Summary
פרוטוקול זה מתאר את הליך הנתיחה, מצב התרבית וההדמיה החיה של מערכת אקספלנט של אנטנות-מוח לצורך חקר מכלול מעגלי חוש הריח.
Abstract
~נוירונים מחוברים זה לזה במדויק כדי ליצור מעגלים החיוניים לתפקוד תקין של המוח. מערכת חוש הריח Drosophila מספקת מודל מצוין לחקור את התהליך הזה מכיוון ש-50 סוגים של נוירונים של קולטני חוש הריח (ORNs) מהאנטנות והפלפים המקסילריים מקרינים את האקסונים שלהם ל-50 גלומרולי הניתנים לזיהוי באונה האנטנה ויוצרים קשרים סינפטיים עם דנדריטים מ-50 סוגים של נוירוני הקרנה מסדר שני (PNs). מחקרים קודמים התמקדו בעיקר בזיהוי מולקולות חשובות המווסתות את המיקוד המדויק במעגל חוש הריח באמצעות רקמות קבועות. כאן מתוארת מערכת הסברים של אנטנה-מוח המשחזרת אבני דרך התפתחותיות מרכזיות של הרכבת מעגלי חוש הריח בתרבית. באמצעות ניתוח הקוטיקולה החיצונית וניקוי גופי שומן אטומים המכסים את המוח הפופל המתפתח, ניתן לאסוף תמונות באיכות גבוהה של נוירונים בודדים ממוחות חיים באמצעות מיקרוסקופיה של שני פוטונים. זה מאפשר הדמיה בהילוך מהיר של מיקוד אקסון ORN יחיד מרקמה חיה. גישה זו תסייע לחשוף הקשרים ותפקודים ביולוגיים חשובים של תאים של גנים חשובים שזוהו בעבר ולזהות מנגנונים העומדים בבסיס התהליך הדינמי של הרכבת מעגלים.
Introduction
נוירונים מחוברים זה לזה במדויק כדי ליצור מעגלים החיוניים לתפקוד תקין של המוח. במשך יותר מ-100 שנה, מדעני מוח מנסים להבין כיצד נויריטים מתרחבים לעבר המטרות הבינוניות והסופיות שלהם בדיוק רב. כתוצאה מכך, הם זיהו גנים חשובים המקודדים רמזי הנחיה לפיתוח תהליכים עצביים1. מערכת חוש הריח Drosophila מספקת מודל מצוין לחקר התהליך הזה, שכן נוירונים של קולטני חוש הריח (ORNs, הנוירונים החושיים העיקריים) מקרינים 50 גלומרולי הניתנים לזיהוי עם גודל, צורה ומיקום יחסי סטריאוטיפיים, שם הם יוצרים קשרים סינפטיים עם דנדריטים מ-50 סוגים של נוירוני הקרנה מסדר שני (PNs), שכל אחד מהם שולח דנדריטים לאחד מ-50 הגלומרולי2 (איור 1A ). לכן, קל יחסית לזהות פנוטיפים מוטנטיים ברזולוציה סינפטית (גלומרולרית) במערכת חוש הריח הזבובית. זה הוביל לתגליות של גנים חשובים המווסתים את הרכבת מעגלי חוש הריח3.
ההרכבה של מעגל חוש הריח הזבובי מסתמכת על תהליכים התפתחותיים מתואמים זמנית ומרחבית3. ORNs ו- PNs רוכשים גורלות תאים מובחנים, אשר מגדירים את התוכנית עבור ספציפיות החיווט שלהם. לאחר מכן, דנדריטים של PN מקדימים את אונת האנטנה (איור 1B). לאחר מכן, האקסונים של ה-ORNs מקיפים את אונת האנטנה האיפסילטרלית וחוצים את קו האמצע של המוח כדי להגיע לאונת האנטנה הקונטרה-צדדית. לאחר מכן, אקסונים של ORN פולשים הן לאונות אנטנה ipsi והן לאונות אנטנה קונטרלטרליות ויוצרים סינפסות עם דנדריטים של PNs השותפים שלהם בגלומרולי ספציפי. מודל גס זה להרכבת מעגלי חוש הריח הוצע על סמך אפיון דגימות קבועות מנקודות זמן ביניים במהלך הפיתוח. הרזולוציה הטמפורלית הירודה וחוסר היכולת לעקוב אחר אותם תהליכים עצביים לאורך ההתפתחות מרקמה קבועה מגבילים את ההבנה המכניסטית של תהליך הרכבת המעגלים.
