Espectroscopia de fluorescência de dupla cor para estudar interação proteína-proteína e dinâmica de proteína em células vivas

A espectroscopia de fluorescência é um dos principais métodos para quantificar a dinâmica proteica e as interações proteína-proteína com perturbação mínima em um contexto celular. A espectroscopia de correlação de fluorescência confocal (FCS) é um dos métodos poderosos para analisar a dinâmica molecular, pois é sensível a molécula única, altamente seletiva e compatível com células vivas¹. Em comparação com outras abordagens orientadas à dinâmica, a FCS tem uma faixa de tempo mensurável mais ampla que abrange de ~ ns a ~ s, o mais importante, cobrindo as escalas de tempo rápido que muitas vezes são inacessíveis por métodos baseados em imagem. Além disso, também fornece seletividade espacial para que a dinâmica molecular da membrana, citoplasmática e núcleo possa ser facilmente distinguida ². Assim, o piscar molecular, a concentração local média e o coeficiente de difusão podem ser analisados quantitativamente com FCS. Dinâmicas intermoleculares como a vinculação tornam-se facilmente acessíveis ao sondar a co-difusão de duas espécies moleculares na análise de espectroscopia de correlação transversal de fluorescência (FCCS)^3,4,5 em uma abordagem de dupla cor.

O principal princípio subjacente na espectroscopia de correlação é a análise estatística das flutuações de intensidade emitidas por biomoléculas fluorescentes rotuladas de difusão dentro e fora de um foco laser(Figura 1A). As funções de correlação automática ou cruzada resultantes podem então ser analisadas por encaixe de curva para eventualmente derivar as constantes de juros da taxa. Em outras palavras, os métodos estatísticos FCS e FCCS não fornecem traços de molécula única, como no rastreamento de partículas únicas, mas um padrão dinâmico ou "impressão digital" de um espécime sondado com alta resolução temporal. Quando combinada com a transferência de energia de ressonância Förster (FRET), a dinâmica intramolecular, como alterações conformais, pode ser monitorada ao mesmo tempo em uma configuração confocal comum^5,6. O FRET sonda a distância de dois fluoroforos e é frequentemente referido como um "nanoruler" molecular. A transferência de energia ocorre somente quando as moléculas estão próximas (< 10 nm), o espectro de emissão do doador se sobrepõe significativamente ao espectro de absorção da molécula aceitadora, e a orientação do dipolo do doador e do aceitador é (suficientemente) paralela. Assim, a combinação de FRET e FCCS fornece uma técnica com resolução espátula-temporal muito alta. Quando a seletividade espacial, a sensibilidade e a compatibilidade com células vivas são necessárias, o FRET-FCCS tem uma vantagem óbvia sobre outros métodos como a Calorimetria de Titrção Isotérmica (ITC)^7,a Ressonância de Plasmon superficial (SPR)⁸ou a Ressonância Magnética Nuclear (NMR)^9,10 para medir a dinâmica e as interações proteicas.

Apesar das capacidades e promessas de espectroscopia de fluorescência de duas cores (dc-FCCS), realizar dc-FCCS em células vivas é tecnicamente desafiador devido ao sangramento espectral ou crosstalk entre os canais^3,4, a diferença nos volumes confocal devido às linhas laser espectralmente distintas^3,4,11,sinal de fundo e ruído ou fotoestabilidade limitada das¹²amostras^{, 13,14,15}. A introdução da excitação intercalada de pulso (PIE) para a FCCS foi um ajuste importante para desacoplar temporalmente as diferentes excitações de laser para reduzir o crosstalk espectral entre os canais¹⁶. Outros métodos de correção para combater a sangria espectral^17,18,19 e correções de fundo também foram bem aceitos^17,18,19. Para detalhes e fundamentos em FCS, PIE ou FRET, o leitor é encaminhado para as seguintes referências^{2,4,6,16,20,21,22,23,24}.

Aqui, todos os experimentos e análises de calibração necessárias juntamente com os resultados experimentais de um receptor prototípico de proteína G acoplado, β receptor 2-adrenérgico (β₂AR), para três cenários diferentes são apresentados: (1) moléculas de rótulo único carregando um "verde" (eGFP) ou um "vermelho" (rotulagem baseada em SNAP)²⁵ fluorophore; (2) uma construção de dupla rotulagem, que carrega uma tag SNAP n-terminal e eGFP intracelular (NT-SNAP) [neste caso, ambos os rótulos estão na mesma proteína. Assim, é esperado 100% de co-difusão]; e (3) uma amostra duplamente rotulada, onde ambos os fluoroforos estão do mesmo lado da membrana celular (CT-SNAP). Ele carrega uma tag SNAP terminal C e um eGFP intracelular. Aqui, novamente ambos os rótulos estão na mesma proteína com novamente 100% de co-difusão esperada. Como ambos os rótulos são muito próximos um do outro, no mesmo lado da membrana celular, ele mostra o potencial de observar FRET e comportamento anticorarado. Todas as construções foram transfectadas em células chinesas de ovário hamster (CHO) e posteriormente rotuladas com um substrato fluorescente vermelho que é imune à membrana impermeável para a construção NT-SNAP e permeável à membrana para a construção CT-SNAP. Finalmente, os dados simulados exemplificam a influência dos parâmetros experimentais na anticorrelação induzida pelo FRET e o efeito das interações proteína-proteína na amplitude de co-difusão.

Assim, este protocolo fornece um guia completo para a realização do FRET-FCCS combinado em células vivas para entender a dinâmica proteica e as interações proteína-proteína, ao mesmo tempo em que conscientizam artefatos técnicos/físicos, desafios e possíveis soluções.

