Summary
Ce protocole décrit la procédure de dissection, l’état de culture et l’imagerie en direct d’un système d’explantation antenne-cerveau pour l’étude de l’assemblage du circuit olfactif.
Abstract
Les neurones sont précisément interconnectés pour former des circuits essentiels au bon fonctionnement du cerveau. Le système olfactif de la drosophile fournit un excellent modèle pour étudier ce processus puisque 50 types de neurones récepteurs olfactifs (ORN) des antennes et des palpes maxillaires projettent leurs axones à 50 glomérules identifiables dans le lobe de l’antenne et forment des connexions synaptiques avec les dendrites de 50 types de neurones de projection de second ordre (NP). Les études précédentes se sont principalement concentrées sur l’identification de molécules importantes qui régulent le ciblage précis dans le circuit olfactif à l’aide de tissus fixes. Ici, un système d’explantation antenne-cerveau qui récapitule les étapes clés du développement de l’assemblage du circuit olfactif en culture est décrit. En disséquant la cuticule externe et en nettoyant les corps gras opaques recouvrant le cerveau nymphal en développement, des images de haute qualité de neurones uniques provenant de cerveaux vivants peuvent être collectées à l’aide de la microscopie à deux photons. Cela permet l’imagerie en accéléré d’un seul axone ORN ciblant à partir de tissus vivants. Cette approche aidera à révéler les contextes biologiques cellulaires importants et les fonctions importantes de gènes importants précédemment identifiés et à identifier les mécanismes qui sous-tendent le processus dynamique d’assemblage de circuits.
Introduction
Les neurones sont précisément interconnectés pour former des circuits essentiels au bon fonctionnement du cerveau. Depuis plus de 100 ans, les neuroscientifiques tentent de comprendre comment les neurites s’étendent vers leurs cibles intermédiaires et finales avec une extrême précision. En conséquence, ils ont identifié des gènes importants qui codent des signaux de guidage pour le développement de processus neuronaux1. Le système olfactif de la drosophile fournit un excellent modèle pour étudier ce processus puisque les neurones récepteurs olfactifs (ORN, les neurones sensoriels primaires) projettent à 50 glomérules identifiables avec une taille, une forme et une position relative stéréotypées, où ils forment des connexions synaptiques avec des dendrites à partir de 50 types de neurones de projection (NP) de second ordre, chacun envoyant des dendrites à l’un des 50 glomérules2 (Figure 1A ). Par conséquent, il est relativement facile d’identifier des phénotypes mutants à résolution synaptique (glomérulaire) dans le système olfactif de la mouche. Cela a conduit à la découverte de gènes importants qui régulent l’assemblage du circuitolfactif 3.
L’assemblage du circuit olfactif de la mouche repose sur des processus de développement coordonnés temporellement et spatialement3. Les ORN et les NP acquièrent des destins cellulaires distincts, ce qui met en place le programme pour leurs spécificités de câblage. Ensuite, les dendrites PN prémodèlent le lobe de l’antenne (Figure 1B). Les axones des ORN font ensuite le tour du lobe de l’antenne ipsilatérale et traversent la ligne médiane du cerveau pour atteindre le lobe de l’antenne controlatérale. Par la suite, les axones ORN envahissent les lobes antennes ipsi- et controlatéral et forment des synapses avec des dendrites de leurs PN partenaires dans des glomérules spécifiques. Ce modèle grossier pour l’assemblage de circuits olfactifs a été proposé sur la base de la caractérisation d’échantillons fixes à partir de points temporels intermédiaires au cours du développement. La mauvaise résolution temporelle et l’incapacité à suivre les mêmes processus neuronaux tout au long du développement à partir de tissus fixes limitent la compréhension mécaniste du processus d’assemblage de circuits.
