Summary
この記事では、同軸流集束装置を用いたヒト多能性幹細胞(hPSC)のカプセル化について説明する。我々は、このマイクロ流体封止技術がhPSCスフェロイドの効率的な形成を可能にすることを実証する。
Abstract
ヒト多能性幹細胞(hPSC)の三次元(3D)またはスフェロイド培養は、分化転帰およびスケーラビリティの改善という利点を提供する。本稿では、コアシェルマイクロカプセル内にhPSCを閉じ込めるために同軸流集束装置を利用するhPSCスフェロイドの堅牢で再現性のある形成のための戦略を説明する。コア溶液はhPSCsの単一細胞懸濁液を含み、高分子量ポリ(エチレングリコール)(PEG)および密度勾配培地の混入によって粘性を持たせた。シェルストリームはPEG-4アームマレイミドまたはPEG-4-Malで構成され、コアストリームに沿って2つの連続したオイルジャンクションに向かって流れました。液滴形成は、シェル溶液がコアの周りに自分自身を包み込む最初のオイル接合部で起こった。シェルの化学的架橋は、これらの液滴にジチオール架橋剤(1,4−ジチオスレイトールまたはDTT)を導入することによって、第2の油接合部で起こった。架橋剤は、クリック化学 を介して マレイミド官能基と反応し、マイクロカプセルの周囲にヒドロゲルシェルを形成する。当社のカプセル化技術は、直径400μmのカプセルを毎秒10カプセルの割合で製造しました。得られたカプセルは、ヒドロゲルシェルと水性コアを有し、単一細胞が迅速に凝集体に集合し、スフェロイドを形成することを可能にする。カプセル化のプロセスはhPSCの生存率に悪影響を及ぼさず、カプセル化後3日目に>95%の生存率が観察された。比較のために、固体ゲル微粒子(水性コアなし)に封入されたhPSCはスフェロイドを形成せず、封入後3日目に<50%の生存率を有していた。コアシェル型マイクロカプセル内のhPSCのスフェロイド形成は、封入後48時間以内に起こり、スフェロイド直径は細胞接種密度の関数である。全体として、このプロトコルに記載されているマイクロ流体カプセル化技術は、hPSCsカプセル化および回転楕円体形成に適していた。
Introduction
ヒト多能性幹細胞(hPSC)の3D培養には、この培養フォーマットによってもたらされる改善された多能性および分化能のためにかなりの関心がある1、2、3。hPSCは、典型的には、バイオリアクター、マイクロウェル、ヒドロゲル、およびポリマー足場4、5、6によってスフェロイドまたは他の3D培養フォーマットに成形される。カプセル化は、単一のhPSCを回転楕円体に編成するための別の手段を提供する。一旦カプセル化されたhPSCスフェロイドは、容易に取り扱い、分化、疾患モデリング、または薬物検査実験のためにマイクロタイタープレートに移され得る。ヒドロゲル層にhPSCを包み込むと、剪断損傷から細胞を保護し、バイオリアクター内でスフェロイドを高い攪拌速度で培養することができます7。
幹細胞カプセル化のための私たちの方法論は、時間の経過とともに進化しました。まず、固体ヒドロゲル微粒子に着目し、マウス胚性幹細胞(mESC)の内包・培養に成功したことを実証しました8。しかし、ヒト胚性幹細胞(hESC)は、このようなヒドロゲル微粒子に封入した場合の生存率が低いことが注目されたが、これはおそらく、これらの細胞が封入後に細胞間接触を再確立する必要性が大きいためである。我々は、水性コアを有する不均一なマイクロカプセルが、細胞間接触の迅速な再確立に依存する細胞のカプセル化に適している可能性があると推論した。水性コア/ヒドロゲルシェルマイクロカプセルを製造するための同軸流集束マイクロ流体装置の概念は、He et al.9から適応されたが、元のアプローチで採用されたアルギン酸塩の代わりに、PEGベースのヒドロゲルがシェルに組み込まれた。我々はまず、コアシェル型マイクロカプセル10 における初代肝細胞のカプセル化およびスフェロイド形成の成功を実証し、最近ではhESおよびiPS細胞のカプセル化7について説明した。 図1Aで概説されているように、カプセルは、シェルおよびコアの流れが油相に放出される前に、左右から同軸の流れに移行するフロー集束装置内で製造される。コアフローには溶液の粘度を増加させる細胞および添加剤(非反応性PEG MW 35kDおよびイオジキサノール - 商品名OptiPrep)が含まれ、シェルストリームには反応性分子(PEG-4-Mal)が含まれています。連続的な同軸流流は、コアシェルアーキテクチャを保持する液滴に離散化される。コアシェル構造は、クリック化学 を介して PEG-4-Malと反応し、薄い(〜10μm)ヒドロゲルスキンまたはシェルの形成をもたらすジチオール架橋剤(DTT)への曝露によって恒久的になる。エマルジョンが破壊され、カプセルが水相に移された後、PEGの分子はコアから拡散し、水分子によって置き換えられる。これは、水性コアおよびヒドロゲルシェルマイクロカプセルをもたらす。