1. Protocolo Experimental

1. Preparação da amostra
   NOTA: Realizar semeadura e transfecção celular em condições estéreis.
   1. Coloque uma tampa limpa por poço em uma placa de cultura de 6 poços e lave três vezes com soro fisiológico estéril tamponado (PBS).
      NOTA: O protocolo de limpeza do deslizamento de tampas está detalhado na Nota Complementar 1.
   2. A cada poço, adicione 2 mL do meio de cultura celular completa contendo fenol vermelho (suplementado com 10% de soro bovino fetal (FBS), 100 μg/mL penicilina e 100 μg/mL estreptomicina) e mantenha a placa de lado.
   3. Cultugem as células CHO no mesmo meio contendo fenol vermelho a 37 °C e 5% DE CO_2. Lave as células com 5 mL de PBS para remover as células mortas.
   4. Adicione 2 mL de trippsina e incubar por 2 min em temperatura ambiente (RT).
   5. Diluir as células destacadas com 8 mL de médio contendo fenol vermelho e misturar cuidadosamente por pipetação.
   6. Conte as células em uma câmara de Neubauer e sementes a uma densidade de 1,5 x 10⁵ células/poço na placa de cultura celular de 6 poços contendo as manchas (preparadas na etapa 1.1.1-1.1.2).
   7. Deixe as células crescerem em uma incubadora (37 °C, 5% DE CO₂) por 24 h, a fim de alcançar aproximadamente 80% de confluência.
   8. Diluir 2 μg do DNA vetorial desejado (por exemplo, CT-SNAP ou NT-SNAP) e 6 μL do reagente de transfecção em dois tubos separados, cada um contendo 500 μL do meio de soro reduzido para cada poço e incubar por 5 min em RT.
   9. Misture as duas soluções para obter a mistura de transfecção e incuba-la por 20 minutos na RT.
   10. Enquanto isso, lave as células CHO semeadas uma vez com PBS estéreis.
   11. Substitua o PBS por 1 mL/poço de meio livre de fenol complementado com 10% de FBS sem antibióticos.
   12. Adicione toda a mistura de 1 mL de transfecção em cada poço e incubar as células durante a noite a 37 °C, em 5% de CO₂.
   13. Para rotulagem da construção SNAP, diluir a solução de estoque de substrato SNAP apropriada em 1 mL do meio complementado com 10% de FBS para obter uma concentração final de 1 μM.
   14. Lave as células transfeminadas uma vez com PBS e adicione 1 mL por poço de solução de substrato SNAP de 1 μM. Incubar as células por 20 min a 37 °C em 5% de CO₂.
   15. Lave as células três vezes com meio livre de fenol e adicione 2 mL por meio bem livre de fenol. Incubar as células por 30 min a 37 °C em 5% de CO₂.
   16. Transfira as tampas de todas as amostras posteriormente para a câmara de imagem e lave com 500 μL de tampão de imagem. Adicione 500 μL de tampão de imagem antes de passar para a configuração FRET-FCS.
2. Medições de calibração
   NOTA: A configuração FRET-FCS é equipada com um objetivo de água de microscópio confocal, duas linhas laser, um sistema de contagem de fótons único (TCSPC) correlacionados por tempo, dois tubos fotomultiplier híbridos (PMT) e dois fotodiodos de avalanche (APD) para coleta de fótons e o software de coleta de dados. É muito importante alinhar a configuração sempre antes das medições de células vivas. A descrição detalhada da configuração pode ser encontrada no Note 2 Suplementar. Tanto os lasers quanto todos os detectores (dois PMTs e dois APDs) estão sempre ligados durante as medições, pois todas as medições precisam ser conduzidas em condições idênticas. Para as medidas de calibração, use uma mancha de cobertura do mesmo lote em que as células foram semeadas, isso diminui a variação na correção do anel de colarinho.
   1. Para ajustar o foco, a posição do anel do pinhole e da coleira, coloque a solução de calibração verde de 2 nM em um deslizamento de tampa de vidro e ligue o laser de 485 nm e 560 nm. Operar laser no modo Excitação Intercalada Pulsada (PIE)¹⁶.
   2. Concentre-se na solução e ajuste a posição do anel de pinhole e do colarinho de modo que a maior taxa de contagem e o menor volume confocal sejam obtidos para obter o brilho molecular máximo.
   3. Repita este processo para os canais vermelhos com solução de calibração vermelha de 10 nM e uma mistura de ambos, a solução de calibração verde e vermelha.
   4. Coloque a solução de DNA de 10 nM em uma mancha de vidro e ajuste a posição do anel de foco, pinhole e colarinho de modo que a correlação cruzada entre os canais de detecção verde e vermelho seja maior, ou seja, mostra a maior amplitude.
      NOTA: As etapas 1.2.1 e 1.2.4 podem ter que ser repetidas para frente e para trás para encontrar o alinhamento ideal. Tome 3-5 medidas de cada solução de calibração para 30 s - 120 s após a posição do anel de foco, pinhole e colarinho ter sido alinhado idealmente para os canais de detecção verde e vermelho e o volume de sobreposição confocal.
   5. Meça uma gota de ddH₂O, o meio de imagem e uma célula não transfeinada 3-5 vezes cada para 30 s - 120 s para determinar as taxas de contagem de fundo.
   6. Colete a função de resposta do instrumento com medidas de 3-5 para 30 s - 120 s. Isso é opcional, mas altamente recomendado.
3. Medições de células vivas
   1. Encontre uma célula adequada iluminando com a lâmpada de mercúrio e observando através do ocular.
      NOTA: As células adequadas estão vivas mostrando a morfologia típica da respectiva linha celular aderente. A fluorescência da proteína de interesse, aqui um receptor de superfície, é visível por toda a superfície. Células menos brilhantes são mais adequadas do que as mais brilhantes devido ao melhor contraste na FCS quando um baixo número de moléculas estão em foco.
   2. Ligue ambos os lasers no modo PIE e foque na membrana olhando para as contagens máximas por segundo.
      NOTA: A potência do laser pode precisar ser reduzida para as amostras de células (menos de 5 μW no objetivo). Isso depende dos fluoroforos usados e da configuração.
   3. Observe as curvas de correlação automática e cruzada do eGFP ou etiquetagem SNAP anexada ao β₂AR na pré-visualização on-line do software de coleta de dados e colete várias medidas curtas (~2 -10) com um tempo de aquisição entre 60 -180 s.
      NOTA: Não excite as células por muito tempo continuamente, pois os fluoroforos podem clarear. No entanto, dependerá do brilho de cada célula, quanto tempo as medidas podem ser, e quantas medidas no total podem ser realizadas.

