Modelo de sangramento da transeção da veia da cauda em hemofilia totalmente anestesiada um camundongo

Resumo

O modelo de sangramento de veia traseira refinada (TVT) em camundongos anestesiados é um método in vivo sensível para a avaliação do sangramento hemofílico. Este modelo de sangramento otimizado da TVT usa perda de sangue e tempo de sangramento como pontos finais, refinando outros modelos e evitando a morte como ponto final.

Resumo

Modelos de sangramento de cauda são ferramentas importantes na pesquisa de hemofilia, especificamente para a avaliação de efeitos procoagulantes. O modelo de sobrevivência da veia traseira (TVT) tem sido preferido em muitas configurações devido à sensibilidade a doses clinicamente relevantes de FVIII, enquanto outros modelos estabelecidos, como o modelo de clipe de cauda, requerem níveis mais elevados de compostos procoagulantes. Para evitar o uso da sobrevivência como ponto final, desenvolvemos um modelo de TVT estabelecendo perda de sangue e tempo de sangramento como pontos finais e anestesia completa durante todo o experimento. Brevemente, camundongos anestesiados são posicionados com a cauda submersa em soro fisiológico temperado (37°C) e dosados com o composto de teste na veia lateral direita da cauda. Após 5 minutos, a veia lateral esquerda é transectada usando um guia de modelo, a cauda é devolvida ao soro fisiológico, e todos os episódios de sangramento são monitorados e registrados por 40 minutos durante a coleta do sangue. Se não ocorrer sangramento em 10 min, 20 min ou 30 min após a lesão, o coágulo é desafiado suavemente limpando o corte duas vezes com um cotonete de gaze molhada. Após 40 min, a perda de sangue é quantificada pela quantidade de hemoglobina sangrada no soro fisiológico. Este procedimento rápido e relativamente simples resulta em sangramentos consistentes e reprodutíveis. Em comparação com o modelo de sobrevivência da TVT, utiliza um procedimento mais humano sem comprometer a sensibilidade à intervenção farmacológica. Além disso, é possível utilizar ambos os sexos, reduzindo o número total de animais que precisam ser criados, em adesão aos princípios das 3R's. Uma limitação potencial nos modelos sanguíneos é a natureza estocástica da hemostase, que pode reduzir a reprodutibilidade do modelo. Para combater isso, a interrupção manual do coágulo garante que o coágulo seja desafiado durante o monitoramento, impedindo que a hemostasia primária (plaqueta) pare de sangrar. Esta adição ao catálogo de modelos de lesão hemorrágida fornece uma opção para caracterizar efeitos procoagulantes de forma padronizada e humana.

Introdução

Modelos animais são essenciais para compreender a patogênese da hemofilia e desenvolver e testar regimes e terapias de tratamento. O rato-nocaute Fator VIII (F8-KO) é um modelo amplamente utilizado para o estudo da hemofilia A ^1,2. Esses camundongos recapitulam características-chave da doença e têm sido amplamente utilizados para o desenvolvimento de tratamentos, como produtos FVIII recombinantes ^3,4,5 e estratégias de terapia genética ^6,7.

Existem vários modelos de lesão hemorrágica para avaliar os efeitos farmacológicos de diferentes compostos hemostáticos in vivo. Um desses modelos de coagulação é o modelo de sobrevivência da transeção da veia traseira em camundongos 8,9,10,11,12,13,14, medindo a capacidade dos camundongos hemofílicos de sobreviver à exsanguinação após transeção de cauda. Este método foi introduzido há mais de quatro décadas^{, 15} e ainda é utilizado ^9,16,17. No entanto, o modelo utiliza a sobrevivência como ponto final e requer observação dos animais durante um período de até 24 horas, durante o qual os animais estão conscientes e, portanto, podem sentir dor e angústia.

Modelos de sangramento de menor duração e sob anestesia total foram descritos anteriormente, como o modelo de clipe de cauda (também conhecido como ponta traseira)8,18,19,20,21,22,23,24,25,26,27,28 . No entanto, para uma normalização completa da perda de sangue após o desafio de sangramento, esses modelos requerem doses de compostos procoagulantes (por exemplo, FVIII) muito superiores aos administrados clinicamente²⁹. Um modelo diferente de lesão sob anestesia, o método de sangramento vena saphena, é sensível a doses mais baixas de compostos procoagulantes³⁰, mas requer um alto nível de intervenção experimentadora, uma vez que os coágulos devem ser interrompidos com frequência (ao contrário de 3 vezes no modelo apresentado).

