Summary
מאמר זה מתאר אנקפסולציה של תאי גזע פלוריפוטנטיים אנושיים (hPSCs) באמצעות התקן מיקוד זרימה צירית משותפת. אנו מראים שטכנולוגיית אנקפסולציה מיקרופלואידית זו מאפשרת היווצרות יעילה של כדוריות hPSC.
Abstract
תרביות תלת-ממדיות (תלת-ממדיות) או ספרואידיות של תאי גזע פלוריפוטנטיים אנושיים (hPSCs) מציעות את היתרונות של תוצאות דיפרנציאציה משופרות ומדרגיות. במאמר זה, אנו מתארים אסטרטגיה להיווצרות חזקה וניתנת לשחזור של כדוריות hPSC שבהן נעשה שימוש בהתקן מיקוד זרימה צירית משותפת כדי ללכוד hPSCs בתוך מיקרו-קפסולות של מעטפת ליבה. תמיסת הליבה הכילה תרחיף של תאים בודדים של hPSCs ונעשתה צמיגת על ידי שילוב של פולי(אתילן גליקול) בעל משקל מולקולרי גבוה (PEG) ומדיה הדרגתית של צפיפות. זרם הפגזים כלל PEG-4 זרוע-מלימיד או PEG-4-Mal וזרם לצד זרם הליבה לעבר שני צמתי שמן רצופים. היווצרות טיפות התרחשה בצומת השמן הראשון כאשר תמיסת המעטפת עוטפת את עצמה סביב הליבה. הצלבה כימית של הקונכייה התרחשה בצומת השמן השני על ידי החדרת צלב די-תיול (1,4-dithiothreitol או DTT) לטיפות אלה. ההצלבה מגיבה עם קבוצות פונקציונליות של מאלימיד באמצעות כימיה של קליקים, וכתוצאה מכך נוצרת מעטפת הידרוג'ל סביב המיקרו-קפסולות. טכנולוגיית האנקפסולציה שלנו ייצרה כמוסות בקוטר 400 מיקרומטר בקצב של 10 כמוסות בשנייה. הכמוסות שהתקבלו היו בעלות קליפת הידרוג'ל ולייבה מימית שאפשרה לתאים בודדים להתקבץ במהירות לאגרגטים וליצור ספרואידים. תהליך האנקפסולציה לא השפיע לרעה על הכדאיות של hPSCs, כאשר הכדאיות >95% נצפתה 3 ימים לאחר האנקפסולציה. לשם השוואה, hPSCs עטופים במיקרו-חלקיקי ג'ל מוצקים (ללא ליבה מימית) לא יצרו כדוריות והיו בעלי כדאיות <50% 3 ימים לאחר האנקפסולציה. היווצרות כדורית של hPSCs בתוך מיקרו-קפסולות של קליפת ליבה התרחשה תוך 48 שעות לאחר האנקפסולציה, כאשר קוטר הספרואידים הוא פונקציה של צפיפות חיסון התא. באופן כללי, טכנולוגיית האנקפסולציה המיקרופלואידית המתוארת בפרוטוקול זה התאימה היטב לאנקפסולציה של hPSCs ולהיווצרות ספרואידים.
Introduction
יש עניין רב בתרביות תלת-ממדיות של תאי גזע פלוריפוטנטיים אנושיים (hPSCs) בשל הפלוריפוטנטיות המשופרת ופוטנציאל ההתמיינות שמעניקה תבנית תרבית זו 1,2,3. hPSCs נוצרים בדרך כלל לספרואידים או לפורמטים אחרים של תרבית תלת-ממדית באמצעות ביו-ריאקטורים, מיקרו-וולים, הידרוג'לים ופיגומים פולימריים 4,5,6. אנקפסולציה מציעה אמצעי נוסף לארגון hPSCs בודדים לספרואידים. לאחר עטיפת כדורי hPSC ניתן לטפל בקלות ולהעבירם ללוחות מיקרוטיטר לצורך התמיינות, מידול מחלות או ניסויים בבדיקת תרופות. עטיפת hPSCs בשכבת הידרוג'ל גם מגנה על התאים מפני נזקי גזירה ומאפשרת תרבית ספרואידים בביוריאקטור בקצבים גבוהים של ערבוב7.
המתודולוגיה שלנו לאנקפסולציה של תאי גזע התפתחה עם הזמן. ראשית, התמקדנו במיקרו-חלקיקי הידרוג'ל מוצקים והדגמנו אנקפסולציה וטיפוח מוצלחים של תאי גזע עובריים של עכברים (mESCs)8. עם זאת, צוין כי לתאי גזע עובריים אנושיים (hESCs) הייתה יכולת קיום נמוכה כאשר הם עטופים במיקרו-חלקיקי הידרוג'ל כאלה, ככל הנראה בשל הצורך הגדול יותר של תאים אלה ליצור מחדש את המגעים בין התא לתאים לאחר האנקפסולציה. סברנו כי מיקרו-קפסולות הטרוגניות, בעלות ליבה מימית, עשויות להתאים יותר לתמצות של תאים המסתמכים על התבססות מחדש מהירה של מגעים בין תאים לתאים. הרעיון של מכשיר מיקרופלואידי ממוקד זרימה צירית משותפת ליצירת מיקרו-קפסולות של מעטפת ליבה/הידרוג'ל מימית הותאם מ-He et al.9, אך במקום אלגינט שהופעל בגישה המקורית, הידרוג'ל מבוסס PEG שולב במעטפת. הדגמנו לראשונה אנקפסולציה מוצלחת והיווצרות כדורית של הפטוציטים ראשוניים במיקרו-קפסולות של קליפת ליבה10 ולאחרונה תיארנו אנקפסולציה של תאי hES ו-iPS7. כפי שמתואר באיור 1A, הקפסולות מיוצרות בהתקן למיקוד זרימה שבו זרמי הזרימה של המעטפת והליבה עוברים מצד לצד לזרימה קו-צירית לפני שהם נפלטים לתוך שלב השמן. זרימת הליבה מכילה תאים ותוספים המגבירים את צמיגות התמיסה (PEG MW 35kD שאינו תגובתי ויודיקסנול - שם מסחרי OptiPrep) בעוד שזרם הקליפה מכיל מולקולות תגובתיות (PEG-4-Mal). זרם זרימה קו-צירית רציפה מחולק בנפרד לטיפות השומרות על ארכיטקטורת מעטפת הליבה. מבנה הליבה-מעטפת הופך לקבוע על ידי חשיפה ל-di-thiol crosslinker (DTT), המגיב עם PEG-4-Mal באמצעות כימיה של קליקים ומביא להיווצרות של עור או מעטפת הידרוג'ל דקים (כ-10 מיקרומטר). לאחר שהאמולסיה נשברת והקפסולות מועברות לשלב מימי, מולקולות של PEG מתפזרות מהליבה ומוחלפות במולקולות מים. התוצאה היא מיקרו-קפסולות של ליבה מימית ומעטפת הידרוג'ל.
