espontâneas. Um artigo recente concentrou-se em como camundongos VGAT-Cre únicos foram usados no desenvolvimento de convulsões recorrentes espontâneas (SRS) após o kindling e um provável mecanismo - inserção de Cre no gene VGAT - interrompeu sua expressão e reduziu o tônus gabaérgico. O presente estudo estende essas observações a uma coorte maior de camundongos, concentrando-se em questões-chave, como quanto tempo o SRS continua após o acender e o efeito do sexo e da idade do animal. Este relato descreve os protocolos para as seguintes etapas principais: confecção de fones de ouvido com eletrodos de profundidade hipocampal para estimulação elétrica e leitura do eletroencefalograma; cirurgia para fixar o fone de ouvido de forma segura no crânio do mouse para que ele não caia; e os principais detalhes do protocolo de kindling elétrico, como duração do pulso, frequência do trem, duração do trem e quantidade de corrente injetada. O protocolo de kindling é robusto na medida em que conduz de forma confiável à epilepsia na maioria dos camundongos VGAT-Cre, fornecendo um novo modelo para testar novas drogas antiepileptogênicas.

Introdução

A epilepsia é um importante distúrbio neurológico com significativos encargos econômicos e humanos. O NINDS estima que existam 3 milhões de americanos com epilepsia. Aproximadamente 0,6 milhão desses pacientes apresentam epilepsia do lobo temporal (ELT)1. Infelizmente, o tratamento clínico da ELT falha em um terço dos pacientes devido à ineficácia, desenvolvimento de resistência aos medicamentos ou intolerância aos efeitos colaterais2. Claramente, há uma necessidade significativa de desenvolver novas terapias para ELT, uma conclusão compartilhada pelo Comitê de Ciência Básica da Sociedade Americana de Epilepsia, pelo Grupo de Trabalho da Liga Internacional Contra a Epilepsia para a Descoberta de Drogas Pré-Clínicas para Epilepsia e pelo Conselho Nacional Consultivo de Distúrbios Neurológicos e AVC 3,4.

Os modelos animais atuais de epilepsia do lobo temporal utilizam quimioconvulsivantes (por exemplo, cainato, pilocarpina) ou estimulação elétrica prolongada para induzir um estado de mal epiléptico de longa duração 5,6,7. Muitos animais morrem durante o procedimento (10%-30% em ratos, até 90% em camundongos8). Animais que sobrevivem e desenvolvem epilepsia apresentam morte neuronal extensa em todo o encéfalo 9,10. Essa morte desencadeia uma cascata de respostas, começando com a ativação de micróglias, astrócitos e monócitos infiltrantes. As respostas neuronais incluem reorganização de circuitos (por exemplo, brotamento de fibras musgosas), nascimento de novos neurônios que não conseguem se integrar adequadamente em circuitos (por exemplo, células de grânulos ectópicos) e mudanças intrínsecas que levam à hiperexcitabilidade (por exemplo, upregulation de canais de Na+). Um modelo de epilepsia sem morte neuronal significativa facilitará a busca de novas drogas antiepilépticas.

Ao testar a hipótese GABA de epilepsia, descobriu-se que o tratamento de camundongos VGAT-Cre com um protocolo leve de kindling elétrico levou a convulsões motoras e eletrográficas espontâneas11. Em geral, o kindling elétrico de roedores não leva a crises espontâneas que definem epilepsia, embora possa, em casos de over-kindling11. Camundongos VGAT-Cre expressam Cre recombinase sob o controle do gene transportador vesicular de GABA (VGAT), que é especificamente expresso em neurônios inibitórios GABAérgicos. Verificou-se que a inserção de Cre interrompeu a expressão de VGAT nos níveis de RNAm e proteína, prejudicando assim a transmissão sináptica GABAérgica no hipocampo. Concluiu-se que camundongos VGAT-Cre acesos podem ser úteis para estudar os mecanismos envolvidos na epileptogênese e para a triagem de novas terapêuticas11. O presente relatório fornece os métodos usados na geração do modelo em detalhes.

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Protocolo

O uso de animais seguiu as diretrizes do ARRIVE12 e foi aprovado pelo Comitê de Cuidados e Uso de Animais da Universidade da Virgínia.