Il est techniquement difficile de vivre des processus ORN et PN d’image in vivo, car le processus de câblage se produit dans la première moitié du stade nymphal lorsque le lobe de l’antenne est entouré d’un corps gras opaque à l’intérieur du boîtier nymphal. Il est donc impossible d’imager directement le circuit olfactif en développement à partir de pupes intactes. Les tissus disséqués cultivés ex vivo peuvent contourner l’opacité tissulaire et ont été utilisés avec succès pour étudier le développement neuronal 4,5,6. Le défi d’utiliser une stratégie de culture explant ex vivo similaire pour étudier le câblage neuronal dans le cerveau nymphal est de savoir s’il récapitule le ciblage précis des neurones dans une condition de culture. Sur la base d’une condition de culture ex vivo précédemment rapportée pour le complexe œil-cerveau de la mouche7, une explante qui contient l’ensemble du cerveau nymphal, les antennes et les nerfs antennenaires de connexion intacts a été récemment développée, qui conserve un ciblage précis du circuit olfactif et peut être soumise à une imagerie en direct basée sur la microscopie à deux photons jusqu’à 24 h à la fréquence de toutes les 20 min8 . Ici, un protocole détaillé de la culture et de l’imagerie des explants est décrit. Le système explant fournit une méthode puissante pour étudier l’assemblage du circuit olfactif et potentiellement d’autres circuits dans le cerveau central.
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Protocol
1. Préparation des réactifs
REMARQUE: Toutes les étapes de ce protocole sont effectuées à température ambiante (20-25 ° C), sauf indication contraire.
- Pour préparer la boîte de culture à l’immobilisation de l’explante lors de l’imagerie en accéléré, posez le Sylgard de 0,5 cm d’épaisseur (mélangez soigneusement deux composants liquides au rapport 10:1 avant utilisation) sur la surface inférieure d’une boîte de Petri de 60 mm x 15 mm et laissez-la durcir pendant 48 h à température ambiante (Figure 2A, appelée plaque de Sylgard dans le texte suivant).
- Pour préparer les microbroches à l’immobilisation de l’explantation sur cette plaque, utilisez une paire de pinces pour coller plusieurs microbroches sur une bande avec les extrémités tranchantes alignées d’un côté (Figure 2B). Utilisez une paire de ciseaux pour couper ~2 mm des extrémités pointues des micro-broches (Figure 2B'). Utilisez des pinces pour maintenir les micro-broches coupées et insérez dans la couche Sylgard une plaque Sylgard préfabriquée (Figure 2C). Deux micro-broches sont utilisées pour immobiliser une explantation.
- Utilisez une brosse pour recueillir les nymphes blanches, qui forment du puparium en 1 h, de hsFLP, pebbled-GAL4/+; UAS-FRT100-stop-FRT 100-mCD8-GFP 8 génotype et transférez-les dans de nouveaux flacons. Choc thermique au bain-marie à 37 °C pendant 40 min pour induire des clones ORN clairsemés de types aléatoires. Après un choc thermique, mettre les flacons à 25 °C pendant 30 h, ce qui donne des nymphes vieillies à 30 h après la formation du puparium (APF).
- Pour préparer le milieu de culture pour l’explantation, ajouter 5 mL de pénicilline-streptomycine (10 000 U/mL) à 500 mL de milieu drosophila de Schneider. Filtrer le milieu et faire des aliquotes de 45 mL dans des tubes coniques de 50 mL. Le milieu peut être conservé à 4 °C pendant 1 à 2 mois.
- Le jour de l’imagerie, prélever un tube de 45 mL de milieu drosophila de Schneider et ajouter 5 mL de sérum fœtal bovin (10 % v/v), 125 μL de solution mère d’insuline humaine de 4 mg/mL (concentration finale de 10 μg/mL), 50 μL de solution mère de 20-hydroxyecdysone de 1 mg/mL dissoute dans de l’éthanol (concentration finale de 1 μg/mL). Bien mélanger et transférer 15 mL de milieu plein dans un nouveau tube conique de 50 mL. Le reste du milieu complet peut être conservé à 4 °C pendant une semaine. Le sérum fœtal bovin, la solution mère d’insuline humaine et la solution mère de 20-hydroxyecdysone sont alicités et conservés à -20 °C.
- Oxygéner le milieu plein de 15 mL en pompant des bulles d’oxygène d’une bouteille d’oxygène sous la surface du liquide à travers une pointe de pipette stérile de 5 mL à raison d’une bulle / s pendant 20-30 min. Utilisez un film de paraffine pour couvrir l’ouverture du tube pendant ce processus.
- Stériliser la surface du puits de dissection et la plaque Sylgard (avec des micro-broches insérées sur la couche Sylgard, préparées par étapes A1 et A2) avec 70% d’éthanol. Laissez-les sécher avant utilisation.