להלן הוראות שלב אחר שלב כיצד ליצור התקנים מיקרופלואידיים, כיצד להכין תאים וכיצד לבצע אנקפסולציה של hPSCs.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. ייצור מכשירים
- בצע את העיצובים עבור התקן המיקרו-אנקפסולציה והתקן הדיסוציאציה באמצעות תוכנת CAD10,11.
- ספין-ציפו את שלוש השכבות של הפוטורסיסט SU-8 ברצף על פרוסת סיליקון (איור 2A) כדי להשיג מבנים בגבהים הרצויים: 60, 100 ו-150 מיקרומטר.
הערה: התהליך עבור התבניות העליונות והתחתונות זהה.- ספין ציפו פרוסת סיליקון נקייה בקוטר 10 ס"מ עם פוטוריסט שלילי SU-8 2025 ב-1,100 סל"ד כדי ליצור את שכבת ה-60 מיקרומטר הראשונה. לאחר אפייה רכה ב-65 מעלות צלזיוס למשך 3 דקות ו-95 מעלות צלזיוס למשך 10 דקות על צלחת חמה, חשפו את התבנית באמצעות קשת ללא מסיכה על ידי העלאת קובץ העיצוב של תבנית ערוץ הליבה למחשב μPG 101. לאחר מכן, המשיכו עם האפייה לאחר החשיפה בטמפרטורה של 65 מעלות צלזיוס למשך 3 דקות ובטמפרטורה של 95 מעלות צלזיוס למשך 10 דקות.
- סובב את השכבה השנייה של SU-8 2025 (40 מיקרומטר) ב-1,500 סל"ד וחשוף על-ידי העלאת קובץ ה-CAD המתאים לתבנית ערוץ המעטפת.
הערה: אפיות רכות ולאחר חשיפה היו דומות לשלב הקודם. - ספין מצפה את השכבה השלישית של SU-8 2025 ב-1,400 סל"ד כדי להגיע לגובה של 50 מיקרומטר ולחזור על התהליך הנ"ל אך לחשוף את המבנים של שלב השמן.
- פתח את התבנית עם כל שלוש השכבות בצעד אחד על ידי טבילה במפתח SU-8 עד שכל הפוטורסיסט שלא נחשף יוסר.
- קשה לאפות את התבנית על צלחת חמה ב 160 °C (66 °F) במשך 10 דקות כדי לשפר את ההדבקה ולאטום סדקים קלים שיכולים להופיע לאחר הפיתוח.
- יש לחשוף את העובש לכלורוטרימתילסילן כדי למנוע הדבקת אלסטומר בשלב הבא ולהניח אותה בכלי פטרי בקוטר 15 ס"מ עד לשימוש.
- הכינו את תבנית התקן הדיסוציאציה באותו אופן, כפי שמתואר באיור 1D ובאיור 2B. ספין מצפה שכבה אחת של פוטוריסט SU-8 על פרוסת סיליקון, כפי שתואר קודם לכן בשלב 1.2.3, כדי להשיג מבנים עם הגובה הרצוי: 50 מיקרומטר. נהלו את האפייה הרכה שלאחר החשיפה, ההתפתחות והאפייה הקשה בדומה לשלב הקודם.
הערה: מערך של עמודים בצורת משולש כיסה את כל התא, כאשר המרווח בין העמודים הלך ופחת ככל שרוחב התא ירד לכיוון השקע. עמודי המשולש היו 200 מיקרומטרים לכל צד עם גובה שנע בין 400 מיקרומטר (בכניסה) ל-30 מיקרומטר (בשקע). - הכן את התבניות על ידי ליתוגרפיה רכה באמצעות פולידימתילסילוקסן (PDMS).
- ערבבו את בסיס האלסטומר PDMS ואת חומר הריפוי האלסטומר ביחס של 10:1 w/w בצנטריפוגה פלנטרית. יוצקים את התערובת הן על תבניות מאסטר של מיקרו-אנקפסולציה והן על תבנית ראשית של דיסוציאציה כדי ליצור שכבה של 3-4 מ"מ.
הערה: מספיקה תערובת של 50 גרם של בסיס אלסטומר עם 5 גרם של חומר ריפוי כדי לכסות תבנית ראשית בעובי 3 מ"מ. - הניחו את צלחות הפטרי המכילות את התבניות במפענח ואקום למשך 15 דקות כדי לנטרל את הגז של ה-PDMS הלא מרוסן.
- העבירו את כלי הפטרי לתנור ואופים בטמפרטורה של 80 מעלות צלזיוס למשך 60 דקות לפחות.
- מוציאים את תבניות המאסטר מהתנור ומאפשרים להן להתקרר. באמצעות סכין מדויקת, חתכו בזהירות את ה-PDMS בהתאם לצורת הוופל וקילפו את חלקי ה-PDMS מהתבנית הראשית.
- חותכים את לוחות ה-PDMS על ידי חיתוך הקצוות של כל מכשיר עם אזמל, ואז מנקבים יציאות נוזלות כניסה/שקע בהתקן הדיסוציאציה ורק בהתקן המיקרופלואידי העליון באמצעות מחטי נירוסטה. מכסים את המכשירים בקלטת קסם כדי למנוע זיהום.
הערה: מד המחט הוא 14 G ו- 15 G עבור יציאות כניסה ויציאה, בהתאמה. - לצורך ההדבקה, טפלו בצדדים המעוצבים של חלקי ה-PDMS העליונים והתחתונים עם פלזמהO 2 על תחריט פלזמה למשך 2 דקות.
- יישרו את שני חלקי ה-PDMS מתחת לסטריאוסקופ לאחר הוספת שכבה מפרידה דקה של מים מזוקקים ישירות במיקרו-ערוצים (2 μL).