2. Análise de dados

1. Exportação de dados
   1. Exporte as curvas de correlação, G(t_c),e taxas de contagem, CR, de todas as medidas.
   2. Tenha o cuidado de definir corretamente as janelas de tempo "prompt" e "delay" e use a opção "microtime gating" no software de correlação de dados.
      NOTA: No total, são necessárias três correlações diferentes: (1) correção automática do canal verde na janela de tempo imediata(ACF_gp),(2) correção automática dos canais vermelhos na janela de tempo de atraso(ACF_rd),e finalmente (3) a correlação cruzada do sinal do canal verde na janela de tempo imediata com o sinal do canal vermelho na janela de tempo de atraso(CCF_PIE). A exportação de dados é mostrada passo a passo para diferentes softwares na Nota Suplementar 3.
2. Medições de calibração
   1. Use as funções de autocorrelação das soluções fluoróforas verdes(ACF_gp) e vermelhas(ACF_rd)e encaixe-as em um modelo de difusão 3D com um termo de trigêmeo adicional, se necessário (eq. 1) para calibrar a forma e o tamanho do volume de detecção confocal para os dois canais de cor usados:
      eq. 1
      Aqui, b é a linha de base da curva, N o número de moléculas em foco, t_D o tempo de difusão (em ms), e s = z₀/w₀ o fator de forma do elemento de volume confocal. O piscar trigêmeo ou outra fotofísica é descrito por sua amplitude a_R e tempo de relaxamento t_R.
      NOTA: Todas as variáveis e símbolos utilizados dentro do protocolo estão listados na Tabela 1.
   2. Use os coeficientes de difusão conhecidos D para o padrão verde²⁶ e vermelho de calibração²⁷ e os fatores de forma obtidos são_verdes e _vermelhos para determinar as dimensões (largura w₀ e altura z₀) e volume V_eff do elemento de volume confocal (eq. 2a-c).
      eq. 2a
      eq. 2b
      eq. 2c
      NOTA: Os modelos para cálculo do parâmetro de calibração são fornecidos como arquivos complementares (S7).
   3. Calcule o crosstalk espectral α do sinal de fluorescência verde (coletado nos canais 0 e 2) nos canais de detecção vermelho (canal número 1 e 3) como uma razão dos sinais corrigidos por fundo (BG) (eq. 3).
      
      eq. 3
   4. Determine a excitação direta do fluoroforeiro aceitador δ pelo comprimento de onda de excitação do doador pela razão da taxa de contagem corrigida em segundo plano das medidas de calibração vermelha na janela de tempo "prompt" (excitação por laser verde) para a taxa de contagem corrigida por fundo na janela de tempo "delay" (excitação por laser vermelho) (eq. 4).
      