1. Confecção de fones de ouvido com dois eletrodos bipolares (Figura 1)

figure-protocol-1
Figura 1: Principais etapas na fabricação de fones de ouvido de EEG. (A) Aparecimento dos eletrodos nas várias etapas do protocolo (números no passo da correspondência esquerda). (B) Uma foto do produto final montado em um suporte caseiro que se encaixa na moldura estereotáxica. Note, o suporte termina com um conjunto de pinos de colarinho que se encaixa no pedestal do fone de ouvido. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

  1. Corte 3,5 cm de fio de aço inoxidável revestido de politetrafluoretileno inoxidável.
  2. Retire cerca de 1 mm da camada de isolamento do fio em ambas as extremidades. Não tenha muito do fio descascado.
  3. Coloque dois pinos em um suporte de morsa com a parte inferior do pino que tem uma fenda mais longa voltada para baixo.
  4. Aplique o fluxo nas extremidades descascadas do fio e na parte superior dos pinos.
  5. Tin a parte descascada do fio com apenas solda suficiente para revesti-lo.
  6. Adicione uma quantidade mínima de solda à parte superior do pino sem transbordar para as laterais.
  7. Coloque uma extremidade das extremidades descascadas do fio no pino o mais profundo que ele permitir, enquanto a solda é derretida.
    NOTA: Existe um orifício lateral onde o fio pode sair - não deixe o fio sair do pino. Todo o fio descascado deve ficar dentro do pino.
  8. Repita as etapas 1.6-1.7 para o segundo pino, agora com as outras extremidades descascadas do fio.
  9. Deixe os pinos descansar por 30 s para ajustar, retire-os do suporte da morsa e, em seguida, puxe-os para garantir que a conexão entre o fio e os pinos seja forte e se mantenha.
  10. Enxágue os pinos em água fria e depois seque.
  11. Verifique a condutância entre o pino 1 e o pino 2 usando um ohmímetro.
  12. Junte os pinos nas extremidades do fio; segure-os paralelos e próximos. Aperte um hemostático no centro do fio. Em seguida, gire o hemostático, para que o fio se torça em torno de si mesmo bastante apertado. Remova o hemostático.
  13. Aperte uma pinça no fio torcido 2 mm abaixo dos pinos e dobre o fio a 90°.
  14. Empurre o mesmo fio novamente 90° para trás sobre a pinça criando outra curvatura a 1 mm da primeira.
  15. Corte o fio torcido em um ângulo de 45° abaixo da curvatura a 3,5 mm com uma pequena tesoura afiada.
  16. Prepare dois desses eletrodos bipolares (com duplo pino torcido) para cada fone de ouvido (opcional, o segundo é o backup em caso de problemas elétricos com o primeiro).
  17. Preparar um único eletrodo de referência cortando um fio com pinos soldados em ambas as extremidades em dois (passos 1.1-1.17, Figura 1A).
  18. Corte o fio a 7 mm.
  19. Dobre a extremidade 1 mm abaixo da ponta.
  20. Em seguida, cubra a ponta dobrada de 1 mm do fio com pinça e gire o fio firmemente ao redor da pinça para criar um pequeno laço (1 mm de diâmetro).
  21. Dobre o laço perpendicularmente à parte reta do fio para fazer com que a ponta do fio aponte para fora novamente.
  22. Montar os dois eletrodos bipolares e o eletrodo de referência único no pedestal de seis pinos de forma que os eletrodos bipolares fiquem lado a lado com 6 mm de distância entre eles, e que o eletrodo de referência seja colocado no orifício externo médio (Figura 1B).
    NOTA: Um método alternativo é implantar os eletrodos, cimentá-los no lugar e, em seguida, inserir seus pinos no pedestal.