A padronização para um protocolo comum para testar novos compostos procoagulantes facilitaria muito a comparação de dados entre os laboratórios 31,32,33. Nos modelos tvt, ainda não há uma concordância comum sobre os pontos finais estudados (perda de sangue ^7,26, tempo de sangramento ^9,34 e taxa de sobrevivência^35,36), e comprimento experimental varia entre os estudos¹³.

Nosso objetivo principal é descrever e caracterizar um modelo otimizado com alta reprodutibilidade, a possibilidade de estudar sob demanda, bem como um tratamento profilático, sensibilidade à intervenção farmacológica equivalente ao modelo de sobrevivência, mas não utilizando a morte ou quase-morte como pontos finais. Para reduzir a dor e a angústia, os animais não devem estar conscientes durante o sangramento e um ponto final mais ético precisa ser implementado³⁷.

Os modelos de clipe de cauda são geralmente conduzidos em uma das duas variantes, ou amputando a ponta da cauda, por exemplo, amputação de 1-5 mm 18,19,20,21,23,24 ou, em uma variante mais grave, transeccionada a um diâmetro de cauda em torno de 1-3 mm ^8,22,25 . Isso causa um sangramento arteriovenoso combinado, pois as veias laterais e dorsais e a artéria ventral são geralmente cortadas, e em geral, quanto maior a amputação, menor a sensibilidade a um composto procoagulante. Além disso, uma vez que a ponta da cauda é amputada, a lesão arteriovenosa é exposta sem qualquer tecido oposto; assim, pelo menos em teoria, é diferente dos sangramentos hemofílicos mais comuns.

Como o nome indica, apenas a veia é ferida em modelos de transeção da veia traseira, como descrito neste artigo, resultando em uma hemorragia exclusivamente venosa. Uma vez que o vaso não é totalmente cortado, espera-se que a lesão seja menor do que nos modelos de amputação, e o tecido ao redor do corte, que um coágulo pode aderir, é retido. Além disso, há pressão arterial mais baixa na veia em oposição à artéria. Esses fatores contribuem para um aumento da sensibilidade em relação aos modelos de amputação, de modo que a normalização do sangramento possa ser alcançada com doses clinicamente relevantes de terapia de reposição, por exemplo, com rFVIII em hemofilia A, o que é útil para avaliar a magnitude e durabilidade dos efeitos do tratamento procoagulante ^26,38,39.

Protocolo

Todos os procedimentos descritos neste protocolo foram aprovados pelo Corpo de Bem-Estar Animal da Novo Nordisk A/S, e pela Inspetoria dinamarquesa de Experimentos Animais, Ministério dinamarquês de Alimentos, Agricultura e Pesca. O método otimizado de 40 minutos inclui anestesia e tempo de dosagem no desenho (Figura 1). Camundongos hemofílicos de ambos os sexos entre 10 e 16 semanas de idade são necessários para este procedimento.

1. Preparativos antes do estudo

1. Prepare as soluções de dosagem nas concentrações corretas.
2. Comece o banho de água e aqueça até 37 °C. Encha os tubos de centrífuga de 15 mL para coleta de sangue com soro fisiológico (0,9% NaCl).
3. Coloque os tubos salinos de 15 mL nos orifícios na placa de base aquecida pelo menos 15 minutos antes do início do experimento.
4. Identifique os ratos e regisse seu peso. Evite manusear camundongos mais do que o necessário, pois isso pode causar estresse e afetar o estudo.
5. Prepare a estação de trabalho no capô da fumaça antes de prosseguir para que tudo esteja ao alcance: guardanapos, porta-caudas, gaze, seringas, bisturis, cronômetros e papel de notação de fluxo sanguíneo.
6. Coloque a marca da cauda e os blocos de corte na placa de aquecimento - blocos frios farão as veias se contraírem e, assim, afetarão o sangramento.