- הניחו את מכשיר ה-PDMS המיושר בתנור בטמפרטורה של 80 מעלות צלזיוס למשך הלילה כדי להשלים את ההידבקות ולהחזיר את ה-PDMS למצבו ההידרופובי המקורי. אחסן את המכשירים עד לשימוש נוסף.
הערה: התוצאה היא התקן ממוקד זרימה קואקסיאלי עם שלושה גבהים שונים של 120 מיקרומטר לליבה, 200 מיקרומטר עבור מעטפת ו- 300 מיקרומטר עבור תעלות שמן. - על מנת להשתמש במכשיר מיד לאחר הדבקת הפלזמה, להזריק בזהירות אך בתקיפות 30 μL של תמיסת ציפוי הידרופובית לתעלות הנוזליות כדי להשיג ציפוי הידרופובי. לאחר מכן, מיד לטהר את האוויר לתוך התעלות עד שלא שאריות של תמיסת הציפוי ההידרופובית נצפו במכשיר.
- קשרו את מכשיר הדיסוציאציה על ידי טיפול תחילה בצד המעוצב של המכשיר ובזכוכית החלקה מנוקה עם פלזמת O2 למשך 2 דקות, ולאחר מכן הרכיבו אותם לריפוי נוסף בתנור בטמפרטורה של 80 מעלות צלזיוס למשך הלילה.
הערה: ניתן לאחסן התקנים עד לשימוש נוסף.
- ערבבו את בסיס האלסטומר PDMS ואת חומר הריפוי האלסטומר ביחס של 10:1 w/w בצנטריפוגה פלנטרית. יוצקים את התערובת הן על תבניות מאסטר של מיקרו-אנקפסולציה והן על תבנית ראשית של דיסוציאציה כדי ליצור שכבה של 3-4 מ"מ.
2. הכנת פתרונות
- פתרונות מלאי. ראשית, הכינו פתרונות מלאי (פתרונות מרוכזים) שידוללו לריכוזים נמוכים יותר לשימוש בפועל.
הערה: פתרונות מלאי משמשים כדי לחסוך זמן הכנה, לחסוך בחומרים, לצמצם את שטח האחסון ולשפר את הדיוק בעת הכנת פתרון עובד בריכוזים נמוכים יותר.- הכן 30 מ"ל של תמיסת ליבה של 2x (16% PEG ו- 34% מדיית גרדיאנט צפיפות): ערבב 4.8 גרם של 35 kDa PEG, 10.2 מ"ל של מדיית שיפוע צפיפות ו- 19.8 מ"ל של מדיית DMEM/F12. סנן פתרון ליבה זה באמצעות מסנן מזרקים של 0.22 מיקרומטר.
- הכינו 50 מ"ל של שמן מינרלי עם 3% חומרים פעילי שטח: ערבבו 48.5 מ"ל של שמן מינרלי ו-1.5 מ"ל של חומרים פעילי שטח. שמור במצב סטרילי לאחר סינון דרך מסנן מזרק 0.22 מיקרומטר.
- הכן 50 מ"ל של שמן מינרלי עם 0.5% פעילי שטח: לערבב 49.75 מ"ל של שמן מינרלי ו 0.25 מ"ל של פעילי שטח. שמור במצב סטרילי.
- הכן 1 M Dithiotheritol (DTT): להמיס 1.5425 גרם של DTT במים מזוקקים 10 מ"ל. שמור במצב סטרילי.
- מכינים 1 M טריאתנולמין (TEA): מוסיפים 66.4 μL של TEA ב-433.6 μL של מים מזוקקים. שמור במצב סטרילי.
- הכן 1% Pluronic F127 (PF127): להמיס 100 מ"ג של PF127 ב 10 מ"ל של מים מזוקקים. שמור במצב סטרילי.
- פתרונות עבודה
- הכינו תחליב קרוסלינקר על ידי ערבוב של 4.5 מ"ל של שמן מינרלי עם 3% פעילי שטח ו-300 μL של 1 M DTT (יחס של 1:15). וורטקס את הפתרון במשך 2 דקות ו sonicate במשך 45-60 דקות באמבטיה קולית ב 20 °C (86 °F). טען פתרון זה למזרק 5 מ"ל עם מחט 27 גרם.
הערה: תחליב נוצר על ידי תערובת שמן/מים. - הכן תמיסת שמן מיגון על ידי העמסת השמן המינרלי בחומר פעילי שטח של 0.5% למזרק 5 מ"ל עם מחט 27 גרם.
- הכן תמיסת מעטפת (8% w/v PEG-4-Mal ו-15 mM TEA) על ידי הוספת 32 מ"ג של PEG-4-Mal ב-400 μL של 1x DPBS כדי ליצור תמיסה של 8% w/v, ומערבולת את התמיסה למשך 2 דקות. לאחר מכן, הוסף 6 μL של 1 M TEA (ריכוז סופי 15 mM TEA). לבסוף, צנטריפוגה ב 13,000 x g במשך 5 דקות באמצעות מסנן ספין ולשמור אותו בחושך על הנדנדה במשך 30 דקות. לאחר מכן, טען פתרון זה למזרק 1 מ"ל עם מחט 27 G.
הערה: השאירו את מיכל PEG-4-Mal לשבת בטמפרטורת החדר במשך 10 דקות לפני פתיחת המכסה, ופוצצו גז N2 כדי להחליף את ה-O2 ב-N2 לפני סגירת המכסה. וורטקס TEA לפני הוספת הפתרון.
- הכינו תחליב קרוסלינקר על ידי ערבוב של 4.5 מ"ל של שמן מינרלי עם 3% פעילי שטח ו-300 μL של 1 M DTT (יחס של 1:15). וורטקס את הפתרון במשך 2 דקות ו sonicate במשך 45-60 דקות באמבטיה קולית ב 20 °C (86 °F). טען פתרון זה למזרק 5 מ"ל עם מחט 27 גרם.
- הכן את מתלה התא בתמיסת הליבה
- טפלו ב-hPSCs עם טריפסין למשך 5 עד 10 דקות ב-37 מעלות צלזיוס. לאחר מכן, לאסוף אותם מצלחות. מרווים את הטריפסין עם המדיום לאחר ניתוק התא, ולאחר מכן מעבירים את התאים לצינור חרוטי של 15 מ"ל.