以下に、マイクロ流体デバイスの製造方法、細胞の調製方法、およびhPSCのカプセル化方法に関するステップバイステップの手順を示します。
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Protocol
1. デバイス製造
- マイクロカプセル化装置及び解離装置の設計は、CADソフトウェア10,11を用いて行う。
- SU-8フォトレジストの3層をシリコンウェーハ上に順次スピンコートし(図2A)、所望の高さ(60、100、および150μm)の構造を達成する。
メモ: 上部金型と下部金型のプロセスは同じです。- SU-8 2025ネガ型フォトレジストでクリーンな10cmシリコンウェハを1,100rpmでスピンコートし、最初の60μm層を作成しました。ホットプレート上で65°Cで3分間、95°Cで10分間ソフトベークした後、μPG 101PCにコアチャネルパターンの設計ファイルをアップロードしてマスクレスアライナーを用いて金型を露出させた。その後、65°Cで3分間、95°Cで10分間露光後ベークを進めた。
- 2番目のSU-8 2025レイヤー(40μm)を1,500rpmでスピンコートし、シェルチャンネルパターンに適したCADファイルをアップロードして露光します。
メモ: ソフトベイクと露光後のベイクは、前の手順と類似していました。 - 3番目のSU-8 2025層を1,400rpmでスピンコートして高さ50μmを達成し、上記のプロセスを繰り返しますが、油相の構造を露出させます。
- 未露光のフォトレジストが全て除去されるまでSU-8現像液に浸漬して3層全てを1段階で現像する。
- 金型を160°Cのホットプレート上で10分間ハードベークして密着性を向上させ、現像後に発生する可能性のある小さなクラックをシールします。
- 次のステップでエラストマーの結合を避けるために金型をクロロトリメチルシランにさらし、使用するまで15cmのペトリ皿に入れます。
- 図1D及び図2Bで説明したように、同様に解離装置用モールドを準備する。ステップ1.2.3で前述したように、シリコンウェーハ上にSU-8フォトレジストの1層をスピンコートして、所望の高さ(50μm)の構造を達成する。前のステップと同様に、ソフトベイクと露光後のベイク、現像、ハードベイクを行います。
注:三角形の支柱の配列がチャンバ全体を覆い、チャンバの幅が出口に向かって減少するにつれてポスト間の間隔が狭まりました。三角形の支柱は、400 μm(入口)から30 μm(出口)の範囲のピッチで、片面あたり200 μmであった。 - ポリジメチルシロキサン(PDMS)を用いたソフトリソグラフィー法により金型を作製した。
- PDMSエラストマーベースとエラストマー硬化剤を遊星遠心分離機で10:1のw / w比で混合します。マイクロカプセル化マスターモールドと解離マスターモールドの両方に混合物を注ぎ、3〜4mmの層を作成します。
注:50gのエラストマーベースと5gの硬化剤の混合物は、厚さ3mmのマスターモールドを覆うのに十分です。 - 金型を入れたシャーレを真空デシケーターに15分間置き、未硬化PDMSを脱気した。
- ペトリ皿をオーブンに移し、80°Cで最低60分間焼く。
- オーブンからマスターモールドを取り外し、冷却させます。精密ナイフを使用して、ウェーハの形状に合わせてPDMSを慎重に切断し、PDMS片をマスターモールドから剥がします。
- メスで各デバイスのエッジをトリミングしてPDMSスラブを切り取り、解離デバイスの入口/出口流体ポートをパンチアウトし、ステンレス製の針を使用して上部のマイクロ流体デバイスのみにパンチアウトします。汚染を避けるために、デバイスをマジックテープで覆います。
メモ: ニードルゲージは、入口ポートと出口ポートでそれぞれ 14 G と 15 G です。 - 接合のために、PDMS片の上下のパターン化された側面を、プラズマエッチャー上のO2 プラズマで2分間処理する。
- 両方のPDMS部品を立体鏡の下に合わせ、蒸留水の薄い分離層をマイクロチャネル(2μL)に直接加えます。
- アライメントされたPDMS装置を80°Cのオーブンに一晩置いて接合を完了し、PDMSを元の疎水性状態に戻した。さらに使用するまで、デバイスを保管してください。
注:これにより、コア用に120μm、シェル用に200μm、オイルチャネル用に300μmの3つの異なる高さを有する同軸フローフォーカシング装置が得られます。 - プラズマ接合直後にデバイスを使用するには、疎水性コーティング溶液30 μLを流体チャネルに慎重に、しかししっかりと注入し、疎水性コーティングを達成します。次いで、疎水性コーティング溶液の残留物が装置内で観察されなくなるまで、チャネルに空気を直ちにパージする。
- まず装置のパターン化された側と洗浄されたスライドガラスをO2 プラズマで2分間処理して解離装置を接着し、次いで80°Cのオーブンで一晩さらに硬化させるためにそれらを組み立てる。
メモ: デバイスは、その後使用するまで保管できます。