2. Dissection explant
- Utilisez une brosse pour transférer les pupes APF (30 h après la formation du puparium) sur un mouchoir en papier et séchez la surface externe des nymphes pendant 5 min.
- Mettez un morceau de ruban adhésif double face sur une lame de verre. Fixez soigneusement les pupes séchées sur la surface collante du ruban adhésif avec la face dorsale tournée vers le haut. Appuyez doucement sur les nymphes à l’aide d’une brosse pour aider la face ventrale des nymphes à bien se fixer au ruban adhésif (Figure 3A). N’endommagez pas la nymphe.
- Utilisez une pince pour enlever le boîtier nymphal brun recouvrant la face dorsale de la tête (Figure 3A,B). Insérez une pointe pointue de la pince entre le boîtier de la nymphe brune et la nymphe du côté latéral et cassez soigneusement la tige de la nymphe brune à travers une ligne jusqu’à l’extrémité postérieure de la nymphe (Figure 3B, C). Ouvrez le boîtier nymphal brun. Utilisez une paire de pinces pour tenir doucement la nymphe et transférez-la au puits de dissection avec 1 mL de milieu plein oxygéné. Immergez la nymphe flottante sur la surface moyenne pour l’aider à couler au fond du puits (Figure 3D).
REMARQUE: N’insérez pas la pointe de la pince trop profondément à l’intérieur de l’étui à nymphe brune pour éviter de blesser la nymphe avec la pince. - Pour disséquer l’explantation antenne-cerveau de la nymphe, utilisez une pince pour tenir doucement la nymphe d’une main et utilisez une paire de microcissives pour couper un petit trou du côté postérieur de la nymphe de l’autre main (Figure 3E). Ce petit trou libère la haute pression à l’intérieur de la nymphe.
- Coupez à travers la ligne médiane ventrale de la nymphe du trou jusqu’au cou (la structure étroite qui relie la tête et le thorax) avec les microcisseurs (Figure 3F). Ensuite, coupez à travers la circonférence du cou pour détacher la tête du corps de la nymphe (Figure 3G). Retirez le corps et placez-le dans un puits différent.
REMARQUE: Ne coupez pas le cou directement du côté dorsal / ventral de la nymphe, ce qui peut presser le cerveau. - Coupez la cuticule transparente qui recouvre la face dorsale du cerveau (Figure 3H). Cela exposera le corps gras sur le dessus du cerveau. Gardez une cuticule à laquelle la rétine et les antennes s’attachent. Répétez la même procédure sur le côté ventral du cerveau.
REMARQUE: N’insérez pas la lame des ciseaux trop profondément sous la cuticule, car cela provoquerait une coupure des nerfs antennes reliant les antennes et le cerveau (Figure 3H'). - Utilisez une pipette P10 pour laver doucement le corps gras qui recouvre le cerveau et les antennes en pipetachant le milieu vers les régions ouvertes des côtés dorsal et ventral de la tête (Figure 3I).
REMARQUE: Soyez très doux lorsque vous pipetez le milieu car le cerveau peut facilement être détaché de la cuticule. Assurez-vous que tout le corps gras est enlevé au cours de cette étape. Le développement arrêté des axones ORN a été observé lorsque le corps gras n’était pas bien nettoyé, probablement en raison d’un mauvais accès à l’oxygène du milieu. - Pour étudier l’interaction des axones ORN bilatéraux ou des axones ORN avec le ciblage de la dendrite PN, couper un ou deux nerfs antennes avec les microscisseurs au cours de cette étape8 (Figure 3J). Placez soigneusement les lames des ciseaux entre la cuticule et le cerveau et coupez les nerfs antennes intéressés.
- Pour transférer l’explante disséquée dans la plaque de Sylgard, placez une gouttelette de milieu plein oxygéné (~200 μL) sur la surface de Sylgard. Enduisez la surface interne d’une pointe de pipette de 200 μL de large avec le corps gras du tronc disséqué (étape 1.6) en pipetant le corps gras plusieurs fois, ce qui empêche les explants de coller la pointe de la pipette pendant le transfert. Ensuite, utilisez cette pointe de pipette à pointe large pour transférer l’explante du puits de dissection vers la gouttelette moyenne sur la plaque de culture (Figure 3K).