- צנטריפוגה את תרחיף התא בתפזורת (400 x g, 5 דקות). בזהירות לשאוף את supernatant ולאחר מכן resuspened את גלולת התא באמצעות נפח מינימלי של מדיום גדילה. ספרו את התאים באמצעות מונה תאים אוטומטי.
הערה: אליקוטים טיפוסיים של תאים מכילים תאים בגודל 12-20 x 106 ומספיקים כדי ליצור 400 μL של תמיסת הליבה. - קח 12-20 x 106 תאים מתרחיף התא בתפזורת והצנטריפוגה של תרחיף התא / המדיה (400 x גרם, 5 דקות).
- שאפו בזהירות מדיה מכדור התא. לאחר מכן, הוסיפו 200 μL מדיה ו-200 μL של תמיסת PEG 2x (ריכוז סופי 30-50 x 106 תאים/מ"ל) וערבבו בעדינות.
הערה: ריכוזי תאים נמוכים (פחות מ-20 x 106 תאים/מ"ל) גרמו לכמוסות ריקות רבות. - הוסף 30 μL של 1% PF127 לפתרון.
- הכנס מוט מערבל מיקרו (2 מ"מ x 7 מ"מ) למזרק של 1 מ"ל, ולאחר מכן טען את התא המכיל תמיסת ליבה למזרק עם מחט של 27 גרם. שמור על הפתרון קר עם קרח במהלך כל תהליך האנקפסולציה.
3. מערך ניסיוני
- מניחים מכשיר טיפות PDMS מלוכד, ארבע חתיכות באורך 20 ס"מ וחתיכה אחת של מיקרו-צינורות כניסה באורך 5 ס"מ (0.38 מ"מ I.D. x 1.1 מ"מ O.D.), חתיכה אחת של צינור מוצא 10 ס"מ (0.5 מ"מ I.D. x 1.5 מ"מ O.D.), ושש חתיכות של צינורות מתאימים בקוטר 0.5 ס"מ (1 מ"מ I.D. x 1.8 מ"מ O.D.) מתחת למקור אור חיידקי (בדרך כלל מובנה בארונות בטיחות ביולוגיים) ומעקרים עבור 30 דקות.
- השתמש במלקחיים כדי להתאים את הצינורות ליציאות הכניסה הנוזליות וליציאות הדיסוציאציה.
- השתמש בשלושת החלקים של מיקרו-צינוריות כניסה באורך 20 ס"מ עבור הקונכייה, שמן, פתחי תחליב קרוסלינקר וחתיכה אחת לכניסת התקן הדיסוציאציה. לאחר מכן, הכנס את הקצה הנגדי של הצינורות למחט של המזרק עם הפתרון המתאים. בינתיים, חברו את כניסת הליבה של המכשיר המיקרופלואידי ואת היציאה של התקן הדיסוציאציה באמצעות מיקרו-צינורית אחת בקוטר 5 ס"מ (איור 1C).
הערה: יש לאבטח היטב את המיקרו-צינורות הכניסה בתוך צינורות ההתאמה, שהוכנסו בשלב האחרון. - הכנס צינור מוצא אחד לתוך יציאת היציאה הנוזלית והכניס את הקצה הנגדי למאגר איסוף.
- מניחים את המכשיר על במת מיקרוסקופ ומחברים את הצינורות כדי להימנע מתנועה. יישמו את המיקרוסקופ ומקדו את המיקרוסקופ על זרבובית המכשיר לצורך בדיקת זרימה.
- הניחו כל מזרק על משאבות מזרק שונות והבטיחו כראוי (איור 1B). תכנת כל משאבה על פי פרוטוקולי היצרן לקצבי הזרימה הבאים: ליבה (3-5 μL/min), מעטפת (3-5 μL/min), שמן מיגון (20-80 μL/min) ושמן crosslinking (40-60 μL/min). התחל את הזרימה בכל המשאבות.
- המתן עד שכל נוזל ייכנס למכשיר ומלא את הערוצים תוך כדי דחיפת האוויר הנותר.
הערה: אם יש כמות גדולה של אוויר בצינורות הכניסה, הגדל באופן זמני כל קצב זרימה עד להסרת האוויר לחלוטין. שים לב שקצב זרימה מופרז עלול להוביל לכשל באג"ח PDMS ל- PDMS. - כאשר מייצבים את היווצרות הקפסולה (איור 3), הניחו את הקצה הנגדי של צינור האיסוף לצינור חרוטי חדש עם 5 מ"ל של מדיית mTeSR.
הערה: המדיה מכילה מעכב 10 μM ROCK, 100 פניצילין U/mL ו-100 מיקרוגרם/מ"ל סטרפטומיצין. - לאחר מספר מספיק של כמוסות נאספים, דגירה ב 37 °C (84 °F) עם 5% CO2 במשך 10 דקות. כמוסות הנמצאות בשלב השמן יהיו בחלק העליון של הצינור (ראו איור 4A). הקשה עדינה על הצינור גורמת לכמוסות משקעים לתחתית. לאחר מכן, רוב הנפט והתקשורת עשויים להיות שאפתניים.
- אספו את הכמוסות מתחתית הצינור החרוטי, הניחו אותן על מסננת תאים (בגודל נקבובית של 100 מיקרומטר) ושטפו בכמויות אדירות של מדיה. לאחר מכן, אספו מיקרו-קפסולות באמצעות מדיה של 2 מ"ל בצלחת תרבית של 6 בארות על-ידי העברת המדיה דרך המסנן כשהיא הפוכה על גבי לוח הבאר (ראו איור 4A).
4. תרבית וניתוח hPSC במיקרו-קפסולות
- תרבות בסיסית
- הדגירו את כמוסות תאי הגזע בצלחת תרבית של 6 בארות בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס עם 5% CO2.
- שנה את המדיה כל יומיים על ידי איסוף הכמוסות על מסנן מסננת תאים, שטיפתן במדיה עודפת, והחזרתן לבאר חדשה בצלחות 6 בארות עם מדיה של 2 מ"ל כפי שנעשה בשלב 3.10.
- תרבית את הכמוסות במשך 10 ימים לפחות.
- בצע את הבדיקה החיה/מתה כדי לקבוע את הכדאיות של תאי גזע עטופים.