- PDMSエラストマーベースとエラストマー硬化剤を遊星遠心分離機で10:1のw / w比で混合します。マイクロカプセル化マスターモールドと解離マスターモールドの両方に混合物を注ぎ、3〜4mmの層を作成します。
2. 溶液の調製
- ストックソリューション。まず、実際の使用のためにより低い濃度に希釈されるストック溶液(濃縮溶液)を調製する。
注:ストックソリューションは、低濃度で作業溶液を調製する際の準備時間の節約、材料の節約、保管スペースの削減、および精度の向上に使用されます。- 30 mL の 2x コア溶液 (16% PEG および 34% 密度グラジエント培地) を調製します: 4.8 g の 35 kDa PEG、10.2 mL の密度グラジエントメディア、および 19.8 mL の DMEM/F12 培地を混合します。このコア溶液を0.22μmのシリンジフィルターを使用してろ過します。
- 50 mLの鉱物油を3%界面活性剤で調製する:48.5 mLの鉱物油と1.5 mLの界面活性剤を混ぜる。0.22 μmのシリンジフィルターでろ過した後、滅菌状態に保ちます。
- 50 mLの鉱物油を0.5%界面活性剤で調製する:49.75 mLの鉱物油と0.25 mLの界面活性剤を混ぜる。無菌状態に保ちます。
- 1 Mジチオセリトール(DTT)を調製する:1.5425gのDTTを10mL蒸留水に溶解する。無菌状態に保ちます。
- 1 Mトリエタノールアミン(TEA)を調製する:433.6 μLの蒸留水に66.4 μLのTEAを加える。無菌状態に保ちます。
- 1%プルロニックF127(PF127)を調製する:100mgのPF127を10mLの蒸留水に溶解する。無菌状態に保ちます。
- 実用的なソリューション
- 4.5 mL の鉱物油と 3% 界面活性剤、および 300 μL の 1 M DTT (1:15 比) を混合して架橋剤エマルジョンを調製します。溶液を2分間ボルテックスし、20°Cの超音波浴中で45〜60分間超音波処理する。 この溶液を27G針で5mLシリンジにロードする。
注:エマルジョンは、油/水混合物を超音波処理することによって生成されます。 - 27G針で5mLシリンジに0.5%界面活性剤を含む鉱物油をロードすることによって遮蔽油溶液を調製する。
- 400 μLの1x DPBSに32 mgのPEG-4-Malを加えてシェル(8% w/v PEG-4-Malおよび15 mM TEA)溶液を調製し、8% w/v溶液を形成し、この溶液を2分間渦巻きます。その後、6 μLの1 M TEA(終濃度15 mM TEA)を添加する。最後に、スピンフィルターを通して13,000 x g で5分間遠心分離し、ロッカーの上で30分間暗闇の中に保ちます。次に、この溶液を27G針で1mLシリンジにロードする。
注:蓋を開ける前にPEG-4-Mal容器を室温で10分間放置し、蓋を閉じる前にN2ガスを吹き込んでO2をN2に置き換えてください。 溶液に添加する前にボルテックスTEAを。
- 4.5 mL の鉱物油と 3% 界面活性剤、および 300 μL の 1 M DTT (1:15 比) を混合して架橋剤エマルジョンを調製します。溶液を2分間ボルテックスし、20°Cの超音波浴中で45〜60分間超音波処理する。 この溶液を27G針で5mLシリンジにロードする。
- コア溶液中の細胞懸濁液を調製する
- hPSCをトリプシンで37°Cで5〜10分間処理する。 それから、それらを皿から集めます。細胞剥離後にトリプシンを培地でクエンチし、次いで細胞を15mL円錐管に移す。
- バルク細胞懸濁液を遠心分離機(400 x g、5分間)する。上清を注意深く吸引し、次いで、最小限の体積の増殖培地を用いて細胞ペレットを再懸濁する。自動セルカウンターを使用してセルをカウントします。
注:典型的な細胞アリコートは12〜20 x106 個の細胞を含み、400 μLのコア溶液を作るのに十分である。 - バルク細胞懸濁液から12〜20 x106 個の細胞を取り、細胞/培地懸濁液を遠心分離する(400 x g、5分間)。
- 細胞ペレットから培地を注意深く吸引する。次いで、200 μL培地および200 μLの2x PEG溶液(最終濃度30〜50 x106 cell/mL)を加え、穏やかに混合する。
注:低い細胞濃度(20 x106 細胞/ mL未満)は、多くの空のカプセルをもたらした。 - 30 μLの1% PF127を溶液に加える。
- マイクロスターラーバー (2 mm x 7 mm) を 1 mL シリンジに挿入し、コア溶液を含むセルを 27 G 針でシリンジにロードします。カプセル化プロセス全体を通して、溶液を氷で冷たく保ちます。
3. 実験セットアップ
- 結合したPDMS液滴装置、長さ20cm、長さ5cmの入口マイクロチューブ(内径0.38mm×外径1.1mm)、出口チューブ1本(内径0.5mm×外径1.5mm)、および0.5cmフィッティングチューブ6本(内径1mm×外径1.8mm)を殺菌光源(通常は生物学的安全キャビネットに内蔵)の下に置き、30分間滅菌します。分。