- Utilisez une pince pour épingler l’explantation sur la couche de Sylgard dans les deux lobes optiques (Figure 3L). Positionnez délicatement la plaque Sylgard sur la station d’imagerie et immobilisez la plaque avec des bandes. Ajouter lentement 10 mL de milieu plein oxygéné à la plaque Sylgard à l’aide de la pipette P1000.
REMARQUE: Évitez de perturber l’explantation lors de l’ajout du milieu à la plaque de Sylgard.
3. Imagerie en direct basée sur la microscopie à deux photons
- Pour effectuer une imagerie time-lapse, utilisez un microscope à deux photons, un laser Ti:Sapphire, un objectif d’immersion dans l’eau 20x (1.0 NA) et un logiciel d’imagerie. Utilisez la longueur d’onde d’excitation à 920 nm pour l’imagerie des protéines GFP. Réglez le temps de séjour des pixels à 10 μs.
- Ajustez la position de la station d’imagerie de sorte que les explants soient à peu près sous l’objectif. Utilisez 70 % d’éthanol pour stériliser la lentille avant l’imagerie. Abaissez lentement l’objectif sous le milieu proche des explants. Vérifiez s’il y a une bulle sur l’objectif de l’objectif.
- Si c’est le cas, soulevez l’objectif au-dessus du support et répétez-le jusqu’à ce que la bulle ait disparu. Trouvez les explants à l’aide de l’oculaire et centrez une explantation dans le champ.
- Pour garantir une explantation avec quelques ORN peu étiquetés pour l’imagerie en accéléré, disséquez ~10 explants à chaque fois et alignez-les sur l’axe y sur la plaque de culture. Examinez toutes les explantes en déplaçant l’objectif le long de l’axe y et choisissez une explante dans laquelle quelques axones ORN uniques viennent d’atteindre le lobe de l’antenne pour l’imagerie (Figure 4A).
- Reconnaître le lobe de l’antenne par sa forme ovale et les axones ORN qui commencent à le contourner. Imagez une zone d’environ 150 μm x 150 μm dans le plan xy (zoom 3x avec l’objectif 20x). Estimer la limite des deux lobes d’antenne et les centrer dans la zone d’imagerie.
- Sélectionnez une région d’imagerie initiale le long de l’axe z en définissant la section inférieure et la section supérieure de la numérisation. Configurez la zone d’imagerie le long de l’axe z. Définissez la section la plus profonde avec des signaux axonaux ORN comme première séance d’imagerie et la session 100 μm au-dessus (côté plus superficiel) comme dernière session d’imagerie (Figure 4B).
REMARQUE: Cela laisse certaines sections sur le dessus (côté superficiel) des axones ORN et évite le déplacement des axones ORN vers le haut en dehors de la zone d’imagerie en raison de la croissance du cerveau pendant la culture.- Image à des intervalles de 2 μm. Réglez la numérisation automatique de l’imagerie à la fréquence de toutes les 20 minutes à l’aide d’un logiciel d’imagerie.
- Déplacez la région d’imagerie de 20 μm vers le haut le long de l’axe z après la première imagerie de 4 h et de 20 μm vers le haut le long de l’axe z après 16 h d’imagerie. Cela peut être réalisé en définissant un script et différentes piles z dans le logiciel d’imagerie.
- Cultiver l’explante pendant une période supplémentaire après l’imagerie (jusqu’à 24 h ex vivo) avant la fixation et la coloration avec la N-cadhérine, un marqueur neuropil, pour révéler l’identité génétique de chaque ORN par le glomérule qu’il cible.
4. Traitement d’image
- Pour traiter les images de la pile z des séries de sections prises à chaque point temporel à l’aide du logiciel Fidji, ouvrez la série de sections d’images, cliquez sur Image | Piles | Projet Z [/].
- Pour corriger la dérive latérale de l’échantillon pendant la culture, installez TurboReg Plugin aux Fidji.
- Ouvrez une série d’images de pile z et une seule image de pile z de la série. Ouvrir les plugins | | d’inscription TurboReg.
- Sélectionnez la série d’images de pile z dans Source et l’image de pile z unique dans Target | Traduction. Cliquez sur le bouton Batch pour enregistrer toutes les images de la série d’images z stack ouverte.
- Pour maximiser l’utilité des échantillons imagés, séparez les axones simples peu étiquetés les uns des autres à proximité les uns des autres des images de la pile z suivant les sections d’image 3D.