- להפשיר פתרונות בדיקה חיים/מתים (אתידיום הומודימר-1 וקלצין AM).
- הוסף 4 μL של 2 μM ethidium homodimer-1 ו 1 μL של 4 μM calcein AM פתרונות 2 mL של DPBS סטרילי. מערבולת כדי להבטיח ערבוב מלא.
- אספו כ-100 מיקרו-קפסולות על מסננת תאים ושטפו אותן ב-DPBS סטרילי כדי לאפשר דיפוזיה של מדיום החוצה מהכמוסות.
- אסוף אותם שוב לצלחת תרבית של 12 בארות באמצעות 1 מ"ל של הפתרון שהוכן בשלב 4.2.2. דגירה בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס למשך 20 דקות.
- דמיינו את התאים תחת מיקרוסקופ פלואורסצנטי.
הערה: יכולת הכדאיות של התאים ניתנת לכימות על-ידי חישוב אחוז התאים החיים, המוצגים כירוקים, בין המספר הכולל של התאים.
- אפיון גודל ספרואידי.
- בעת הצורך, הניחו את לוחית הבאר עם מיקרו-קפסולות מתחת למיקרוסקופ ומדדו את קוטר הספרואידים המוצגים בתוכנה הקשורה עם פסי קנה מידה מתאימים.
- למדוד ולנתח את גודל הספרואיד.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
על ידי ביצוע הפרוטוקול הנ"ל, הקורא יוכל לייצר התקנים מיקרופלואידיים ולייצר מיקרו-קפסולות נושאות תאים. איור 3A מציג דוגמאות למיקרו-קפסולות אופטימליות ולא אופטימליות שיוצרו באמצעות יצירת טיפות מיקרופלואידיות. פורמולציות שונות של PEG-4-Mal הביאו לכמוסות בעלות מורפולוגיות שונות - כמוסות מקומטות היו קשורות לג'לציה לקויה, לשלמות מכנית נמוכה, ולא עמדו בטיפוח בביוריאקטור מעורבב. כמוסות חלקות שנצפו בתכולת PEG של >6% ייצגו את המורפולוגיה הרצויה של הקפסולה והיו חזקות מספיק לגידול תאים. מבנה הליבה-מעטפת אושר על ידי שילוב של מיקרובים בליבה ומואיטיות פלואורסצנטיות לתוך הקליפה של מיקרו-קפסולות. צבירה של חרוזים במרכז הכמוסות כפי שניתן לראות באיור 3B שימשה אינדיקציה לכך שהליבה הייתה מימית, והחרוזים היו חופשיים לנוע. אנולוס פלואורסצנטי שנצפה באיור 3C הצביע על נוכחות של מעטפת הידרוג'ל ושימש לקביעת עובי הקליפה. אנו ממליצים למשתמשים להשתמש בשילוב מיקרובים ותיוג פלואורסצנטי בשלבים המוקדמים של ביסוס תהליך האנקפסולציה.
לאחר היווצרות תהליך האנקפסולציה, ניתן לעבור לאנקפסולציה של hPSCs. בעוד שפרוטוקול זה מתאר אנקפסולציה של תאי H9, השתמשנו באסטרטגיה דומה לתמצות קו hESC אחר (HUES-8) וקו iPSC (1016). 7
בעוד שאנקפסולציה עשויה להתבצע באמצעות התקן האנקפסולציה בלבד, ציינו כי hPSCs נטו להתגבש במערכת וכתוצאה מכך אנקפסולציה לא אחידה או תפוסת כמוסה. כדי להתמודד עם אתגר זה, תכננו התקן דיסוציאציה או סינון ומיקמנו אותו במעלה הזרם של מכשיר האנקפסולציה. התקן דיסוציאציה זה כלל ערוץ זרימה עם מערך של עמודים בצורת משולש שנמדדו 200 מיקרומטר לכל צד ועם גובה שנע בין 400 מיקרומטר בכניסה ל-30 מיקרומטר בשקע, כך שהגושים נשמרים או מתפרקים לפני הכניסה להתקן האנקפסולציה (ראו איור 1D)7. השימוש במכשיר הדיסוציאציה מאפשר לשפר באופן משמעותי את האחידות של הספרואידים ולהגדיל את תפוסת התאים של הקפסולות מ-57% ל->90%7.
איור 4B,C מתאר תוצאות מייצגות מריצת אנקפסולציה. כפי שניתן לראות מתמונות אלה, לתאי H9 יש כדאיות גבוהה עם >95% כדאיות המושגת באופן שגרתי במהלך ריצות האנקפסולציה. השווינו את קצב הגדילה (ראו איור 4B,C) ואת פוטנציאל ההבחנה של כדוריות עטוף לעומת כדוריות לא מכוסות7, וקבענו שלתהליך האנקפסולציה אין השפעות שליליות על hPSCs. מצד שני, ישנם מספר יתרונות לעטוף hPSCs. קל לטפל בספרואידים עטופים, וניתן לחלקם/לחלקם/לפזר אותם ללוחות מיקרוטיטר לצורך פיתוח פרוטוקולי דיפרנציאציה או בדיקת טיפולים. המעבדה שלנו מעוניינת להשתמש במיקרו-קפסולות כנשאיות תאי גזע לגידול תרחיף בביוריאקטורים מעורבבים והוכיחה כי מעטפת הידרוג'ל מציעה הגנה מפני נזקי גזירה בתרביות כאלה7. זוהי דרך נוספת הננקטת על ידינו ביצירת מיקרו-קפסולות ביו-אקטיביות שבהן מעטפת הידרוג'ל עשויה להיות עמוסה בגורמי גדילה להעברה מקומית ורציפה של רמזים אינדוקטיביים במהלך התמיינות.