- 鉗子を使用して、チューブを流体入口ポートと解離ポートにフィットさせます。
- シェルには長さ20cmのマイクロチューブの3本、オイル、架橋剤エマルジョンの注入口には1本、解離装置の入口には1本を使用します。次に、チューブの反対側の端を、対応する溶液でシリンジの針に挿入する。一方、マイクロ流体デバイスのコア入口と解離デバイスの出口を1本の5cmマイクロチューブで接続する(図1C)。
メモ: 入口マイクロチューブは、最後のステップで挿入された継手チューブ内にしっかりと固定する必要があります。 - 1 本の出口チューブを流体出口ポートに挿入し、反対側の端を収集リザーバーに入れます。
- 装置を顕微鏡ステージに置き、チューブを取り付けて動かないようにします。流量検査のために、顕微鏡をデバイスノズルに合わせ、焦点を合わせます。
- 各シリンジを異なるシリンジポンプの上に置き、適切に固定します(図1B)。メーカーのプロトコルに従って、各ポンプを次の流量にプログラムします:コア(3-5 μL/分)、シェル(3-5 μL/分)、シールドオイル(20-80 μL/分)、および架橋オイル(40-60 μL/分)。すべてのポンプでフローを開始します。
- 各流体がデバイスに入るのを待ち、残りの空気を押し出しながらチャネルをいっぱいにします。
メモ: 入口チューブに大量の空気がある場合は、空気が完全に除去されるまで、各流量を一時的に増やしてください。過剰な流量は、PDMSとPDMS間の結合不良につながる可能性があることに注意してください。 - カプセル形成が安定したら(図3)、収集チューブの反対側の端を、5mLのmTeSR培地を含む新しい円錐形チューブに置きます。
注:培地には、10 μM ROCK阻害剤、100 U/mLペニシリン、および100 μg/mLストレプトマイシンが含まれています。 - 十分な数のカプセルが回収された後、5%CO2 と共に37°Cで10分間インキュベートする。油相に常駐するカプセルは、チューブの上部にある( 図4A参照)。チューブを軽く叩くと、カプセルが底に沈降します。この後、ほとんどの油および媒体が吸引され得る。
- 円錐管の底からカプセルを集め、セルストレーナー(孔径100μm)の上に置き、大量の培地で洗浄する。次いで、2mL培地を用いてマイクロカプセルを6ウェル培養プレートに集め、培地をウェルプレートの上に反転させたままフィルターに通した( 図4A参照)。
4. マイクロカプセル中のhPSC培養および分析
- 基本的な文化
- 幹細胞カプセルを6ウェルプレート培養皿中で5%CO2と共に37°Cでインキュベートする。
- 1日おきに培地を交換するには、カプセルをセルストレーナーフィルターに集め、余分な培地で洗浄し、ステップ3.10で行ったように2mL培地で6ウェルプレートの新しいウェルに再懸濁します。
- カプセルを少なくとも10日間培養する。
- 生/死アッセイを実行して、封入幹細胞の生存率を判断します。
- 生/死アッセイ溶液(エチジウムホモダイマー-1およびカルセインAM)を解凍する。
- 4 μL の 2 μM エチジウムホモ二量体-1 および 1 μL の 4 μM カルセイン AM 溶液を 2 mL の滅菌 DPBS に加えます。完全な混合を確実にするための渦。
- セルストレーナーに約100個のマイクロカプセルを集め、滅菌DPBSですすぎ、カプセルから培地を拡散させます。
- ステップ4.2.2で調製した溶液1mLを用いて、それらを再び12穴培養プレートに集める。37°Cで20分間インキュベートする。
- 蛍光顕微鏡下で細胞を可視化する。
注: 細胞生存率は、細胞の総数のうち、緑色で視覚化された生細胞の割合を計算することによって定量化されます。
- 回転楕円体サイズの特性評価。
- 必要に応じて、マイクロカプセルの入ったウェルプレートを顕微鏡下に置き、適切なスケールバーを使用して関連ソフトウェアに表示される回転楕円体の直径を測定します。
- 回転楕円体のサイズを測定および分析します。
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Representative Results
上記のプロトコルに従うことによって、読者はマイクロ流体デバイスを作製し、細胞運搬マイクロカプセルを製造することができるであろう。 図3A は、マイクロ流体液滴生成を用いて作製された最適および非最適マイクロカプセルの例を示す。PEG−4−Malの異なる製剤は、様々な形態のカプセルをもたらした - しわのあるカプセルは、貧弱なゲル化、低い機械的完全性、および撹拌バイオリアクターでの培養に耐えられなかった。PEG含量>6%で観察された滑らかなカプセルは、所望のカプセル形態を表し、細胞培養に十分堅牢であった。コアシェル構造は、マイクロビーズをコアに、蛍光部分をマイクロカプセルのシェルに組み込むことによって確認した。 図3B に見られるようにカプセルの中央におけるビーズの凝集は、コアが水性であり、ビーズが自由に動き回っていることを示すものとして使用された。 図3C で観察された蛍光環状は、ヒドロゲルシェルの存在を示し、シェルの厚さを決定するために使用した。カプセル化プロセスの確立の初期段階でマイクロビーズの取り込みと蛍光標識を使用することをお勧めします。