זה מאתגר מבחינה טכנית לצלם בשידור חי תהליכי ORN ו- PN in vivo מכיוון שתהליך החיווט מתרחש במחצית הראשונה של שלב הפופל כאשר אונת האנטנה מוקפת בגוף שומן אטום בתוך מארז הפופל. לכן, אי אפשר לדמות ישירות את מעגל חוש הריח המתפתח מגלמים שלמים. רקמות מנותחות בתרבית ex vivo יכולות לעקוף את אטימות הרקמות ושימשו בהצלחה לחקר ההתפתחות העצבית 4,5,6. האתגר של שימוש באסטרטגיה דומה של תרבית ex vivo explant כדי לחקור חיווט עצבי במוח הפופל הוא האם הוא משחזר את מיקוד הנוירונים המדויק במצב תרבית. בהתבסס על מצב תרבית ex vivo שדווח בעבר עבור קומפלקס העין-מוח זבוב7, פותח לאחרונה אקספלנט המכיל את כל המוח הפופלי, האנטנות ועצבי האנטנה המחברים ללא פגע, אשר שומר על מיקוד מדויק של מעגל חוש הריח וניתן להכפיף אותו להדמיה חיה מבוססת מיקרוסקופיית שני פוטונים למשך עד 24 שעות בתדר של כל 20 דקות8 . כאן מתואר פרוטוקול מפורט של תרבות ההסבר וההדמיה. מערכת ההסבר מספקת שיטה רבת עוצמה לחקר הרכבה של מעגלי חוש הריח ואולי גם מעגלים אחרים במוח המרכזי.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. הכנת ריאגנטים
הערה: כל השלבים בפרוטוקול זה מתבצעים בטמפרטורת החדר (20-25 מעלות צלזיוס) אלא אם כן הוסבר אחרת.
- כדי להכין את צלחת התרבית לשתוק האקספלנט במהלך הדמיית קיטועי הזמן, הניחו את סילגארד בעובי 0.5 ס"מ (ערבבו היטב שני רכיבים נוזליים ביחס של 10:1 לפני השימוש) על המשטח התחתון של צלחת פטרי בגודל 60 מ"מ x 15 מ"מ ותנו לו לרפא למשך 48 שעות בטמפרטורת החדר (איור 2A, המכונה צלחת סילגארד בטקסט הבא).
- כדי להכין מיקרו-פינים לשיתוק אקספלנט על צלחת זו, השתמשו בזוג מלקחיים כדי להדביק מספר פינים זעירים על סרט הדבקה כאשר הקצוות החדים מיושרים בצד אחד (איור 2B). השתמשו בזוג מספריים כדי לחתוך כ-2 מ"מ מהקצוות החדים של פיני המיקרו (איור 2B'). השתמשו במלקחיים כדי להחזיק את סיכות המיקרו החתוכים ולהחדיר לשכבת סילגארד של צלחת סילגארד מוכנה מראש (איור 2C). שני פינים זעירים משמשים לשתוק אקספלנט אחד.
- השתמש במברשת כדי לאסוף גלמים לבנים, היוצרים puparium תוך שעה אחת, של hsFLP, חלוקי נחל-GAL4/+; UAS-FRT100-stop-FRT 100-mCD8-GFP 8 גנוטיפ ולהעביר אותם לבקבוקונים חדשים. הלם חום באמבט מים של 37 מעלות צלזיוס למשך 40 דקות כדי לגרום לשיבוטי ORN דלילים מסוגים אקראיים. לאחר הלם חום, שים את הבקבוקונים על 25 מעלות צלזיוס למשך 30 שעות, וכתוצאה מכך הגלמים הזדקנו ב -30 שעות לאחר היווצרות puparium (APF).
- כדי להכין את מדיום התרבות לאקספלנט, הוסיפו 5 מ"ל של פניצילין-סטרפטומיצין (10,000 U/mL) ל-500 מ"ל מדיום דרוזופילה של שניידר. לסנן את המדיום ולעשות 45 מ"ל aliquots ב 50 מ"ל צינורות חרוטיים. ניתן לאחסן את המדיום בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס למשך 1-2 חודשים.