      eq. 4
   5. Calcule o brilho molecular B dos fluoroforos verdes e vermelhos (eq. 5a-b) com base nas taxas de contagem corrigidas por fundo e no número obtido de moléculas em foco, N, do ajuste de difusão 3D (eq. 1):
      eq. 5a
      eq. 5b
   6. Coloque tanto o_GP ACF quanto o ACF_rd, bem como o CCF_PIE do DNA de dupla rotulagem no modelo de difusão 3D (eq. 1). Mantenha os fatores de forma obtidos, _{s verde} e _vermelho,constante para ACF_gp e ACF_rd,respectivamente. O fator de forma para o CCF_PIE, s_PIE, geralmente está entre esses dois valores.
      NOTA: Em uma configuração ideal, tanto _{V eff},_verde e V_{eff, vermelho} teria o mesmo tamanho e se sobreporia perfeitamente.
   7. Determine a amplitude em tempo zero de correlação, G₀(t_c),com base nos valores encontrados do número aparente de moléculas em foco(N_verde, N_vermelho e N_PIE).
   8. Calcule a razão de amplitude r_GR e r_RG para uma amostra com co-difusão de fluoroforos verdes e vermelhos (eq. 6). Esteja ciente de que o N_PIE não reflete o número de moléculas duplamente rotuladas em foco, mas reflete apenas o 1/G₀(t_c).
      eq. 6
3. Experimentos com células vivas
   1. Para construtos de rótulo único, coloque as amostras de células em um modelo apropriado. Para o receptor de membrana mostrado, a difusão ocorre de forma bimodal com um curto e longo tempo de difusão. Além disso, a fotofísica e o piscar dos fluoroforos devem ser considerados:
      eq. 7
      Aqui, t_d1 e t_d2 são os dois tempos de difusão necessários, e um₁ é a fração do primeiro tempo de difusão.
      NOTA: Em contraste com as medidas de calibração, nas quais os corantes livres e os fios de DNA se difundem livremente em todas as direções, o receptor de membrana mostra apenas difusão 2D ao longo das membranas celulares. Essa diferença entre difusão 3D e 2D é refletida pelo termo de difusão modificada (compare eq. 1), onde t_D no caso 2D não depende do fator de forma do elemento volume confocal.
   2. Calcular a concentração c de proteínas rotuladas verdes ou vermelhas do respectivo N e V_eff utilizando matemática básica (eq. 8):
      eq. 8
      onde N_A = número de Avogadro
   3. Para o selo SNAP n-terminal e eGFP intracelular, ajuste as duas autocorrelações (ACF_gp e ACF_rd) da amostra de dupla rotulagem usando o mesmo modelo dos construtos de marca única para os ACFs (eq. 7) e o CCF_PIE usando um modelo de difusão bimodal (eq 9):
      eq. 9
      NOTA: Para uma descrição global do sistema, todas as três curvas devem estar em forma conjunta: O termo de difusão é idêntico para todas as três curvas e a única diferença é o termo de relaxamento para o CCF_PIE. Como a fotofísica de dois fluoroforos geralmente não está relacionada, nenhum termo de correlação é necessário. Esta ausência de termos de relaxamento resulta em um CCF_PIE plano em curtos períodos de correlação. No entanto, o crosstalk e a excitação direta do aceitador devido ao fluoróforo doador podem apresentar amplitudes falsas positivas e devem ser cuidadosamente verificados para o uso das medidas de calibração.
   4. Calcule a concentração c de proteínas rotuladas verdes ou vermelhas do respectivo _eff N e V utilizando a equação 8.
   5. Estimar a fração ou concentração, c_GR ou c_RG,de proteínas rotuladas verdes e vermelhas interativas das amostras de células utilizando os fatores de correção obtidos a partir das amostras de DNA, as razões de amplitude r_GR e r_RG da amostra celular e suas respectivas concentrações obtidas (eq. 10).
      eq. 10
   6. Para o selo SNAP terminal C e eGFP intracelular, ajuste as duas autocorrelações (ACF_gp e ACF_rd) da amostra FRET como as amostras de etiqueta única (equação 7) e o CCF_FRET a um modelo de difusão bimodal contendo um termo anti-correlação (equação 11)
      eq. 11
      onde a_f reflete a amplitude da anti-correlação total e um_R e t_R a respectiva amplitude e tempo de relaxamento.
      NOTA: No caso de alterações de fluorescência anti-correlacionada devido ao TRAS, pode-se exigir um ou vários termos anti-correlação (eq. 11), resultando em um "mergulho" de CCF_FRET em tempos de baixa correlação coincidindo com um aumento nas duas autocorrelações(ACF_gp e ACF_rd). No entanto, esteja ciente de que a fotofísica, como piscar trigêmeos, pode mascarar o termo anti-correlação, amortecendo a anti-correlação induzida pelo FRET. Uma análise conjunta complementada com métodos FCS filtrados pode ajudar a desmascarar o termo anti-correlação. Além disso, artefatos técnicos decorrentes de tempos mortos na contagem eletrônica na faixa de nanossegundos devem ser excluídos¹⁶. Um procedimento passo a passo mais detalhado sobre como realizar a análise no ChiSurf²⁸ e modelos para o cálculo do volume confocal ou brilho molecular são fornecidos no repositório do Github (https://github.com/HeinzeLab/JOVE-FCS) e como arquivos complementares(Nota Suplementar 4 e Nota Suplementar 6). Além disso, os scripts python para exportação em lote de dados adquiridos com o software Symphotime em formato .ptu podem ser encontrados lá.

Os resultados exemplares da calibração e das medições de células vivas são discutidos abaixo. Além disso, o efeito do FRET nas curvas de correlação cruzada é demonstrado com base em dados simulados próximos ao efeito da interação proteína-proteína aumentando a amplitude DO CCFPIE.

Exportação de dados FCS baseada em PIE
Nos experimentos pie, os dados são coletados no modo tempo resolvido (TTTR)29,30. A Figura 1B mostra os histogramas de tempo de chegada do fóton de uma medição pie de um fio de DNA de dupla rotulagem na configuração descrita(Nota Suplementar 1). A configuração tem quatro canais de detecção. A emissão de fluorescência é primeiramente dividida pela polarização nas direções "S" e "P" (referindo-se ao plano perpendicular e paralelo no qual o campo elétrico de uma onda de luz está oscilando). Em segundo lugar, cada direção de polarização é então dividida em dois canais de cores (verde, vermelho) antes da detecção, resultando em quatro canais (S-green, S-red, P-green, P-red). Na janela de tempo "prompt", o fluorohore verde fica animado, e o sinal é detectado nos canais verde e vermelho devido ao FRET. Na janela de tempo de atraso, apenas o fluorohore vermelho (no canal vermelho) é visível. Com base nos canais de detecção e nas janelas de tempo "prompt" versus "atrasadas", pelo menos cinco curvas de correlação diferentes (3 curvas de autocorrelação (ACFs) e 2 curvas de correlação cruzada (CCFs)) podem ser obtidas(Figura 1C-D): (1) sinal verde na janela de tempo imediata(GP ACF),(2) sinal vermelho na janela de tempo imediata (no caso de FRET, ACFrp), e (3) sinal vermelho na janela de tempo de atraso(ACFrd). Estes ACFs relatam a mobilidade proteica, fotofísica (por exemplo, piscar trigêmeos) e outras alterações de brilho correlacionadas pelo tempo nos fluoroforos (por exemplo, devido ao TRAS). (4) O CCFPIE de correlação cruzada baseado em PIE do sinal verde na janela de tempo imediata com o sinal vermelho na janela de tempo de atraso permite determinar a fração de co-difusão do fluorophore verde e vermelho16. (5) O CCFFRET de correlação cruzada baseado em FRET do verde com o sinal vermelho na janela de tempo imediata está relacionado a alterações de brilho induzidas pelo TRAS e anticorrelated nos sinais verde e vermelho31,32,33.