カプセル化プロセスが確立されると、hPSCのカプセル化に進むことができます。このプロトコルはH9セルのカプセル化を記述していますが、別のhESCライン(HUES-8)とiPSCライン(1016)をカプセル化するために同様の戦略を使用しました。7名
カプセル化は封入装置のみを用いて実施してもよいが、我々は、hPSCsが系内で凝集する傾向があり、その結果、不均一な封入またはカプセル占有率をもたらすことに留意した。この課題に対処するために、我々は解離または濾過装置を設計し、それをカプセル化装置の上流に配置した。この解離装置は、一辺あたり200μmの三角形の支柱の配列と、入口で400μmから出口で30μmの範囲のピッチを有する流路で構成され、凝集塊がカプセル化装置に入る前に保持または分解される( 図1D参照)7。解離装置の使用は、スフェロイドの均一性を有意に改善し、カプセルの細胞占有率を57%から>90%に増加させることを可能にする7。
図 4B,C は、カプセル化実行の代表的な結果を示しています。これらの画像から分かるように、H9細胞は高い生存率を有し、カプセル化実行中に>95%の生存率が日常的に達成される。我々は、カプセル化スフェロイド7の増殖速度(図4B,C参照)および分化能を比較し、カプセル化の過程がhPSCに悪影響を及ぼさないことを決定した。一方、hPSCをカプセル化することにはいくつかの利点があります。カプセル化されたスフェロイドは取り扱いが容易であり、分化プロトコルの開発または治療法の試験のためにマイクロタイタープレートに分配/分配することができる。私たちの研究室では、マイクロカプセルを撹拌バイオリアクターでの懸濁培養用の幹細胞担体として使用することに関心があり、ヒドロゲルシェルがそのような培養物における剪断損傷に対する保護を提供することを実証しました7。これは、ヒドロゲルシェルに分化中の誘導的手がかりの局所的および継続的な送達のための成長因子を装填することができる生理活性マイクロカプセルを作成する上で、私たちが追求している追加の道である。
図1:コアシェル型マイクロカプセルの製造。(A)カプセル生成用のマイクロ流体デバイスは、4つの入口チャネル(コア、シェル、オイル、および架橋剤オイル)と、収集チューブにつながるサーペンタインチャネルで構成されています。このデバイスは、コア、シェル、およびオイルチャネルの高さがそれぞれ120μm(H1)、200μm(H2)、および300μm(H3)になるように製造されています。挿入図は、ノズル−水性流と油流との間の接合部における断面図を表す。この断面図は、リーダーに同軸流路をよりよく見ることができるように90°傾けられています。コアシェル型マイクロカプセル製造プロセスの3D表現は、同軸流が流束接合部の上流でどのように生成され、コアシェル型マイクロカプセル構造を生成するかを示す。乳化は、水性液滴を2つの油流に曝露することによって達成され、そのうちの1つは液滴を安定化するように設計され、第2はPEG-4-Malと反応する架橋剤DTTを提供する。この図は参考文献12から修正されたものである。著作権2019、アメリカ化学会。(B)シリンジポンプ、チューブ、マイクロ流体装置およびカプセル回収チューブの位置を示すカプセル化システムの実験セットアップ。(C)解離およびカプセル化装置をシーケンスで構成するカプセル化システムの画像。(d)大きな細胞凝集体がマイクロカプセル化装置に入るのを避けるために用いられるマイクロ流体解離装置の設計。この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
図2:封止に用いるマイクロ流体デバイスの作製 (a)カプセル化装置の作製。SU-8フォトレジストの3層をスピンコートし、フォトパターン化して、高さの異なるコア、シェル、オイルチャネルを生成しました。コアチャネルの幅は220μmで、カプセル接合部で135μmに狭くなります。すべての相のチャネルは同じ原理に従います:シェルチャネルとオイルチャネルは500μmの幅から始まり、接合部で220μmに狭くなり、シールドオイルは500μmから始まり270μmに狭くなります。アウトレットサーペンタインの幅は1.5mm、長さは約55mmです。次いで、上部および下部PDMS片を整列させ、プラズマ接合した。(b)解離装置の作製。SU-8フォトレジストの1層をスピンコートし、フォトパターン化して解離チャネルを発生させた。次いで、PDMS片をスライドガラスでプラズマ接合した。解離装置は、高さ30μm、長さ16.5mm、入口5mm、出口1.7mmの幅を有する小さなチャンバからなる。それは、入口の420μmによって互いに分離され、出口に向かう途中で近くなり、最後の行で50μmの分離を有する三角形の構造(200μm、正三角形)を有する。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