- Pour extraire des axones ORN uniques de quelques axones dans la même image, ouvrez la série de sections d’images, cliquez sur Plugins | | de segmentation Éditeur de segmentation [/]. Sélectionnez l’outil pinceau et masquez l’axone ORN intéressé dans la fenêtre de travail de l’éditeur de segmentation à l’aide des boutons Sélectionner « + » ou « - » sur chaque section d’image.
- Cliquez sur Process | Calculateur d’image [/]. Sélectionnez « Image X » dans l’image 1, « Multiplier » dans Opération, « Image X. étiquettes » dans l’image 2, [/]. Cela génère un nouveau fichier de série d’images avec l’axone intéressé uniquement. Effectuez l’étape 4.1 pour traiter l’image de la pile z. Répétez cette étape pour tous les points temporels afin de générer un fichier image de série chronologique.
- Pour pseudocolorer différents axones à partir de la même image, effectuez d’abord l’étape 4.3 pour générer le fichier image de série chronologique de chaque axone séparément. Ouvrez les fichiers image de série chronologique pour différents axones uniques à partir de la même image de données brutes. Cliquez sur image | | de couleur Fusionner les canaux. Sélectionnez différents fichiers image de séries chronologiques dans différentes couches de couleur et cliquez sur OK.
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Representative Results
Les axones ORN arrivent au lobe de l’antenne entre 18 h et 36 h APF. Ils naviguent ensuite dans le lobe de l’antenne, traversent la ligne médiane et innervent les glomérules. La vidéo 1 est une vidéo représentative montrant l’ensemble du processus pour plusieurs axones identifiables individuellement, prise à la fréquence de toutes les 20 minutes pendant 24 h. Avant l’enregistrement à l’aide de TurboReg, les axones présentent une certaine dérive latérale à mesure que le cerveau se développe (première moitié de la vidéo). Après l’enregistrement, la dérive est corrigée (seconde moitié de la vidéo).
Pour séparer quelques axones ORN de la même explante, un exemple est illustré à la figure 5. Suite à la procédure décrite à l’étape 4.3, les axones VA1d et VA1v de l’explant illustré à la figure 5A ont été extraits pour générer une nouvelle image de pile z avec uniquement ces deux axones (figure 5B). De même, les axones VM2 et VM3 (Figure 5B') et l’axone DL2 (Figure 5B'') ont été extraits. La figure 5C montre une fusion d’images de la figure 5B-B'' avec des pseudocolores. Les identités génétiques de chaque axone ORN ont été révélées par immunocoloration d’un marqueur neuropil N-cadhérine de l’explante fixe (Figure 5D,E).
Figure 1 : Structure du circuit olfactif de la mouche. (A) Une tête de mouche adulte est montrée avec un ORN des antennes droites (vert) envoyant son axone aux deux lobes de l’antenne (AL) dans le cerveau et formant une connexion synaptique dans un glomérule spécifique avec des dendrites de NP (rouge) dans les AL ipsilatérales et controlatérales. La ligne verticale en pointillés indique la ligne médiane dans ce diagramme et les images suivants. (B) Schéma montrant l’évolution du circuit olfactif. (1) Les dendrites PN innervent d’abord une région du lobe de l’antenne (rouge). Les axones ORN atteignent les lobes des antennes dans le cerveau. (2) Les axones ORN prennent une trajectoire dorsolatérale (verte) ou ventromédiale (bleue) pour contourner le lobe de l’antenne. (3) Les axones ORN traversent la ligne médiane. (4) Les axones ORN innervent les glomérules dans le lobe de l’antenne. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
Figure 2: Préparation de la chambre d’imagerie pour l’explantation. (A) Déposer une couche d’élastomère de silicone (~0,5 cm) au fond d’une boîte de Petri de 60 mm. (B-B') Alignez les broches sur un ruban adhésif et coupez-les à environ 2 mm de long à l’aide d’une paire de ciseaux. (C) Épingler les micro-broches sur la couche d’élastomère de silicone de la plaque de culture. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