2. Anestesia

1. Conduza o procedimento anestésico isoflurane dentro de um capô de fumaça.
2. Coloque o vaporizador de gás inicialmente 5% de isoflurane em 30% O₂/70% N₂O na câmara de anestesia com fluxo de 1 L/min. Dê tempo suficiente para a câmara de anestesia preencher (cerca de 5 minutos dependendo do volume da câmara e da taxa de fluxo de gás). Garanta a indução rápida (menos de um minuto).
3. Coloque os ratos na câmara de anestesia até que percam a consciência.
   NOTA: Isso deve ocorrer dentro de um minuto ou menos se a câmara estiver suficientemente preenchida.
4. Certifique-se de uma anestesia adequada pela ausência de resposta dolorosa ao reflexo do pedal (aperto no dedo firme).
5. Coloque os ratos na placa de aquecimento, certificando-se de que o nariz está no cone do nariz.
6. Reduza a anestesia a um nível de manutenção de 2% de isoflurane em 30% O₂/70% N₂O e coloque uma tampa plástica acima dos ratos para reduzir a perda de calor. Aplique uma pomada ocular adequada para evitar o ressecamento enquanto estiver sob anestesia.
7. Marque a cauda com um diâmetro de 2,5 mm usando o bloco de marca da cauda. Não force a cauda para dentro da fenda no bloco - ela deve caber snugly (Figura Suplementar 1)
8. Coloque a cauda no tubo salino por pelo menos 5 minutos para garantir uma veia de cauda quente que seja ótima para dosagem intravenosa (i.v.).

3. Dosagem de solução de teste

1. Coloque um rato no suporte da cauda com o nariz em uma máscara de anestesia.
2. Dose o animal com o composto de juros (neste caso, rFVIII) e inicie imediatamente o cronômetro (t = 0).
3. Coloque o mouse de volta na placa de aquecimento com a cauda no tubo salino. Repita o procedimento com os outros ratos.

4. Realização de transeção da veia traseira

1. Realize a transeção da veia traseira exatamente 5 minutos após a dosagem. Coloque a cauda no bloco de corte e gire 90° para expor a veia (Figura Suplementar 2).
2. Realize o corte no lado/veia oposto de onde a solução de teste foi dosada.
3. Desenhe a lâmina de bisturi #11 através da fenda do bloco de corte segurando a cauda para criar sangramento. Reinicie o cronômetro e devolva a cauda imediatamente para o soro fisiológico.

5. Tempo de observação e desafios

1. Observe o sangramento e anote o início e pare o sangramento ao longo de 40 minutos; anotar no papel de notação do fluxo sanguíneo.
   NOTA: Esta avaliação visual do sangramento pode variar ligeiramente devido à subjetividade.
2. O sangramento primário deve parar dentro de 3 minutos após o corte ser feito. Se este não for o caso, desqualifique o mouse, eutanásia e substitua (a falha em parar o sangramento primário pode indicar uma lesão muito grave ou falta de hemostasia primária, como em camundongos vWF KO).
3. Se não houver sangramento em 10 min, 20 min e 30 min pós-lesão, desafie o corte da cauda como descrito nas etapas 4-5.
4. Use um cotonete de gaze embebido em soro fisiológico quente de um tubo separado mantido no banho de água. Levante a cauda para fora do soro fisiológico e limpe suavemente duas vezes com a gaze molhada em uma direção distal sobre o corte da cauda.
5. Após cada desafio, volte imediatamente a submergir a cauda no tubo salino novamente.
6. Em t=40 min, pare a coleta de sangue removendo a cauda do tubo salino.

6. Amostragem de sangue

1. Após t = 40 min, obtenha amostras de sangue da veia supraorbital.

7. Eutanásia

1. Eutanize os camundongos por luxação cervical enquanto ainda está sob anestesia total.

8. Tratamento de amostras

1. Centrifugar os tubos de coleta de sangue de 15 mL com soro fisiológico a 4000 x g por 5 min a temperatura ambiente.
2. Descarte o supernatante dos tubos de 15 mL, resuspenque a pelota em 2-14 mL de solução de eritrócitos (RBC) e, em seguida, dilua-a até atingir uma cor de café leve.
3. Observe o volume total (volume de sangue + volume de eritrócitos (RBC) solução de lise adicionada usando as marcas de graduação no tubo).
4. Transfira 2 mL da diluição para um tubo de hemoglobina e leve à geladeira até a análise da hemoglobina.
5. Determine a perda de sangue medindo a concentração de hemoglobina no soro fisiológico. Meça a absorvância em 550 nm em um leitor de microplacas (Tabela de Materiais).
6. Converta a absorvência em hemoglobina nmol usando uma curva padrão preparada a partir de hemoglobina humana (Tabela de Materiais) e corrija para a diluição com solução de dilatação RBC.