Figura 1: Excitação com pulso intercalada (PIE) fluorescência (cruz) espectroscopia de correlação (F(C)CS). (A) Em moléculas fluorescentes fluorescentes rotuladas fluorescentemente difusas livremente dentro e fora de um volume focal (limitado por difusão) moldado por um feixe de laser focado que induz fluorescência dentro deste volume minúsculo. As flutuações de intensidade resultantes das moléculas que entram e saem do volume estão correlacionadas e fornecem informações sobre a mobilidade das moléculas. (B) No PIE, duas linhas laser diferentes ("prompt" e "delay") são usadas para excitar a amostra rotulada com dois fluoroforos diferentes ("verde" e "vermelho"). A diferença de tempo entre ambos os pulsos de excitação é adaptada às vidas de fluorescência dos respectivos fluoroforos de modo que um tenha se deteriorado antes que o outro esteja animado. Na amostra de dupla rotulagem mostrada, ambos os fluoroforos estão suficientemente perto de serem submetidos à Transferência de Energia de Ressonância Förster (FRET) do fluoróforo de doador "verde" para o fluoróforo "vermelho". Assim, a emissão de fluorescência vermelha pode ser detectada na janela temporal "imediata" após a excitação do doador verde. Na configuração utilizada (Nota Suplementar 2),são utilizados dois detectores para cada cor, um orientado paralelo à orientação do feixe de excitação (denotado "p") e o segundo perpendicular (denotado "s"). (C) Três diferentes funções de autocorrelação podem ser determinadas em um experimento PIE: Correlação dos sinais do canal verde i na janela de tempo imediata(ACFgp),ii) sinais de canal vermelho na janela de tempo prompt(ACFrp) e iii) sinais de canal vermelho na janela de tempo de atraso(ACFrd). (D) Duas funções diferentes de correlação cruzada podem ser determinadas: iv) A "PIE" de correlação cruzada(CCFPIE)com sinais de canal verde na janela de tempo imediata correlacionada com os sinais de canal vermelho na janela de atraso, onde a amplitude desta curva está relacionada à co-difusão de fluoroforos; e v) a "TRAT" de correlação cruzada(CCFFRET)com os sinais do canal verde na janela de tempo imediata correlacionada com os sinais do canal vermelho na mesma janela de solicitação; aqui a forma desta curva às vezes mais rápida do que a difusão está relacionada com as mudanças de intensidade induzidas pelo FRET. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Calibração
Figura 2A-B mostra uma medição de calibração dos fluoroforos verdes e vermelhos, respectivamente. Com base em um ajuste com eq. 1 e o conhecido coeficiente de difusão Dverde26 e Dvermelho27 a forma(z0 e w0) e tamanho(Veff) do volume de detecção são calculados utilizando-se eq. 2a-c. Os resultados do ajuste do GP ACF do fluoróforo verde e acfrd do fluorohore vermelho são resumidos na Figura 2C. Ambos os fluoroforos apresentam uma constante de tempo de relaxamento adicional de 8,6 μs (18%) e 36 μs (15%), respectivamente. O brilho molecular (eq. 5a-b) do fluoróforo verde e vermelho equivale a 12,5 kHz por molécula e 2,7 kHz por molécula, respectivamente.

Para uma estimativa confiável do tamanho e forma do volume confocal, bem como do brilho molecular, recomenda-se realizar medições de 3 a 5 por experimentos de calibração e um ajuste conjunto (ou global) de todas as repetições.

O crosstalk α(Figura 2D, eq. 3) e a excitação direta do aceitador pelo laser verde δ(Figura 2E, eq. 4) para este par fluoróforo estão em ~15% e ~ 38%, respectivamente.

Figura 2: Medidas de calibração de padrão de calibração verde e vermelho livremente difusante. (A-B) Representação 60 s medição de um verde de 2 nM(A) e uma medição padrão de calibração de 10 nM(B)instalada no modelo de difusão 3D, incluindo um tempo adicional de relaxamento(eq. 1). A tabela no painel (C) mostra os resultados do ajuste e o parâmetro derivado com base em eq. 2a-c e eq. 5a-b. *Os coeficientes de difusão foram retirados da literatura26,27. (D) Determinação do α de crosstalk do sinal verde para os canais vermelhos (eq. 3). O espectro de excitação do padrão verde é mostrado no ciano, o espectro de emissões em verde. As linhas laser de excitação a 485 nm (azul) e 561 nm (laranja) são mostradas como linhas tracejadas. As caixas verdes e magenta transparentes mostram a faixa de emissão coletada(Nota Complementar 2). (E) Determinação da excitação direta δ do fluorohore vermelho pelo laser de 485 nm (eq. 4). O código de cor é idêntico ao(D),luz e laranja escuro mostram o espectro de excitação e emissão do padrão vermelho, respectivamente. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Para determinar e calibrar a sobreposição do volume de excitação verde e vermelho, é utilizado um duplo fio de DNA(Figura 3A),conforme descrito acima. Aqui, os fluoroforos são espaçados 40 bp separados de tal forma que nenhum TRAF pode ocorrer entre os fluoroforos verdes e vermelhos ligados às extremidades dos fios duplos de DNA. A Figura 3B mostra as autocorrelações de fluoroforos em verde(ACFgp) e magenta(ACFrd) e a correlação PIE-cross, CCFPIE, em ciano. Observe que para CCFPIE, o sinal nos canais verdes na janela de tempo imediato está correlacionado com o sinal nos canais vermelhos na janela de tempo de atraso16.

Aqui, um coeficiente de difusão médio para o fio de DNA de DNA D = 77 μm²/s é obtido. Mais detalhes sobre o cálculo podem ser encontrados no protocolo passo a passo, Nota Complementar 4. Este valor é obtido inserindo o tamanho calibrado de volumes de detecção verde e vermelho(Figura 2) e os respectivos tempos de difusão do GP ACF e ACFrd da cadeia de DNA (Figura 3C) na equação 2a. Em seguida, utilizando os valores de correção obtidos rGR e rRG e utilizando eq. 6 posteriormente, a quantidade de co-difusão, ou seja, moléculas duplamente rotuladas (ou complexos proteicos em caso de co-transfecção de duas proteínas diferentes) pode ser determinada a partir das amostras de células.