- ביום ההדמיה, קחו צינורית אחת של 45 מ"ל של מדיום דרוזופילה של שניידר והוסיפו 5 מ"ל של סרום בקר עוברי (10% v/v), 125 μL של תמיסת מלאי אינסולין אנושית של 4 מ"ג/מ"ל (ריכוז סופי של 10 מיקרוגרם/מ"ל), 50 μL של תמיסת מלאי 1 מ"ג/מ"ל 20-הידרוקסיאקדיזון מומסת באתנול (ריכוז סופי של 1 מיקרוגרם/מ"ל). מערבבים היטב ומעבירים 15 מ"ל של מדיום מלא לצינור חרוטי חדש של 50 מ"ל. את שאר המדיום המלא ניתן לאחסן בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס למשך שבוע. סרום בקר עוברי, תמיסת מלאי אינסולין אנושי ותמיסת מלאי 20-hydroxyecdysone הם aliquoted ומאוחסנים בטמפרטורה של -20 מעלות צלזיוס.
- חמצן את המדיום המלא של 15 מ"ל על ידי שאיבת בועות חמצן מבלון חמצן מתחת לפני השטח הנוזליים דרך קצה פיפטה סטרילי של 5 מ"ל בקצב של בועה אחת לשנייה למשך 20-30 דקות. השתמש בסרט פרפין כדי לכסות את פתיחת הצינור במהלך תהליך זה.
- לעקר את משטח באר הנתיחה ואת לוחית סילגרד (עם מיקרו פינים מוכנסים על שכבת סילגארד, מוכנסים בשלבים A1 ו- A2) עם 70% אתנול. תנו להם להתייבש לפני השימוש.
2. דיסקציה אקספלנט
- השתמש במברשת כדי להעביר 30 שעות APF (30 שעות לאחר היווצרות puparium) גלמים לרקמת נייר ולייבש את המשטח החיצוני של הגלמים במשך 5 דקות.
- שים חתיכת סרט דו-צדדי על מגלשת זכוכית. חברו בזהירות את הגלמים המיובשים על המשטח הדביק של הסרט כאשר הצד הגבי פונה כלפי מעלה. לחצו בעדינות על הגלמים עם מברשת כדי לעזור לצד הגחון של הגלמים להתחבר היטב לקלטת (איור 3A). אין לפגוע בגולם.
- השתמשו בזוג מלקחיים כדי להסיר את נרתיק הפופל החום המכסה את הצד הגבי של הראש (איור 3A,B). הוסיפו קצה חד אחד של המלקחיים בין נרתיק הפופל החום לבין הגלם מהצד הצדדי ושברו בזהירות את נרתיק הפופל החום דרך קו לקצה האחורי של הגלם (איור 3B,C). פתחו את המארז החום של הפופל. השתמש בזוג מלקחיים כדי להחזיק בעדינות את הגלם ולהעביר את הנתיחה היטב עם 1 מ"ל של בינוני מלא מחומצן. הטביעו גלמים צפים על המשטח הבינוני כדי לעזור לו לשקוע לתחתית הבאר (איור 3D).
הערה: אין להחדיר את קצה המלקחיים עמוק מדי לתוך נרתיק הפופל החום כדי למנוע פגיעה בגולם עם המלקחיים. - כדי לנתח את האנטנה-מוח מתוך הגלם, השתמשו במלקחיים כדי להחזיק בעדינות את הגלם ביד אחת והשתמשו בזוג מיקרו-חתכים כדי לחתוך חור קטן מהצד האחורי של הגלם ביד השנייה (איור 3E). חור קטן זה משחרר את הלחץ הגבוה בתוך הגלם.
- חותכים דרך קו האמצע הגחוני של הגלם מהחור עד הצוואר (המבנה הצר שמחבר את הראש ובית החזה) עם המיקרו-חתכים (איור 3F). לאחר מכן, חתכו את היקף הצוואר כדי לנתק את הראש מגוף הגלם (איור 3G). מוציאים את הגוף ומניחים אותו בבאר אחרת.
הערה: אין לחתוך את הצוואר ישירות מהצד הגבי/גחוני של הגלם, מה שעלול לסחוט את המוח. - חותכים את הציפורן השקופה שמכסה את הצד הגבי של המוח (איור 3H). זה יחשוף את הגוף השמן על גבי המוח. שמור על כמה ציפורניים שאליהן הרשתית והאנטנות מתחברות. חזור על אותו הליך לצד הגחוני של המוח.