9. Análises estatísticas

1. Analise os dados usando software apropriado. Aqui foi utilizado o software GraphPad Prism. Ao longo de uma série de estudos, verificou-se que os seguintes métodos estatísticos tiveram um bom desempenho.
   NOTA: Para analisar a perda de sangue, tempo de sangramento, exposição, contagem de plaquetas e hematócrito; Foi utilizado o teste Brown-Forsythe e Welch ANOVA ( como os dados eram contínuos, mas sem homogeneidade de variância dos resíduos) aplicando o teste de Dunnett para ajustar para múltiplas comparações. Um teste de Pearson foi usado para testar correlações entre tempo de sangramento, perda de sangue e doses. Para determinar os valores de ED₅₀ , uma equação de resposta inversa de quatro parâmetros (dose) foi encaixada em dados de sangramento e perda de sangue. Para analisar o efeito de gênero, utilizou-se um teste ANOVA bidirecional, aplicando correção de Bonferroni para ajustar para múltiplas comparações. O nível de significância foi definido como P < 0,05. Os dados são exibidos como meios ± SEM.

Resultados

Para avaliar a aplicabilidade do modelo otimizado, foi realizado um estudo em camundongos F8-KO (C57BL de fundo genético) administrados com uma terapia de substituição recombinante de fator VIII comercialmente disponível (rFVIII); foram testadas quatro doses diferentes: 1 UI/kg, 5 UI/kg, 10 UI/kg e 20 UI/kg. Além disso, testamos o controle correspondente do veículo (negativo) em camundongos F8-KO e grupo de tipo selvagem (WT) usando camundongos C57BL como um grupo de controle positivo para avaliar a faixa de resposta no ...

Discussão

Este método otimizado de transeção de veias traseiras (TVT) tem várias vantagens em comparação com o método de sobrevivência da TVT. Os animais são totalmente anestesiados durante toda a duração do estudo, o que facilita o manuseio do rato e aumenta o bem-estar animal. Além disso, ao contrário do modelo de sobrevivência da TVT, a observação noturna não é necessária, e este modelo otimizado oferece a possibilidade de medir a perda de sangue e observar o tempo exato de sangramento acima de 40 minutos. Além disso, períodos ...

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
#11 Lâmina de bisturi	Swann-Morton	503
tubos de centrífuga de 15 mL	Greiner Bio-One, Áustria	188271
agulhas de 30 G conectadas a 300 µ Seringas de precisão L (insulina) para dosagem BD	Micro-Fine + seringa de insulina U-100	320830
Advate	Takeda, Japão		Terapia de reposição recombinante do fator VIII (rFVIII)
Almofadas de álcool 70% etanol	Hartmann, Soft-Zellin	999 979
Centrífuga	Omnifuge 2.0 RS, Heraus Sepatech
Modelo de corte (aço inoxidável)	Autoproduzido, você é bem-vindo para entrar em contato com os autores para os desenhos		exatos Figura Suplementar 2: Especificações de tamanho: 20 mm x 40 mm x 10 mm (L x B x H). Sulco: 3 mm de profundidade e 3 mm de largura; raio 1,5 mm
Solução de lise de eritrócitos (RBC)	Lysebio, ABX Diagnostics	906012
Gaze
Analisador hematológico	Sysmex	CT-2000iv
Lâmpada de aquecimento em suporte	Phillips	IR250
Almofada de aquecimento com termostato	CMA	modelo 150
Padrões e controles de hemoglobina - HemoCue dependente de lote de 8,81 mmol / l	,	calibrador HemoCue da Dinamarca, 707037	Os padrões e controles são feitos de 2 vidros diferentes do calibrador HemoCue. O valor é determinado em relação ao Método Internacional de Referência para Hemoglobina (ICSH).
Sistema de anestesia com isofluorano completo com tubos, máscaras e caixa de indução	Sigma Delta Dameca
Isoflurano	Lupa Baxter	26675-46-7
com luzes	Eschenbach
(Alumínio)	Autoproduzido, você é bem-vindo para entrar em contato com os autores para os desenhos exatos		Figura suplementar 1: Especificações de tamanho: 20 mm x 40 mm x 10 mm (C x B x A). Sulco: 2,5 mm de profundidade e 2,5 mm de largura; raio 1,25 mm
Micropipetas + pontas	Fotômetro Finnpipette
	Molecular Devices Corporation, CA, EUA		SpectraMax 340
Prism Software	GraphPad, San Diego, CA, EUA	Versão 9.0.1
Solução salina 0,9% NaCl	Fresenius Kabi, Suécia	883264
Bloco marcador de cauda especial para corte		de cauda TVT
Suporte de
Sucção de líquido a vácuo	Vacusafe comfort, IBS
Waterbath e termostato	TYP 3/8 Julabo