Figura 3: Calibração do volume de sobreposição verde-vermelho usando uma amostra de DNA. (A) O fio de DNA usado para calibração carrega um fluorohore de calibração verde e vermelho, com uma distância de 40 bp no meio. A distância interdye deve ser suficientemente grande para excluir o FRET entre os fluoroforos. (B) Representante 60 s medição de uma solução de DNA de 10 nM. Correções automáticas de fluoroforos em verde(ACFgp, padrão verde) e magenta(ACFrd, padrão vermelho) e da PIE-crosscorrelation, CCFPIE, em azul. A tabela no painel (C) mostra os resultados de ajuste com base no modelo de difusão 3D, incluindo um termo adicional de relaxamento(eq. 1) e o coeficiente de difusão do parâmetro derivado de DNA, DDNA (eq. 2a),o tamanho e a forma do volume de sobreposição(eq. 2a-c) e as razões de correção rGR e rRG (eq. 6. ). Observe que os valores para o volume de detecção verde e vermelho (rotulados com *) foram retirados do ajuste dos fluoroforos individuais mostrados na Figura 2. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Experimentos com células vivas
Na seção seguinte, é apresentada a análise de experimentos com células vivas para diferentes β2construções ar. Como β2AR é uma proteína de membrana, sua difusão é em grande parte limitada a uma difusão bidimensional(Figura 4A) ao longo da membrana celular (exceto para processos de transporte ou reciclagem para ou a partir da membrana) 2. Com a restrição à difusão 2D o fator de forma s = z0/w0 no eq. 1 torna-se obsoleto resultando em um modelo de difusão simplificada (eq. 9).

Construções de rótulo único: β2AR-IL3-eGFP e NT-SNAP-β2AR
A Figura 4 mostra medições exemplares da construção de um único rótulo β2AR-IL3-eGFP(Figura 4B),onde o eGFP é inserido no loop intracelular 3, e a construção NT-SNAP-β2AR(Figura 4C),onde a tag SNAP é conjugada ao termo N de β2AR. A tag SNAP é rotulada com um substrato de superfície SNAP impermeável por membrana. As curvas representativas mostram a média de 4-6 medições repetidas com tempos de aquisição de 120 a 200 s cada. As respectivas autocorrelações ACFgp e ACFrd do eGFP e snap são instaladas em um modelo de difusão bimodal, bidimensional (eq. 9). Em termos de dinâmica rápida, o eGFP mostra apenas o trigêmeo esperado piscando em tR1 ~ 9 μs enquanto o sinal SNAP requer duas vezes de relaxamento, uma no tempo típico de piscar t R1 ~ 5 μs e uma segunda em tR2 ~ 180 μs.

O brilho molecular dos fluoroforos em células vivas é de 0,8 KHz (eGFP) e 1,7 kHz (SNAP) por molécula sob as condições de excitação dadas (eqs. 5a-b). A concentração dos construtos de AR rotulados β2incorporados na membrana celular deve estar na faixa nano-molar e pode ser determinada pelo número médio de moléculas (eq. 9, Figura 4C) e o tamanho do respectivo volume confocal para o canal verde e vermelho(Figura 2) utilizando eq. 8.

Figura 4: Medição representativa de construtos de etiqueta única. (A) Neste estudo, o receptor de membrana β2AR foi utilizado como exemplo. Em contraste com os fluoroforos e o fio de DNA usado para calibração, que poderia flutuar livremente através do volume de detecção, as proteínas da membrana se difundem principalmente lateralmente ao longo da membrana, descrita como difusão bidimensional. (B, D) ACFgp e ACFrd das construções de etiqueta única β2AR-IL3-eGFP(B) e NT-SNAP-β2AR(D). Mostra-se a média de 4-6 medidas cada coletadas para 120 - 200 s. A tabela no painel (C) mostra os resultados adequados dos dados para o modelo de difusão bimodal bidimensional, incluindo termos adicionais de relaxamento(eq. 7). Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Construção de dupla rotulagem: NT-SNAP-β2AR-IL3-eGFP
Na construção de dupla rotulagem NT-SNAP-β2AR-IL3-eGFP (curto NT-SNAP), o eGFP é inserido no loop intracelular 3 e, a tag SNAP conjugada ao n-terminus de β2AR(Figura 5A). Nesta configuração, o eGFP está no lado interno da membrana e o SNAP no lado externo com distâncias muito grandes para FRET. Em um caso ideal, esta construção mostraria 100% de co-difusão do fluorophore verde e vermelho, e nenhum sinal FRET. A Figura 5B-D mostra duas medidas do NT-SNAP em duas células em dois dias de medição diferentes. A montagem do GP ACF e acfrd da medida "melhor" mostrada na Figura 5B com eq. 7 e o CCFPIE com eq. 9, revela 50-60 moléculas em foco para o GP ACF e ACFrd,enquanto napp, assim 1/G0(tc) ~ 114 para o CCFPIE (Figura 5C ). A concentração de receptores rotulados está na faixa de ~100 nM como determinada com eq. 8. Para determinar a concentração média de moléculas duplamente rotuladas, primeiro, calcula-se a razão de G0(tc) (representada por 1/N(app)) do CCFPIE para ACFgp e ACFrd,respectivamente, (eq. 6). Em seguida, esses valores, rGRcell= 0,43 e rRGcell = 0,53 são comparados aos valores obtidos da medição de DNA(rGR,DNA= 0,51 e rRG,DNA = 0,79 neste dia de medição). Utilizando a regra de proporções, um r GRcell= 0,43 do GP ACF do sinal eGFP reflete a uma fração de co-difusão (rGRcell/rGR,DNA) de 0,84, onde para o outro caso de ACFrd do sinal do substrato SNAP, este valor é de 0,67. A concentração média da construção NT-SNAP de dupla rotulagem pode finalmente ser calculada com base no eq. 10. Em contraste, na medição mostrada na Figura 5D de um dia diferente, a concentração de receptores é bastante baixa e os dados muito barulhentos de modo que a faixa de ajuste é limitada até ~ 10 μs. Além disso, apenas uma baixa quantidade de co-difusão é observada (15 - 26%).

