Transição de fase optogenética do TDP-43 em neurônios motores espinhais de larvas de zebrafish

Kazuhide Asakawa; Hiroshi Handa; Koichi Kawakami

doi:10.3791/62932

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Artigo de método

Transição de fase optogenética do TDP-43 em neurônios motores espinhais de larvas de zebrafish

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DOI:

10.3791/62932

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25 de fevereiro de 2022

Kazuhide Asakawa¹ , Hiroshi Handa¹ , Koichi Kawakami²^,³

¹Department of Chemical Biology, Tokyo Medical University, ²Division of Molecular and Developmental Biology, National Institute of Genetics, ³Department of Genetics, Graduate University for Advanced Studies (SOKENDAI)

Neste artigo

Resumo

Descrevemos um protocolo para induzir a transição de fase da proteína de ligação de DNA TAR 43 (TDP-43) por luz nos neurônios motores espinhais usando zebrafish como modelo.

Resumo

A agregação anormal de proteínas e a vulnerabilidade neuronal seletiva são duas marcas principais de doenças neurodegenerativas. As relações causais entre essas características podem ser interrogadas controlando a transição de fase de uma proteína associada à doença em um tipo celular vulnerável, embora essa abordagem experimental tenha sido limitada até agora. Aqui, descrevemos um protocolo para induzir a transição de fase da proteína de ligação de RNA/DNA TDP-43 em neurônios motores espinhais de larvas de zebrafish para modelagem da agregação citoplasmática de TDP-43 ocorrendo em neurônios motores degenerados na esclerose lateral amiotrófica (ELA). Descrevemos um método genético baseado em cromossomo artificial bacteriano (BAC) para fornecer uma variante optogenética TDP-43 seletivamente aos neurônios motores espinhais de zebrafish. A alta translucência das larvas de zebrafish permite a transição de fase do TDP-43 optogenético nos neurônios motores espinhais por uma simples iluminação externa usando um diodo emissor de luz (LED) contra peixes desenfreados. Também apresentamos um fluxo básico de imagens ao vivo dos neurônios motores espinhais do zebrafish e análise de imagem com software Fiji/ImageJ livremente disponível para caracterizar respostas do TDP-43 optogenético à iluminação da luz. Este protocolo permite a caracterização da transição de fase TDP-43 e formação agregada em um ambiente celular vulnerável à ALS, o que deve facilitar a investigação de suas consequências celulares e comportamentais.

Introdução

Os grânulos de ribonucleoproteína (RNP) controlam uma miríade de atividades celulares no núcleo e citoplasma, montando partições sem membrana através da separação de fase líquido-líquido (LLPS), fenômeno no qual um fluido homogêneo se mistura em duas fases líquidas ^distintas1,2. Os LLPS desregulados de proteínas de ligação de RNA que normalmente funcionam como componentes de grânulo RNP promovem a transição de fase anormal, levando à agregação de proteínas. Esse processo foi implicado em doenças neurodesenvolvimentantes e neurodegenerativas3,4,5.^<....