2. Implantação de eletrodos estereotáxicos

  1. Esterilizar todas as ferramentas cirúrgicas e a montagem do eletrodo de seis pinos por autoclavação antes da cirurgia. Um campo cirúrgico estéril deve ser mantido durante a cirurgia, e luvas cirúrgicas estéreis devem ser usadas. Campos estéreis (por exemplo, Press n' Seal) são recomendados para cobrir o animal, exceto para a área cirúrgica.
  2. Use camundongos VGAT-Cre de 8 semanas de idade (pareados por idade, machos e fêmeas) para cirurgias 4 semanas após o desmame. Registrar o peso do animal antes da cirurgia para permitir a mensuração da perda de peso pós-cirúrgica.
  3. Use um vaporizador de isoflurano certificado ou um sistema de anestesia de baixo fluxo equipado com uma bomba de seringa de precisão, vaporizador digital integrado e almofada térmica de feedback.
    NOTA: Os sistemas de baixo fluxo são capazes de fornecer anestesia a baixas taxas de fluxo proporcionais ao tamanho do animal em uma câmara de indução ou através de um cone nasal no quadro estereotáxico (70 mL/min, a concentração de isoflurano no ar é de 4% para indução e 2% para cirurgia). Usar menos anestesia não só beneficia o animal durante as cirurgias, mas também reduz o risco de exposição do pessoal do laboratório ao isoflurano.
  4. Coloque o animal anestesiado em uma almofada aquecida aquecida a 37 °C para mantê-lo aquecido durante a cirurgia. Se estiver usando um sistema de temperatura controlado por feedback, insira a sonda de temperatura levemente lubrificada no reto do animal para monitoramento de temperatura durante a cirurgia.
  5. Monte o animal na estrutura estereotáxica colocando suavemente as barras auriculares nas orelhas e os dentes superiores da frente na barra do incisivo. Coloque o cone nasal sobre o nariz para a administração adequada da anestesia. Certifique-se de que a cabeça está nivelada e centralizada e não pode ser movida quando ligeiramente sondada.
  6. Injetar por via subcutânea 0,5 mL de normosol para hidratação.
  7. Aplique lubrificante ocular para evitar o ressecamento da córnea.
  8. Monitorar a profundidade da anestesia pela ausência do reflexo de retirada após pinçar um dedo do pé e, em seguida, diminuir o isoflurano para 1,5%-2,0% durante a cirurgia.
  9. Remover os pelos na área cirúrgica e ao redor dela, arrancando ou usando cortadores (barbear) ou creme depilatório, e desinfetar a pele com três ciclos de aplicação alternada de iodo e etanol, finalizando com iodo. A remoção dos pelos para longe do local cirúrgico é recomendada apenas se houver meios de manter a anestesia nesse local. Se necessário, use aplicadores de ponta de algodão mergulhados em álcool para remover os pelos da área imediata ao redor da cabeça. Injetar 0,05 mL do analgésico local bupivacaína (0,25%) por via subcutânea.
  10. Faça uma incisão no crânio usando um bisturi e, em seguida, corte uma parte da pele com uma tesoura cirúrgica afiada, expondo o crânio. Empurrando a pele para o lado, usando um cotonete, limpe o crânio de todos os músculos e tecidos subjacentes que obstruem a visão.
    NOTA: Para parar o sangramento acidental, aplique pressão sobre o local do sangramento com um cotonete estéril até que pare.
  11. Limpe o crânio com peróxido de hidrogênio usando cotonetes estéreis para tornar visíveis as suturas cranianas e tanto o bregma quanto o lambda.
  12. Seque bem o crânio e, em seguida, aplique uma gota de adesivo dental autocondicionante usando seu aplicador. Escove-o no crânio, espere 60 s e cure com uma luz UV dental por 40 s. Uma superfície brilhante indica que o adesivo foi efetivamente reticulado com o crânio.
    NOTA: Esta etapa é crítica para a conexão segura do fone de ouvido.
  13. Use uma broca de 0,031" (0,79 mm) para perfurar dois furos de rebarba bilateralmente para implantação de eletrodos de profundidade hipocampal (aproximadamente 5.000 rpm). Faça um furo extra para o eletrodo de referência acima do cerebelo atrás do lambda.
    NOTA: Ao perfurar, tome cuidado para abaixar a broca lentamente e evitar perfurar o cérebro.
  14. As coordenadas para os eletrodos são as seguintes (de bregma em mm): eletrodos hipocampais a 3 mm posteriores, 3 mm laterais e 3 mm de profundidade; e eletrodo de referência cerebelar a 6 mm posterior, 0 mm lateral e 0 mm de profundidade (subdural).
  15. Para aumentar a precisão, use uma furadeira montada estereotaxicamente, zere o eixo X/Y do manipulador estereotáxico ao tocar o bregma - este é o ponto de referência para as coordenadas.
  16. Monte um fone de ouvido inserindo todos os eletrodos no pedestal de seis pinos, certificando-se de que os pinos sejam empurrados até o pedestal. Monte o pedestal no suporte do eletrodo sobre uma estrutura estereotáxica (Figura 1B).
  17. Alinhe os eletrodos acima dos orifícios de rebarba correspondentes. Estereotaxicamente implante eletrodos de fio de aço inoxidável bipolares torcidos no hipocampo direito e esquerdo e eletrodo de referência no cerebelo, baixando lentamente o fone de ouvido e guiando os eletrodos para os orifícios da rebarba.
  18. Quando o eletrodo de torção hipocampal estiver logo acima do furo, zere o eixo Z e abaixe lentamente até -3,0 mm.
  19. Cobrir a superfície do crânio e os eletrodos com cimento dentário e preencher o espaço entre a superfície do crânio e o fundo do pedestal. As bordas da pele estarão adjacentes ao cimento dentário de tal forma que nenhum tecido subjacente permanecerá exposto. Espere o cimento secar e endurecer. Em seguida, retire o suporte do eletrodo do braço estereotáxico e remova o suporte do pedestal.
  20. Injetar 0,1 mL de cetoprofeno (1 mg/mL, SC) para analgesia e uma segunda dose de 0,5 mL de normosol (SC) para hidratação e retirar o animal do quadro estereotáxico.
  21. Coloque uma almofada isotérmica pré-aquecida a 37 °C dentro de uma gaiola de biotério vazia coberta com um papel toalha. Quando estiver totalmente acordado, coloque o animal em uma gaiola limpa, com roupa de cama e alimentos macios, e devolva-o ao biotério. Os animais são alojados sozinhos a partir deste ponto para evitar mastigar os fones de ouvido uns dos outros. Os funis de barra de arame não são usados para evitar que os fones de ouvido fiquem presos e, em vez disso, as garrafas de água são amarradas na parte inferior dos topos da gaiola e a ração está presente na cama.
  22. Alimente o animal com ração macia por 72 h após a cirurgia e monitore a perda de peso e o escore de condição corporal. Animais desidratados podem receber 0,5 mL de normosol por via subcutânea se desidratados (perda de peso, aumento do turgor da pele, olhos afundados). O cetoprofeno pode ser administrado por via subcutânea uma vez ao dia por mais 2 dias após a cirurgia (siga o regime de analgesia de acordo com as diretrizes locais da IACUC). Permitir que os animais se recuperem totalmente em suas gaiolas por 4-7 dias antes de serem transferidos para o sistema de registro de EEG.