Figura 5: Nt-SNAP-β2construção AR-IL3-eGFP. (A) Na construção dupla rotulada, o eGFP é inserido no loop intracelular 3 e na tag SNAP anexada ao termo N de β2AR (NT-SNAP). (B, D) ACFgp, ACFrd e CCFPIE de duas medidas da construção de dupla rotulagem. Os dados são adequados a um modelo de difusão bimodal bidimensional(eq. 9, CCFPIE) e incluindo termos adicionais de relaxamento(eq. 7, ACFgp e ACFrd). A tabela no painel (C) mostra os resultados do ajuste e a concentração de parâmetros derivados(eq. 8),a razão da amplitude de correlação em tempo de correlação zero (G0(tc)) e a fração de moléculas de co-difusão(eq. 10). Observe que as medidas foram adquiridas em dias diferentes, fator ligeiramente diferente para a correção da amplitude (B: rGR,DNA = 0,51 e rRG,DNA = 0,79; D: rGR,DNA = 0,51 e rRG, DNA = 0,56). Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Construção de dupla rotulagem submetida a FRET: β2AR-IL3-eGFP-CT-SNAP
Na construção de dupla rotulagem β2AR-IL3-eGFP-CT-SNAP(Figura 6A),o eGFP é inserido no loop intracelular 3 idêntico ao NT-SNAP-β2AR-IL3-eGFP construído com a tag SNAP anexada ao termo C. Aqui, ambos os rótulos estão do mesmo lado da membrana plasmática das células, de modo que os fluoroforos estão próximos para que o FRET ocorra conforme indicado pela vida útil saciada do eGFP(Nota Suplementar 5). Considerando a flexibilidade de regiões proteicas relativamente não estruturadas como o C-terminus34 e pelo menos duas conformações proteicas diferentes de GPCRs35,"alto FRET" (HF) ou "baixo FRET" (LF), mudanças dinâmicas na eficiência do FRET devido às alterações de distância eGFP-SNAP poderiam ser observadas e identificadas por um termo de anticorrelação na CCFFRET (curva laranja na Figura 6B ). As flutuações do FRET têm se mostrado anticorrelass, pois o receptor só pode estar em um estado de cada vez, seja HF ou LF. O ajuste articular (ou global) de todas as cinco curvas de correlação(Figura 6B) revela ~70% de moléculas de difusão lenta a ~100 ms, enquanto o resto se difunde com ~ 1 ms. Todas as autocorrelações e CCFFRET mostram termos de relaxamento a 37 μs e 3 μs; essas correlações dominadas pelo sinal vermelho(ACFrp, ACFrd e CCFFRET) mostram um componente lento adicional ~ 50 ms(Figura 6C).

Alterações induzidas pelo FRET no CCF FRET em diferentes condições (Figura 6D) são demonstradas por uma série de simulações de um sistema de dois estados com um tempo de flutuação de 70 μs entre estados LF e HF. Ao mudar do LF para o estado HF, alterações no sinal anticorrelacionado são observadas na janela de tempo imediata: O sinal verde diminui e o sinal vermelho aumenta (vice-versa para a comutação HF -> LF). Se a comutação HF-LF ocorrer em escalas de tempo mais rápidas do que o tempo de difusão, ou seja, durante o tempo de residência da molécula no foco, a taxa pode ser derivada da anticorrelação no CCFFRET6,31,36. Observe que processos dinâmicos mais lentos do que o tempo de difusão não podem ser observados no FCS.

Nesta demonstração, foram assumidos dois cenários diferentes de FRET, mostrando uma mudança moderada ou máxima na eficiência do FRET entre os dois estados. As simulações foram realizadas utilizando-se o Burbulator37 e consideram ausência ou presença de tríplice piscada e aumento da quantidade de conversa cruzada de doadores nos canais vermelhos. O termo de difusão foi modelado como uma distribuição bimodal com 30% de moléculas de difusão rápida em tD1 = 1 ms e o resto das moléculas difundindo lentamente com tD2 = 100 ms. No total, 107 fótons foram simulados em um volume em forma de gaussiano 3D com w0 = 0,5 μm e z0 = 1,5 μm, um tamanho de caixa de 20, e NFCS = 0,01.

A Figura 6E-F mostra os resultados da simulação para o CCFDE correlação transversal induzido pelo FRET para contraste moderado(Figura 6E) e contraste DE FRET máximo(Figura 6F) na ausência (linhas sólidas) e presença de piscar trigêmeos (linhas tracejadas). A anti-correlação induzida pelo FRET pode ser facilmente vista na Figura 6F. O efeito "amortecedor" ao adicionar um estado trigêmeo adicional reduz a amplitude de correlação (Figura 6E-F)38,39.

Figura 6: Simulação de amostra de dupla rotulagem mostrando FRET dinâmico. (A) Dupla rotulada β2AR com um eGFP inserido no loop intracelular 3 e uma tag SNAP terminal C. Ambos os fluoroforos estão perto o suficiente para se submeterem ao FRET e mostrarem mudanças na eficiência do FRET se o receptor sofrer dinâmica proteica. (B) Autocorrelação (ACFgp, ACFrp e ACFrd, ajuste com eq. 7) e curvas de correlação cruzada(CCFFRET (eq. 7) e CCFPIE (eq. 9)) de uma medição de exemplo. Tabela no painel(C) mostra os resultados de ajuste. (D-F) Para mostrar a influência do parâmetro experimental no esperado termo anticorrelação induzido pelo FRET, foram realizadas 12 simulações, nas quais foram modeladas a mudança na eficiência do FRET (pequena ou grande), diferente quantidade de crosstalk doador para os canais de aceitação (0%, 1% ou 10%) e a ausência e presença de piscar trigêmeos. A fração de equilíbrio de ambos os estados FRET foi assumida para 50:50 e suas taxas de câmbio ajustaram de tal forma que o tempo de relaxamento obtido tR = 70 μs. Mais detalhes sobre as simulações são ver no texto. (E) CCFFRET dos resultados da simulação com contraste fret moderado e na ausência de crosstalk (laranja escura), 1% crosstalk (laranja) e 10% crosstalk (laranja leve). Linhas sólidas mostram resultados na ausência de trigêmeos, linhas tracejadas na presença de trigêmeos. (F) CCFFRET dos resultados da simulação com contraste DESUcional máximo. O código de cor é idêntico ao(E). Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