איור 1: ייצור של מיקרו-קפסולות של מעטפת ליבה (A) המכשיר המיקרופלואידי לייצור כמוסות מורכב מארבע תעלות כניסה (ליבה, מעטפת, שמן ושמן קרוסלינקר) ותעלת סרפנטין שמובילה לצינור איסוף. המכשיר מיוצר כך שתעלות הליבה, המעטפת והשמן הן בגובה של 120 מיקרומטר (H1), 200 מיקרומטר (H2) ו-300 מיקרומטר (H3), בהתאמה. הכניסה מייצגת מבט חתך בזרבובית - הצומת בין נחלים מימיים לנחלי שמן. תצוגת חתך זו מוטה ב- 90° כדי להעניק לקורא תצוגה טובה יותר של ערוצי זרימה קואקסיאליים. ייצוג תלת-ממדי של תהליך ייצור המיקרו-קפסולה של מעטפת הליבה מתאר כיצד הזרימה הקואקסיאלית נוצרת במעלה הזרם של צומת מיקוד הזרימה כדי לייצר מבנה מיקרו-מעטפת ליבה. תחליב מושג על ידי חשיפת טיפות מימיות לשני זרמי שמן, שהראשון שבהם נועד לייצב את הטיפות, והשני לספק את ה- crosslinker DTT, המגיב עם PEG-4-Mal. נתון זה שונה מהפניה12. זכויות יוצרים 2019, האגודה האמריקאית לכימיה. (B) התקנה ניסיונית של מערכת האנקפסולציה המציגה מיקומים של משאבות מזרקים, צינורות, התקנים מיקרופלואידיים וצינור איסוף כמוסות. (C) תמונה של מערכת האנקפסולציה, המורכבת ממכשירי דיסוציאציה ואנקפסולציה ברצף. (D) תכנון התקן הדיסוציאציה המיקרופלואידית המשמש למניעת אגרגטים של תאים גדולים הנכנסים להתקן מיקרו-אנקפסולציה. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה.
איור 2: ייצור של התקנים מיקרופלואידיים המשמשים לאנקפסולציה. (A) ייצור התקן האנקפסולציה. שלוש שכבות של פוטוריסט SU-8 היו מצופות ספין, ותבניות תמונה יוצרו תעלות ליבה, מעטפת ושמן בגבהים שונים. לתעלות הליבה רוחב של 220 מיקרומטר שמצטמצם בצומת הקפסולה ל-135 מיקרומטר. הערוצים לכל השלבים פועלים על פי אותו עיקרון: תעלות מעטפת ושמן מתחילות ברוחב של 500 מיקרומטר, מצטמצמות בצומת ל-220 מיקרומטר, ושמן סיכוך מתחיל בהצטמצמות של 500 מיקרומטר ל-270 מיקרומטר. סרפנטין מוצא בעל רוחב של 1.5 מ"מ ואורך של כ-55 מ"מ. לאחר מכן, חתיכות PDMS העליונות והתחתונות יושרו, והפלזמה נקשרה. (ב) ייצור התקן הדיסוציאציה. שכבה אחת של פוטוריסט SU-8 הייתה מצופה ספין, ותבנית תמונה יוצרת תעלות דיסוציאציה. חתיכת PDMS נקשרה אז בפלזמה עם מגלשת זכוכית. התקן דיסוציאציה מורכב מתא קטן עם גובה של 30 מיקרומטר, אורך של 16.5 מ"מ, ורוחב של 5 מ"מ בכניסה ו -1.7 מ"מ בשקע. יש לו מבנים בצורת משולש (200 מיקרומטר, שווה צלעות) המופרדים זה מזה על ידי 420 מיקרומטר של הכניסה והופכים קרובים יותר בדרך לשקע, עם הפרדה של 50 מיקרומטר בשורה האחרונה. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה.
איור 3: אפיון מיקרו-קפסולות. (A) הבדלים במורפולוגיה של הקפסולה כפונקציה של תוכן PEG-4-Mal במעטפת. כמוסות חלקות עם קצוות בהירים קשורות לשלמות המכנית הרצויה. (B) אישור ליבה מימית של המיקרו-קפסולות. מיקרובים לכודים חופשיים לנוע בליבה המימית ולהצטבר במרכז המיקרו-קפסולות. (C) אישור מבנה הליבה-קליפה על-ידי שילוב PEG עם תווית B של רודמין במעטפת של מיקרו-קפסולות. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה.
איור 4: אנקפסולציה של hPSCs. (A) מיקרו-קפסולות בשלב השמן נאספות לתוך צינור חרוטי מלא במדיה. לאחר שהמיקרו-קפסולות עשויות להתיישב בתחתית הצינור, שמן ומדיה שואפים, נשטפים מיקרו-קפסולות ולאחר מכן מועברות לצלחת של 6 בארות לטיפוח. (B) צביעה חיה/מתה 6 שעות לאחר עטיפת תאי H9. התמונה העליונה צולמה ב-10x, ובתמונה התחתונה ב-20x. (C) תמונות המשווה בין גדלים כדוריים המשתנים עם הזמן עבור תאי H9 בכמוסות ובלוחות תרבית תלת-ממדיים מסחריים (תמונות תחתונות). (D) כימות קוטר הספרואידים הגדל עבור hPSCs במיקרו-קפסולות ובלוחות תרבית תלת-ממדיים סטנדרטיים במהלך 7 ימים במדיה H9. ניתוח סטטיסטי -t-test, p < 0.05, n = 20. סרגל קנה מידה: 200 μm. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
תהליך האנקפסולציה המתואר כאן מביא להיווצרות ניתנת לשחזור של כדוריות hPSC. פורמט המיקרו-קפסולה מקל על חלוקת הספרואידים לבארות של צלחת מיקרוטיטר לניסויים שמטרתם לשפר/למטב פרוטוקולי התמיינות או לבדוק טיפולים. ניתן להשתמש בספרואידים של תאי גזע עטופים גם בתרביות תרחיפים שבהן מעטפת הידרוג'ל מגנה על התאים מפני נזק שנגרם על ידי גזירה7.