3. Protocolo de ignição elétrica

  1. Conecte os mouses ao sistema de gravação de EEG usando um cabo flexível que se encaixa nos soquetes na cabeça do mouse e no comutador (consulte a lista Tabela de Materiais ). Deixe os animais se aclimatarem por um dia antes de prosseguir com o protocolo de estimulação elétrica abaixo. Monitorar sua saúde geral e aclimatação em uma base diária, e removê-los do sistema quando houver sinais de doença, angústia e/ou perda de peso corporal contínua superior a 25%
  2. Conecte ambos os eletrodos do eletrodo estimulador à saída de um estimulador de corrente constante.
    NOTA: É muito útil ter uma placa de circuito que desliga esses eletrodos do gravador de EEG e para o estimulador.
  3. Ajuste o estimulador para fornecer pulsos de 1 ms a 50 Hz para uma duração de trem de 2 s.
  4. Ajuste a saída do estimulador em 20 microamperes (μA) e entregue o1º pulso.
  5. Monitorar o EEG para uma pós-descarga característica de picos de alta frequência que duram mais do que o pulso de estimulação elétrica.
  6. Se nenhuma descarga for observada, aumente a quantidade de corrente injetada em incrementos de 20 μA até que uma pós-descarga seja desencadeada. A quantidade de corrente necessária é o Limiar Pós-Descarga (ADT).
  7. Os ADTs típicos são 20-50 μA. Se nenhuma descarga for observada mesmo depois de aumentar para 200 μA, é necessário solucionar problemas de conexões elétricas e fiação de fone de ouvido com um ohmímetro de alta sensibilidade. Se o problema estiver no eletrodo estimulador, tente estimular com os outros eletrodos de profundidade.
  8. Os animais são estimulados estimulando 2x ou 6x por dia usando uma corrente que é 1,5x o valor de ADT para esse rato.
  9. Monitorar a resposta comportamental à estimulação, que se eleva da mudança de estado para crises tônico-clônicas bilaterais com queda. Escore usando um sistema de classe Racine modificado11. Para evitar crises tônicas fatais evocadas, o kindling deve ser pausado se estímulos sucessivos levarem à gravidade e duração crescentes das crises até o escore de Racine modificado 6 (corrida e salto)