No entanto, na simulação mais semelhante às condições experimentais (α = 10%, 15% tríplice piscando e contraste moderado de FRET, linha amarela tracejada na Figura 6E), o termo anticorrelação é quase diminuído. A Figura 7 mostra o resultado da análise desses dados simulados usando as informações codificadas nos histogramas de tempo de chegada do fóton (ou seja, a vida útil da fluorescência) por meio da Fluorescence Lifetime Correlation Spectroscopy (FLCS)17,19 ou FCS filtrada por espécies (fFCS)18. Aqui, as vidas de fluorescência das espécies conhecidas de HF e LF (Figura 7A) são usadas para gerar pesos ou "filtros"(Figura 7B) que são aplicados durante o procedimento de correlação. Nas curvas de correlação entre espécies e transcorresstos obtidas(Figura 7C-D)a anticorrelação pode ser claramente observada.

Figura 7: O FCS filtrado por toda a vida pode ajudar a descobrir as flutuações baseadas na dinâmica da proteína na eficiência do FRET em amostras com alto crosstalk, piscar triplo significativo ou outras propriedades fotofísicas ou experimentais mascarando a anticorrelação induzida pelo FRET no CCFFRET. Aqui, a abordagem é mostrada exemplar para os dados mostrados na Figura 6E para a simulação contendo 10% de crosstalk e 5% de piscar trigêmeos. (A) Padrões de decadência de fluorescência normalizadas para as duas espécies FRET (verde claro e escuro para fret alto e baixo, respectivamente) e o IRF (cinza). O padrão para o canal de detecção paralela é mostrado em linhas sólidas, linhas tracejadas para o canal de detecção perpendicular. (B) A função de ponderação ou "filtro" foi gerada com base nos padrões mostrados em (A),o código de cor é idêntico ao(A). Por favor, note que apenas o sinal nos canais de detecção verde, e, portanto, a saciação de doadores induzidos pelo FRET, é considerado aqui. (C) Quatro correlações diferentes de espécies-seletivas são obtidas: autocorrelações de espécies do baixo estado FRET(sACFLF-LF, verde escuro) e o alto estado FRET(sACFHF-HF, verde claro), e as duas correções cruzadas entre o baixo FRET para o estado alto FRET(sCCFLF-HF, laranja escura) e vice-versa(sCCFHF-LF , laranja). O sCCF mostra claramente a anticorrelação na faixa de μs. Linhas pretas tracejadas mostram os ataques. sACF foram aptos com eq. 9 e sCCF com eq. 11. Tabela no painel(D)mostra os resultados de ajuste. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Amplitude CCFPIE para estudar Interação Proteína-Proteína (PPI)
Finalmente, um caso de uso comum para FCS à base de PIE em células vivas é estudar a interação entre duas proteínas diferentes. Aqui, o parâmetro de leitura é a amplitude do CCFPIE, ou mais precisamente a razão das amplitudes de autocorrelação ACFgp e ACFrd para a amplitude do CCFPIE. Para mostrar o efeito do aumento da co-difusão no CCFPIE,foram realizadas simulações baseadas nos dois construtos de rótulo único, β2AR-IL3-eGFP e NT-SNAP-β2AR(Figura 8A). A Figura 8B mostra como a amplitude do CCFPIE aumenta quando a fração de moléculas de co-difusão muda de 0% para 100%. Observe que um crosstalk de 1% de sinal verde nos canais vermelhos na janela de tempo de atraso foi adicionado com os componentes de difusão de outra forma modelados como mostrado acima.

Figura 8: O CCFPIE pode ser usado para estudar a interação de duas proteínas. (A) Aqui, foi simulado um estudo de co-transfecção de β2AR-IL3-eGFP com NT-SNAP-β2AR (portando um rótulo SNAP "vermelho"). (B) Para uma quantidade crescente de moléculas de co-difusão (0% (azul escuro) -> 100% (azul claro)) a amplitude G(tc)aumenta. O termo de difusão foi novamente modelado como uma distribuição bimodal com 30% de moléculas de difusão rápida em tD1 = 1 ms e o resto das moléculas difundindo lentamente com tD2 = 100 ms. Além disso, 1% de crosstalk de sinal verde na janela de tempo de atraso vermelho foi adicionado. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Tabela 1: Lista de variáveis e abreviaturas. Para o uso de símbolos e definição em experimentos de fluorescência e FRET, recomenda-se as diretrizes da comunidade FRET40.

ARQUIVOS COMPLEMENTARES:

SuppNote1_Coverslip limpeza.docx Clique aqui para baixar este Arquivo.

SuppNote2_Confocal Configuração.docx Clique aqui para baixar este Arquivo.

SuppNote3_Data exportar.docx Clique aqui para baixar este Arquivo.

SuppNote4_FCCS análise de calibração usando ChiSurf.docx Clique aqui para baixar este Arquivo.

SuppNote5_Fluorescence histogramas vitalícios.docx Clique aqui para baixar este Arquivo.

S6_Scripts.zip Clique aqui para baixar este Arquivo.

S7_Excel_templates.zip Clique aqui para baixar este Arquivo.

Os autores não têm conflitos para declarar.