図3:マイクロカプセルの特性評価。 (A)シェル中のPEG−4−Mal含有量の関数としてのカプセル形態の違い。明るいエッジを有する滑らかなカプセルは、所望の機械的完全性に関連する。(b)マイクロカプセルの水性コアの確認。捕捉されたマイクロビーズは、水性コア内を自由に移動し、マイクロカプセルの中心に凝集する。(c)ローダミンB標識PEGをマイクロカプセルのシェルに含有させることによるコアシェル構造の確認。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
図4:hPSCsのカプセル化 (A)油相中のマイクロカプセルは、媒体で満たされた円錐形のチューブに集められる。マイクロカプセルをチューブの底に沈降させた後、油と培地を吸引し、マイクロカプセルを洗浄し、培養のために6穴プレートに移す。(B)H9細胞を封入してから6時間後に生/死染色する。上の画像は10倍で、下の画像は20倍で撮影した(C)カプセルおよび市販の3D培養プレート中のH9細胞について経時的に変化するスフェロイドサイズを比較した画像(下の画像)。(D)H9培地中で7日間の間にマイクロカプセルおよび標準3D培養プレート中のhPSCについて増加する回転楕円体直径の定量化。統計解析-t検定、p<0.05、n = 20。スケール バー: 200 μm。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
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Discussion
ここで説明するカプセル化プロセスは、hPSCスフェロイドの再現性のある形成をもたらす。マイクロカプセル形式により、分化プロトコルの改善/最適化または治療法の試験を目的とした実験のために、マイクロタイタープレートのウェルにスフェロイドを簡単に分配できます。封入幹細胞スフェロイドは、ヒドロゲルシェルが剪断誘発損傷から細胞を保護する懸濁培養においても使用され得る7。
プロトコル内にはいくつかの重要なステップがあります。コア、シェル、およびオイルの流れの流量を「プロトコル」セクションで説明されている範囲内に保つことが重要です。シェル流量が低すぎると、流れが不安定になり、歪んで機械的に不安定なカプセルを生じる。細胞のカプセル化が成功すると、 図4Cに示すマイクロカプセルのようになります。マイクロカプセルは、同様の直径のものでなければならず、コアに捕捉された同程度の数の細胞を有するべきである。単一細胞のスフェロイドへの凝集は、典型的には48時間以内に起こり、72時間でのスフェロイド形成の欠如は警告徴候である。回転楕円体形成の欠如の1つの理由は、コア中の粘性分子がヒドロゲルシェルを通して十分に迅速に浸出していないことであり得る。カルボキシメチルセルロース(MW 250kD)などの高分子量ポリマーを使用してコア溶液の粘度を調整するときにこのシナリオに遭遇しました。マイクロビーズをカプセル化して( 図3B参照)、これらの細胞サイズの物体がコアの周りを自由に移動できるかどうか、およびコアの成分がどの程度速く浸出するかをテストすることができます。回転楕円体形成の欠如は、>8%w/vのPEG-4-Mal濃度を使用した場合にも遭遇した。このシナリオでは、ヒドロゲルシェルの多孔性および拡散性が低下し、コア内の高粘度要素が、細胞が凝集体を形成することを可能にするのに十分な速さで浸出しない。PEG-4-Malの品質は、バッチまたはメーカーによって異なる可能性があることが考えられる。したがって、シェル内のポリマー濃度のいくらかの調整が必要な場合がある。再び、ビーズ取り込み法は、コア内の粘性成分が水分子によっていかに迅速に置換されるかを明らかにするはずである。私たちの経験では、これはマイクロカプセルを水性環境に移してから3時間以内に起こるはずです。
ここで説明するカプセル化プロトコルは、いくつかのhPSC株7、初代肝細胞10、および複数の癌細胞株に対して良好に機能している(未発表の結果)。しかし、幹細胞由来の(sc)肝細胞とsc-β細胞を封入した後、スフェロイドを形成するのが困難でした。カプセル化されたマイクロビーズを使用したトラブルシューティングにより、粘性成分がコアから急速に溶出し、細胞が自由に移動して細胞間接触を形成することが明らかになりました。追加のトラブルシューティングでは、ジチオール架橋剤DTT(油相中に存在する)の滴定濃度を66mMから10mMに下げました。sc肝細胞およびβ細胞のスフェロイド形成は、このより低い濃度のDTTで起こった。したがって、ユーザーは、架橋剤濃度の最適化を検討することができますが、これは、上記の他のトラブルシューティング手順が成功しなかった場合に限ります。我々は、DTT濃度が66mM DTTを有するマイクロカプセルの機械的完全性を維持するために重要であり、機械的に堅牢なマイクロカプセルをもたらし、今日まで使用されている細胞型の大多数に対して無毒であることを見出した。