הערה: אל תכניסו את הלהב של המספריים עמוק מדי מתחת לציפורן, שכן הדבר יגרום לניתוק עצבי האנטנה המחברים בין האנטנות למוח (איור 3H'). - השתמשו בפיפטה P10 כדי לשטוף בעדינות את הגוף השמן שמכסה את המוח ואת האנטנות על ידי צנרת המדיום לכיוון האזורים הפתוחים בצד הגבי והגחוני של הראש (איור 3I).
הערה: היו עדינים מאוד בעת צנרת המדיום מכיוון שניתן לנתק את המוח בקלות מהציפורן. ודא שכל הגוף השמן מוסר במהלך שלב זה. התפתחות עצורה של אקסונים של ORN נצפתה כאשר הגוף השמן לא ניקה היטב, כנראה בגלל גישה לקויה לחמצן מהמדיום. - כדי לחקור את האינטראקציה של אקסונים דו-צדדיים של ORN או אקסונים של ORN למיקוד דנדריט PN, נתקו עצב אנטנה אחד או שניים עם המיקרו-חתכים במהלך שלב זה8 (איור 3J). הניחו בזהירות את להבי המספריים בין הציפורן למוח וקטעו את עצבי האנטנה המעוניינים בכך.
- כדי להעביר את האקספלנט המנותח לצלחת סילגארד, הניחו טיפה של תווך מלא מחומצן (כ-200 μL) על פני השטח של סילגארד. מצפים את המשטח הפנימי של קצה פיפטה ברוחב 200 μL עם הגוף השמן מהגזע המנותח (שלב 1.6) על ידי צנרת הגוף השמן מספר פעמים, מה שמונע מהגולשים להדביק את קצה הפיפטה במהלך ההעברה. לאחר מכן, השתמשו בקצה הפיפטה הרחב הזה כדי להעביר את האקספלנט מהניתוח היטב לטיפה הבינונית שעל צלחת התרבית (איור 3K).
- השתמשו במלקחיים כדי להצמיד את האקספלנט לשכבת סילגארד בשתי האונות האופטיות (איור 3L). מקם בזהירות את צלחת Sylgard על תחנת ההדמיה ושיתק את הצלחת עם קלטות. לאט לאט מוסיפים 10 מ"ל של מדיום מלא מחומצן לצלחת Sylgard באמצעות P1000 pipette.
הערה: הימנעו משיבוש האקספלנט בעת הוספת המדיום לצלחת Sylgard.
3. הדמיה חיה מבוססת מיקרוסקופיית שני פוטונים
- כדי לבצע הדמיה בהילוך מהיר, השתמש במיקרוסקופ בעל שני פוטונים, לייזר Ti:Sapphire, מטרת טבילת מים פי 20 (1.0 NA) ותוכנת הדמיה. השתמש באורך הגל של העירור ב- 920 ננומטר להדמיית חלבוני GFP. התאם את זמן השהייה של הפיקסל ל- 10 μs.
- התאם את מיקום תחנת ההדמיה כך שהמוציאים יהיו בערך תחת המטרה. השתמשו ב-70% אתנול כדי לעקר את העדשה לפני ההדמיה. לאט לאט הנמיכו את המטרה מתחת למדיום הקרוב למוציאים. בדוק אם יש בועה כלשהי על העדשה של האובייקטיבי.
- אם כן, הרם את המטרה מעל המדיום וחזור על כך עד שהבועה נעלמת. מצאו את הגולשים באמצעות העינית והמרכז אחד בשדה.
- כדי להבטיח אקספלנט עם כמה ORNs המסומנים בדלילות להדמיית קיטועי זמן, נתחו ~10 explants בכל פעם והתיישרו על ציר y בלוח התרבית. מסננים את כל האקסלנטים על ידי הזזת המטרה לאורך ציר y ובוחרים אקספלנט שבו כמה אקסונים בודדים של ORN הגיעו זה עתה לאונת האנטנה להדמיה (איור 4A).
- זהה את אונת האנטנה לפי צורתה הסגלגלה ואת האקסונים של ORN שמתחילים להקיף אותה. דמיינו אזור של כ-150 מיקרומטר x 150 מיקרומטר במישור xy (זום של 3x עם המטרה של 20x). להעריך את הגבול של שתי אונות האנטנה ולרכז אותן באזור ההדמיה.