Figure 3 : Procédure de dissection de l’explantation antenne-cerveau. (A) Fixez la face ventrale d’une nymphe séchée en papier sur un ruban adhésif double face sur une lame de verre. (B-C) Utilisez une pince pour couper la cuticule brune externe afin d’exposer la nymphe à l’intérieur. (D) Transférer la nymphe dans un puits de dissection avec un milieu plein oxygéné. (E-G) Séparez soigneusement le tronc nymphal de la tête à l’aide de microcisseurs. (H) Couper les morceaux de cuticule semi-transparente recouvrant les côtés dorsal et ventral du cerveau. Gardez une cuticule sur les côtés antérieur et latéral du cerveau pour conserver les connexions entre la rétine, les antennes et le cerveau. (H') Évitez de couper le nerf antenne pendant cette étape. (I) Nettoyez le corps gras qui recouvre le cerveau en piquant doucement. (J) Couper un ou deux nerfs antennes à l’aide de microcisseurs dans certaines expériences. (K) Placer une gouttelette de milieu plein oxygéné à la surface de la plaque de culture. Transférer l’explant disséqué à l’aide d’une pointe de pipette à pointe large. (L) Utiliser une pince pour épingler les deux lobes optiques de l’explant sur la couche d’élastomère de silicone. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
Figure 4 : Imagerie en accéléré d’un seul axone ORN ciblant une explantation. (A) Sélectionnez une explante avec quelques axones ORN atteignant juste le lobe de l’antenne. Estimer la forme de deux lobes d’antenne par la courbure des axones et centrer les lobes d’antenne dans le champ d’imagerie. (B) Définissez la région d’imagerie le long de l’axe z. Considérez que le lobe de l’antenne se déplacera vers le haut à mesure que le cerveau grandit et se développe. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
Figure 5 : Extraire des ORN uniques et révéler leurs identités glomérulaires. (A) Image de projection maximale d’une explante avec 5 à 10 axones ORN simples utilisant la microscopie à deux photons avec objectif 20x et zoom avant 3x. (B-B'') 1-2 axones simples sont extraits de (A) en créant manuellement des masques dans des sections d’image à partir des données d’image brutes. (C) Fusionner les images de (B-B'') avec chaque axone pseudo-coloré différemment. (D-D') Projection maximale d’images confocales prises avec objectif 40x et zoom 1,5x. L’explantation indiquée en (A) a été fixée suivie d’une coloration avec anti-GFP et anti-N-cadhérine (marqueur neuropil). Les moitiés antérieure et postérieure des lobes antennes sont empilées séparément en (D) et (D'). (E) La carte des lobes de l’antenne montre les axones ORN extraits en (B,C). Certaines images présentées dans cette figure sont modifiées à partir d’une étude antérieure8. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
Vidéo 1 : Des images time-lapse basées sur la microscopie à deux photons montrent le ciblage de deux axones ORN, avant et après l’enregistrement de l’image. Veuillez cliquer ici pour télécharger cette vidéo.
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Discussion
L’explante cerveau antennes-drosophiles conserve un ciblage normal du circuit olfactif. Nous avons remarqué que le développement est 2 fois plus lent ex vivo par rapport à in vivo. Il est à noter que le système explant ne retient pas le palpe maxillaire, qui héberge six types d’ORN. Pour assurer un développement normal récapitulé ex vivo, l’étirement des nerfs antennels doit être évité pendant la dissection explant. Au cours de la culture ex vivo, la croissance des bactéries provoque généralement l’arrêt du développement du circuit olfactif. Par conséquent, il est important de stériliser soigneusement la boîte de culture et les épingles avant l’imagerie et de garder la salle d’imagerie propre et isolée.
Cette explantation prend en charge l’imagerie time-lapse basée sur la microscopie à deux photons à long terme. Combiné à un rapporteur nouvellement développé pour l’étiquetage clairsemé des ORN uniques, le système explant permet une imagerie haute résolution à partir d’un seul terminus axonal. Ce système est puissant pour étudier les mécanismes biologiques cellulaires qui sous-tendent le processus dynamique d’assemblage des circuitsolfactifs 8. Bien que le développement du circuit olfactif ait été montré ici à titre d’exemple, ce système peut potentiellement être étendu à l’étude d’autres circuits ou d’autres processus de développement dans le cerveau central en développement.