ישנם מספר שלבים קריטיים בתוך הפרוטוקול. חשוב לשמור על קצבי הזרימה של זרמי הליבה, המעטפת והנפט בטווח המתואר בסעיף הפרוטוקול. אם קצב זרימת הקליפה נמוך מדי, הזרימה הופכת לבלתי יציבה, וכתוצאה מכך נוצרות כמוסות מעוותות ובלתי יציבות מבחינה מכנית. אנקפסולציה מוצלחת של תאים אמורה להיראות דומה למיקרו-קפסולות המוצגות באיור 4C. מיקרו-קפסולות צריכות להיות בקוטר דומה ובעלות מספר דומה של תאים הלכודים בליבה. צבירה של תאים בודדים לספרואידים מתרחשת בדרך כלל תוך 48 שעות והיעדר היווצרות כדורית ב-72 שעות הוא תמרור אזהרה. ייתכן שאחת הסיבות להיעדר היווצרות כדורית היא שמולקולות צמיגות בליבה אינן זולגות החוצה במהירות מספקת דרך מעטפת ההידרוג'ל. נתקלנו בתרחיש זה בעת התאמת הצמיגות של תמיסת הליבה באמצעות פולימרים בעלי משקל מולקולרי גבוה כגון תאית קרבוקסימתיל (MW 250 kD). אפשר לתמצת מיקרובים (ראו איור 3B) כדי לבחון אם העצמים האלה בגודל של התא חופשיים לנוע סביב הליבה, ובאיזו מהירות מרכיבים של הליבה זולגים החוצה. חוסר היווצרות ספרואידים נתקל גם על ידינו בעת שימוש בריכוזי PEG-4-Mal של >8% w/v. בתרחיש זה, הנקבוביות והפיזור של מעטפת ההידרוג'ל מצטמצמות ויסודות צמיגות גבוהים בליבה אינם זולגים החוצה במהירות מספקת כדי לאפשר לתאים להיווצר לאגרגטים. ניתן להעלות על הדעת כי האיכות של PEG-4-Mal עשויה להשתנות מאצווה לאצווה או ליצרן. לכן, ייתכן שיהיה צורך בהתאמה מסוימת של ריכוז הפולימרים בקליפה. שוב, שיטת שילוב החרוזים אמורה לחשוף באיזו מהירות רכיבים צמיגים בליבה נעקרים על ידי מולקולות מים. מניסיוננו, זה אמור להתרחש תוך 3 שעות מהעברת מיקרו-קפסולות לסביבה מימית.
פרוטוקול האנקפסולציה המתואר כאן עבד היטב עבור מספר שורות hPSC7, הפטוציטים ראשוניים10, וקווי תאים סרטניים מרובים (תוצאות שלא פורסמו). עם זאת, נתקלנו בקשיים ביצירת ספרואידים לאחר אנקפסולציה של תאי גזע (sc)-הפטוציטים ותאי sc-β שמקורם בתאי גזע. פתרון בעיות עם מיקרובים עטופים גילה כי רכיבים צמיגים התרחקו במהירות מהליבה וכי התאים היו חופשיים לנוע וליצור מגעים בין תאים לתאים. פתרון בעיות נוסף כלל את ריכוז הטיטרה של די-תיול קרוסלינקר DTT (הקיים בשלב השמן) שירד מ-66 mM ל-10 mM. היווצרות ספרואידים עבור sc-hepatocytes ותאי β אכן התרחשה בריכוז נמוך זה של DTT. לכן, ייתכן שהמשתמש ירצה לשקול אופטימיזציה של ריכוז crosslinker אך רק אם שלבים אחרים לפתרון בעיות המפורטים לעיל לא הצליחו. אנו מוצאים שריכוז DTT הוא קריטי לשמירה על שלמות מכנית של מיקרו-קפסולות עם 66 mM DTT וכתוצאה מכך מיקרו-קפסולות חזקות מבחינה מכנית ואינן רעילות לרוב המכריע של סוגי התאים ששימשו עד כה.
מספר אסטרטגיות ליצירת מבני תאי גזע תלת-ממדיים תוארו בספרות. היתרונות של יצירת מבנים של תאי גזע בתוך מיקרו-מעטפת ליבה הם מרובים. לאחר העטיפה, ניתן לטפל בכדורים בקלות באמצעות כמוסות הידרוג'ל המספקות הגנה מפני נזקי גזירה. כדוריות עטופות עשויות להיות מתורבתות בתרחיף עם תסיסה נמרצת מבלי לפגוע בתאי גזע.
ישנם אפיקים מרובים להרחבת היכולות של מיקרו-קפסולות. הצוות שלנו תיאר בעבר את השימוש בהידרוג'לים המכילים הפרין לצורך אנקפסולציה של הפטוציטים ותאי גזע 8,12, וכיום הוא מפתח מיקרו-קפסולות המכילות הפרין המכילות הליבה-קליפה המשמשות כמחסנים לאחסון ולשחרור מקומי של רמזים אינדוקטיביים (GFs) לתאי גזע. מיקרו-קפסולות כאלה עשויות לסייע בהפחתת השימוש ב-GFs יקרים תוך שיפור תוצאות ההבחנה. ניתן לשפר עוד יותר את המיקרו-קפסולות על ידי שילוב חלבוני ECM בליבה ובכך לווסת את המיקרו-סביבה של תאי הגזע. מיקרו-קפסולות של מעטפת ליבה עשויות להיות מתכלות כדי להקל על אחזור כדוריות hPSC13,14. באופן כללי, מיקרו-קפסולות של מעטפת ליבה מייצגות טכנולוגיית פלטפורמה שניתן לשנות ולשפר כדי לענות על הצרכים של פרוטוקול התמיינות תאי גזע ספציפי.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
למחברים אין מה לחשוף.