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Resultados

Animais
O modelo foi originalmente desenvolvido usando camundongos VGAT-Cre (Slc32a1tm2(cre)Lowl/J)13 em fundo misto. No entanto, também tem sido aplicado à cepa VGAT-Cre que é congênica com C57BL/6J. Nenhuma diferença foi observada na epilepsia que se desenvolve entre as cepas. Ambas as cepas expressam Cre recombinase sob o controle do promotor do transportador vesicular GABA. Esses camundongos foram gerados por batida em um IRES-Cre após o códon stop no gene Vg...

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Discussão

Este relato descreve um protocolo em que o acender elétrico de camundongos leva à epilepsia. Uma vez que o eletrodo estimulador é colocado no hipocampo, esta é uma epilepsia límbica focal que modela a epilepsia do lobo temporal (ELT) em pacientes. Um passo crítico neste protocolo é a utilização de camundongos VGAT-Cre, que devido à inserção de um de recombinase IRES-Cre no gene Vgat , apresenta comprometimento das correntes inibitórias doGABA11. C57BL/6 não desenvolvem epilepsia após o ki...

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Divulgações

Os autores não têm conflitos a revelar.

Agradecimentos

Os autores agradecem a John Williamson pelas discussões úteis sobre este protocolo. Este trabalho foi apoiado pelo NIH/NINDS grant NS112549.

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Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo
NomeEmpresaNúmero de catálogoComentários
Amplificador AC Diferencial Extracelular de 16 Canais (115V/60Hz)AD InstrumentsAM3500-115-60Amplificador EEG Alternativo
363/CP PLUG COLLAR, PINS SLEEVEP1 Technologies363SLEEVPIN0NLPara suporte de eletrodo
Cabo, 363-363 5CM - 100CM W/MESH Cabomouse para comutadorP1 Technologies363363XXXXCM004
Câmeras CCTV Qcwox HD Sony IR LEDComutador SonyQC-SP316
SL6C/SB (escova única)P1 Technologies8BSL6CSBC0MTanteriormente Plastics One, Inc.
Amplificadorde corrente A-M SystemsModelo 2100
Cement DentalStoelting51459
Brocas, #75, OD  0.310" LOC 130 PTKyocera105-0210.310
E363/0 CONTATO DE SOQUETE INCLINADOP1 Technologies8IE3630XXXXEpinos para conector
Cola auto condicionante iBondKulzerCE0197
MS363 PEDESTAL 2298 6 PIN WHITEP1 Technologies8K000229801FConector de fone de ouvido EEG
OhmeterSimpson260PowerLab
16/35 de alta sensibilidade e LabChart ProAD InstrumentsPL3516 / PSoftware de EEG alternativo
SomnoSuiteKent Scientific Corp.Unidade de anestesia SS-01e Monitoramento RightTemp
Broca estereotáxica e kit de micromotorForedom Electric Co.K.1070
Quadro estereotáxicoDavid Kopf InstrumentsModelo 940
Fio revestido de teflon para eletrodo de profundidade, OD 0.008'A-MSystems791400
Camundongos VGAT-Cre em fundo congênito C57BL / 6JO Laboratório Jackson000664
de 6TCM

Referências

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