L’explante maintient un développement normal en culture pendant au moins 24 heures, ce qui peut capturer l’ensemble du processus de ciblage ORN. Il permet aux chercheurs de révéler l’identité génétique d’axones ORN uniques par contre-coloration avec un marqueur neuropil après fixation, car le lobe de l’antenne développe déjà une structure glomérulaire évidente à la fin de la culture. Cette stratégie contourne le problème de l’absence de pilotes génétiques spécifiques pour de nombreux types d’ORN à un stade précoce de développement afin de réaliser l’imagerie de types spécifiques d’ORN à l’aide d’un pilote pan-ORN.
Pour obtenir une résolution spatio-temporelle plus élevée, ce système d’explant peut être imagé à l’aide d’une microscopie plus avancée, la microscopie à feuille de lumière à réseau optique adaptative (AO-LLSM). Il a été démontré que l’AO-LLSM permet de visualiser les structures fines des terminaux axonaux et la fréquence de balayage toutes les 30 secondes par volume 8,9,10,11. L’un des avantages de l’explante est sa compatibilité avec le colorant Janelia Fluorophore 12,13,14 en incubant l’explante exprimant Halo-tag dans des neurones spécifiques avec des colorants dans le milieu avant l’imagerie. Il a été remarqué que l’incubation de l’explante avec un milieu contenant du colorant entraîne un marquage beaucoup plus fort que l’alimentation des larves avec le colorant. Cet avantage unique nous a permis d’imager les axones à un stade précoce de développement qui était à peine visualisé par l’étiquetage GFP8.
En plus de l’imagerie time-lapse, le système explant présente d’autres avantages. Par exemple, il est possible de séparer les nerfs antennels de l’explante disséquée unilatéralement ou bilatéralement à des moments de développement spécifiques (étape 2.8). Cela permet aux chercheurs de sonder les besoins des axones ORN dans le ciblage de tous les types de neurones dans le circuit olfactif à des étapes de développement distinctes. En particulier, les essais unilatéraux de rupture du nerf antennel, qui ne peuvent pas être réalisés par manipulation génétique traditionnelle, ont conduit à une découverte intéressante que l’interaction entre les axones ORN bilatéraux est nécessaire pour un ciblage controlatéral correct des axones ORN8. De plus, l’explante est cultivée directement dans un milieu au lieu d’être incorporée dans l’agarose, permettant ainsi une livraison rapide et un lavage de certaines petites molécules ou médicaments. Par rapport à la manipulation génétique, le traitement médicamenteux présente les avantages d’un effet rapide et d’une réversibilité de la manipulation. Il permet aux chercheurs d’évaluer certains processus essentiels pour les cellules à des stades de développement ultérieurs en contournant la létalité cellulaire ou les problèmes malsains dus à la perturbation constitutive par des manipulations génétiques. Il aide également à visualiser les changements subtils en comparant avant et après le traitement médicamenteux, et après l’élimination du médicament.
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Disclosures
Les auteurs n’ont rien à divulguer.
Acknowledgments
Nous remercions N. Özel et R. Hiesinger pour leurs conseils sur la culture des explants; M. Wagner pour l’aide technique de la microscopie à deux photons; D.J. Luginbuhl pour la génération de mouches transgéniques; D. Friedmann pour des suggestions d’analyse de logiciels fidjiens; Y. Ge pour l’assistance au travail à la volée; C. McLaughlin et K.K.L. Wong pour leurs commentaires sur le manuscrit. L.L. est un chercheur du Howard Hughes Medical Institute. Ce travail a été soutenu par les subventions 1K99DC01883001 (à T.L.) et R01-DC005982 (à L.L.).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 20-hydroxyecdysone | Sigma | H5142 | |
| Chameleon Ti:Sapphire laser | Coherent | Coherent MRU X1 | |
| Fetal Bovine Serum | Thermo Fisher Scientific | 10082147 | |
| Human insulin | Thermo Fisher Scientific | 12585014 | |
| Imaging software | Prairie | ||
| Micro Scissors | World Precision Instruments | 501778 | |
| Minutien Pins | Fine Science Tools | 26002-10 | |
| Oxygen cylinder | Praxair | OX M-E | |
| Penicillin-Streptomycin | Thermo Fisher Scientific | 15140122 | |
| Schneider’s Drosophila Medium | Thermo Fisher Scientific | 21720024 | |
| SYLGARD 184 Silicone Elastomer | Thermo Fisher Scientific | NC0162601 | |
| Two-photon microscopy | Bruker | ||
| water immerse objective (20X) | Zeiss | 421452-9800-000 |
References
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