Acknowledgments
מחקר זה נתמך בחלקו על ידי מענקים ממרכז מאיו קליניק לרפואה רגנרטיבית, קרן J. W. Kieckhefer, קרן אל נהיאן, רפואה רגנרטיבית מינסוטה (RMM 101617 TR 004) ו- NIH (DK107255).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.22 µm Syringe Filters | Genesee Scientific | 25-244 | |
| 1 ml syringe luer-lock tip | BD | 309628 | |
| 1x DPBS | Corning | 23220003 | |
| 4-arm PEG maleimide, 10kDa | Laysan Inc. | 164-68 | |
| 5 ml syringe luer-lock tip | BD | 309646 | |
| 6-WELL NON-TREATED PLATE | USA Scientific | CC7672-7506 | |
| Aquapel Applicator Pack | Aquapel Glass Treatment | 47100 | |
| CAD software | Autodesk | AutoCAD v2020 | |
| CELL STRAINER 100 µm pore size | cardinal | 335583 | |
| Chlorotrimethylsilane | Aldrich | 386529-100mL | |
| Countess II FL Automated Cell Counter | Life technology | A27974 | |
| Digital hot plate | Dataplate | ||
| Digital vortex mixer | Fisher Scientific | 215370 | |
| Distilled water | Gibco | 15230-162 | |
| Dithiotheritol (DTT) | Sigma | D0632-10G | |
| DMEM/F12 media | gibco | 11320-033 | |
| Falcon 15 mL Conical Centrifuge Tubes | Fisher scientific | 14-959-53A | |
| Fisherbrand accuSpin Micro 17 Microcentrifuge | live | 13-100-675 | |
| HERACELL VIOS 160i CO2 Incubator | Thermo Scientific | 50144906 | |
| Inverted Fluorescence Motorized Microscope | Olympus | Olympus IX83 | |
| Laurell Spin Coaters | Laurell Technologies | WS-650MZ-23NPPB | |
| Live/Dead mammalian staining kit | Fisher | L3224 | |
| Magic tape | Staples | 483535 | |
| Micro Medical Tubing (0.015" I.D. x 0.043" O.D.) | Scientific Commodities, Inc | BB31695-PE/2 | |
| Micro stir bar | Daigger Scientific | EF3288E | |
| MilliporeSigma Filter Forceps | Fisher scientific | XX6200006P | |
| Mineral oil | Sigma | M8410-1L | |
| mTeSR 1 Basal Medium | STEMCELL TECHNOLOGY | 85850 | |
| Needles-Stainless Steel 14 Gauge | CML supply | 901-14-025 | |
| Needles-Stainless Steel 15 Gauge | CML supply | 901-15-050 | |
| OptiPrep | STEMCELL TECHNOLOGY | 7820 | |
| Oven | Thermo Scientific | HERA THERM Oven | |
| Penicillin:Streptomycin (10,000 U/mL Penicillin G, 10mg/mL Streptomycin) | Gemini | 400-109 | |
| Petri Dish 150X20 Sterile Vent | Sarstedt, Inc. | 82.1184.500 | |
| Plasma Cleaning System | Yield Engineering System, Inc. | YES-G500 | |
| Pluronic F-127 | Sigma | P2443-250G | |
| Poly(ethylene glycol) 35kDa | Sigma | 94646-250G-F | |
| PrecisionGlide Needle 27G | BD | 305109 | |
| Rock inhibitor Y-27632 dihydrocloride | SELLECK CHEM | S1049-10mg | |
| Silicon wafer 100mm | University Wafer | 452 | |
| Slide glass (75mm ´ 25mm) | CardinalHealth | M6146 | |
| Span 80 | Sigma | S6760-250ML | |
| SpeedMixer | Thinky | ARE-310 | |
| Spin-X Centrifuge Tube Filter (0.22 µm) | Costar | 8160 | |
| SU-8 2025 | Kayaku Advanced Materials | Y111069 0500L1GL | |
| SU-8 developer | Kayaku Advanced Materials | Y020100 4000L1PE | |
| Surgical Design Royaltek Stainless Steel Surgical Scalpel Blades | fisher scientific | 22-079-684 | |
| SYLGARD TM 184 Silicone Elastomer Kit (PDMS) | Dow Corning | 2065622 | |
| Syringe pump | New Era Pump System, Inc | NE-4000 | |
| Triethanolamine | Sigma-aldrich | T58300-25G | |
| TrypLE Express | Gibco | 12604-013 | |
| Tygon Tubing (0.02" I.D. x 0.06" O.D.) | Cole-Parmer | 06419-01 | |
| Tygon Tubing (0.04" I.D. x 0.07" O.D.) | Cole-Parmer | 06419-04 | |
| Ultrasonic cleaner FS20D | Fisher Scientific | CPN-962-152R | |
| Vacuum desiccator | Bel-Art | F42025-0000 | |
| Zeiss Stemi DV4 Stereo Microscope 8x-32x | ZEISS | 435421-0000-000 | |
| μPG 101 laser writer | Heidelberg Instruments | HI 1128 |
References
- Zhu, Z., Huangfu, D. Human pluripotent stem cells: an emerging model in developmental biology. Development. 140 (4), 705-717 (2013).
- Liu, G., David, B. T., Trawczynski, M., Fessler, R. G. Advances in pluripotent stem cells: history, mechanisms, technologies, and applications. Stem Cell Reviews and Reports. 16 (1), 3-32 (2020).
- Chan, S. W., Rizwan, M., Yim, E. K. Emerging methods for enhancing pluripotent stem cell expansion. Frontiers in Cell and Developmental Biology. 8, 70 (2020).
- Lei, Y., Schaffer, D. V. A fully defined and scalable 3D culture system for human pluripotent stem cell expansion and differentiation. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110 (52), 5039-5048 (2013).
- Olmer, R., et al. Suspension culture of human pluripotent stem cells in controlled, stirred bioreactors. Tissue Engineering Part C: Methods. 18 (10), 772-784 (2012).
- Kraehenbuehl, T. P., Langer, R., Ferreira, L. S. Three-dimensional biomaterials for the study of human pluripotent stem cells. Nature Methods. 8 (9), 731-736 (2011).
- Fattahi, P., et al. Core-shell hydrogel microcapsules enable formation of human pluripotent stem cell spheroids and their cultivation in a stirred bioreactor. Scientific Reports. 11 (1), 1-13 (2021).
- Siltanen, C., et al. Microfluidic fabrication of bioactive microgels for rapid formation and enhanced differentiation of stem cell spheroids. Acta Biomaterialia. 34, 125-132 (2016).
- Agarwal, P., et al. One-step microfluidic generation of pre-hatching embryo-like core-shell microcapsules for miniaturized 3D culture of pluripotent stem cells. Lab on a Chip. 13 (23), 4525-4533 (2013).
- Siltanen, C., et al. One step fabrication of hydrogel microcapsules with hollow core for assembly and cultivation of hepatocyte spheroids. Acta Biomaterialia. 50, 428-436 (2017).
- Rahimian, A., Siltanen, C., Feyzizarnagh, H., Escalante, P., Revzin, A. Microencapsulated immunoassays for detection of cytokines in human blood. ACS Sensors. 4 (3), 578-585 (2019).
- Kim, M., Lee, J., Jones, C. N., Revzin, A., Tae, G. Heparin-based hydrogel as a matrix for encapsulation and cultivation of primary hepatocytes. Biomaterials. 31, 3596-3603 (2010).
- Shin, D. S., et al. Photodegradable hydrogels for capture, detection, and release of live cells. Angewandte Chemie International Edition. , (2014).
- You, J., et al. Bioactive photodegradable hydrogel for cultivation and retrieval of embryonic stem cells. Advanced Functional Materials. , (2015).