3D幹細胞構築物を作成するための多くの戦略が文献に記載されている。コアシェルマイクロカプセル内で幹細胞構築物を形成することの利点は複数ある。一旦カプセル化されると、スフェロイドは、剪断損傷に対する保護を提供するヒドロゲルカプセルを用いて容易に取り扱うことができる。封入されたスフェロイドは、幹細胞を損傷することなく激しい攪拌で懸濁状態で培養することができる。
マイクロカプセルの能力を拡張するための複数の手段がある。我々のチームは以前、肝細胞および幹細胞のカプセル化のためのヘパリン含有ヒドロゲルの使用について説明しており8,12、および現在、幹細胞への誘導的手がかり(GF)の貯蔵および局所放出のための貯蔵および貯蔵のためのデポーとして機能するヘパリン含有生理活性コアシェルマイクロカプセルを開発している。このようなマイクロカプセルは、分化転帰を改善しながら高価なGFの使用を減らすのに役立ち得る。マイクロカプセルは、ECMタンパク質をコアに組み込んで幹細胞微小環境を調節することによってさらに増強され得る。コアシェル型マイクロカプセルは、hPSCスフェロイド13、14を取り出すのを容易にするために分解性にしてもよい。全体として、コアシェルマイクロカプセルは、特定の幹細胞分化プロトコールのニーズに対処するために変更および強化することができるプラットフォーム技術を表す。
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Disclosures
著者らは開示するものは何もありません。
Acknowledgments
この研究は、メイヨー・クリニック再生医療センター、J・W・キークヘファー財団、アル・ナヒヤン財団、ミネソタ州再生医療(RMM 101617 TR 004)、NIH(DK107255)からの助成金によって部分的に支援された。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.22 µm Syringe Filters | Genesee Scientific | 25-244 | |
| 1 ml syringe luer-lock tip | BD | 309628 | |
| 1x DPBS | Corning | 23220003 | |
| 4-arm PEG maleimide, 10kDa | Laysan Inc. | 164-68 | |
| 5 ml syringe luer-lock tip | BD | 309646 | |
| 6-WELL NON-TREATED PLATE | USA Scientific | CC7672-7506 | |
| Aquapel Applicator Pack | Aquapel Glass Treatment | 47100 | |
| CAD software | Autodesk | AutoCAD v2020 | |
| CELL STRAINER 100 µm pore size | cardinal | 335583 | |
| Chlorotrimethylsilane | Aldrich | 386529-100mL | |
| Countess II FL Automated Cell Counter | Life technology | A27974 | |
| Digital hot plate | Dataplate | ||
| Digital vortex mixer | Fisher Scientific | 215370 | |
| Distilled water | Gibco | 15230-162 | |
| Dithiotheritol (DTT) | Sigma | D0632-10G | |
| DMEM/F12 media | gibco | 11320-033 | |
| Falcon 15 mL Conical Centrifuge Tubes | Fisher scientific | 14-959-53A | |
| Fisherbrand accuSpin Micro 17 Microcentrifuge | live | 13-100-675 | |
| HERACELL VIOS 160i CO2 Incubator | Thermo Scientific | 50144906 | |
| Inverted Fluorescence Motorized Microscope | Olympus | Olympus IX83 | |
| Laurell Spin Coaters | Laurell Technologies | WS-650MZ-23NPPB | |
| Live/Dead mammalian staining kit | Fisher | L3224 | |
| Magic tape | Staples | 483535 | |
| Micro Medical Tubing (0.015" I.D. x 0.043" O.D.) | Scientific Commodities, Inc | BB31695-PE/2 | |
| Micro stir bar | Daigger Scientific | EF3288E | |
| MilliporeSigma Filter Forceps | Fisher scientific | XX6200006P | |
| Mineral oil | Sigma | M8410-1L | |
| mTeSR 1 Basal Medium | STEMCELL TECHNOLOGY | 85850 | |
| Needles-Stainless Steel 14 Gauge | CML supply | 901-14-025 | |
| Needles-Stainless Steel 15 Gauge | CML supply | 901-15-050 | |
| OptiPrep | STEMCELL TECHNOLOGY | 7820 | |
| Oven | Thermo Scientific | HERA THERM Oven | |
| Penicillin:Streptomycin (10,000 U/mL Penicillin G, 10mg/mL Streptomycin) | Gemini | 400-109 | |
| Petri Dish 150X20 Sterile Vent | Sarstedt, Inc. | 82.1184.500 | |
| Plasma Cleaning System | Yield Engineering System, Inc. | YES-G500 | |
| Pluronic F-127 | Sigma | P2443-250G | |
| Poly(ethylene glycol) 35kDa | Sigma | 94646-250G-F | |
| PrecisionGlide Needle 27G | BD | 305109 | |
| Rock inhibitor Y-27632 dihydrocloride | SELLECK CHEM | S1049-10mg | |
| Silicon wafer 100mm | University Wafer | 452 | |
| Slide glass (75mm ´ 25mm) | CardinalHealth | M6146 | |
| Span 80 | Sigma | S6760-250ML | |
| SpeedMixer | Thinky | ARE-310 | |
| Spin-X Centrifuge Tube Filter (0.22 µm) | Costar | 8160 | |
| SU-8 2025 | Kayaku Advanced Materials | Y111069 0500L1GL | |
| SU-8 developer | Kayaku Advanced Materials | Y020100 4000L1PE | |
| Surgical Design Royaltek Stainless Steel Surgical Scalpel Blades | fisher scientific | 22-079-684 | |
| SYLGARD TM 184 Silicone Elastomer Kit (PDMS) | Dow Corning | 2065622 | |
| Syringe pump | New Era Pump System, Inc | NE-4000 | |
| Triethanolamine | Sigma-aldrich | T58300-25G | |
| TrypLE Express | Gibco | 12604-013 | |
| Tygon Tubing (0.02" I.D. x 0.06" O.D.) | Cole-Parmer | 06419-01 | |
| Tygon Tubing (0.04" I.D. x 0.07" O.D.) | Cole-Parmer | 06419-04 | |
| Ultrasonic cleaner FS20D | Fisher Scientific | CPN-962-152R | |
| Vacuum desiccator | Bel-Art | F42025-0000 | |
| Zeiss Stemi DV4 Stereo Microscope 8x-32x | ZEISS | 435421-0000-000 | |
| μPG 101 laser writer | Heidelberg Instruments | HI 1128 |
References
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