- בחר אזור הדמיה ראשוני לאורך ציר z על-ידי הגדרת החלק התחתון והחלק העליון של הסריקה. הגדר אזור הדמיה לאורך ציר z. הגדר את הקטע העמוק ביותר עם אותות האקסון של ORN כהפעלה הראשונה של ההדמיה ואת ההפעלה 100 מיקרומטר למעלה (הצד השטחי יותר) כפגישת ההדמיה האחרונה (איור 4B).
הערה: פעולה זו משאירה חלקים מסוימים בצד העליון (השטחי) של אקסוני ORN ומונעת תזוזה של אקסוני ORN כלפי מעלה מחוץ לאזור ההדמיה עקב צמיחת המוח במהלך התרבית.- תמונה במרווחים של 2 מיקרומטר. הגדר סריקת הדמיה אוטומטית בתדר של כל 20 דקות באמצעות תוכנת הדמיה.
- הזיזו את אזור ההדמיה 20 μm כלפי מעלה לאורך ציר z לאחר ההדמיה הראשונה של 4 שעות ועוד 20 μm כלפי מעלה לאורך ציר z לאחר הדמיה של 16 שעות. ניתן להשיג זאת על ידי הגדרת סקריפט וערימות z שונות בתוכנת ההדמיה.
- תרבית את האקספלנט לתקופה נוספת לאחר ההדמיה (עד 24 שעות ex vivo) לפני קיבוע וכתם עם N-cadherin, סמן נוירופיל, כדי לחשוף את הזהות הגנטית של כל ORN בודד על ידי הגלומרולוס שאליו הוא מכוון.
4. עיבוד תמונה
- כדי לעבד תמונות z stack מסדרות מקטעים שצולמו בכל נקודת זמן באמצעות תוכנת פיג'י, פתח את סדרת מקטעי התמונות, לחץ על תמונה | ערימות | פרויקט Z [/].
- כדי לתקן סחף רוחבי של המדגם במהלך התרבית, התקן את תוסף TurboReg בפיג'י.
- פתח סדרת תמונות של מחסנית z ותמונת מחסנית z בודדת מהסדרה. פתח את | התוספים | הרשמה טורבו-רג.
- בחר את סדרת התמונות z stack במקור ואת תמונת מחסנית z הבודדת ב- Target | תרגום. לחץ על לחצן אצווה כדי לרשום את כל התמונות מסדרת התמונות z stack שנפתחה.
- כדי למקסם את התועלת של דוגמאות עם תמונה, הפרד אקסונים בודדים המסומנים בדלילות בסביבה זה לזה מתמונות z stack לאחר מקטעי תמונה תלת-ממדיים.
- כדי לחלץ אקסונים בודדים של ORN מכמה אקסונים באותה תמונה, פתח את סדרת מקטעי התמונות, לחץ על תוספים | | סגמנטציה עורך סגמנטציה [/]. בחר את כלי המברשת ואת המסיכה המעוניינת ב- ORN axon בחלון העבודה של עורך הסגמנטציה באמצעות הלחצנים בחר "+" או "-" בכל מקטע תמונה.
- לחץ על תהליך | מחשבון תמונה [/]. בחר "תמונה X" בתמונה 1, "הכפל" בפעולה, "תמונה X. תוויות" בתמונה 2, [/]. פעולה זו יוצרת קובץ סדרת תמונות חדש עם האקסון המעוניין בלבד. בצע את שלב 4.1 כדי לעבד את תמונת מחסנית z. חזור על שלב זה עבור כל נקודות הזמן כדי ליצור קובץ תמונה מסדרת זמן.
- כדי לפסבדו-צבע אקסונים שונים מאותה תמונה, תחילה בצע את שלב 4.3 כדי ליצור את קובץ התמונה של סדרת הזמן של כל אקסון בנפרד. פתח את קבצי התמונה של סדרת הזמן עבור אקסונים בודדים שונים מאותה תמונת נתונים גולמית. לחץ על תמונה | | צבע מיזוג ערוצים. בחר קבצי תמונה שונים מסדרות זמן בערוצי צבעים שונים ולחץ על אישור.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
אקסונים של ORN מגיעים לאונת האנטנה בין 18 שעות ל-36 שעות APF. לאחר מכן הם מנווטים את אונת האנטנה, חוצים את קו האמצע ומעצימים את הגלומרולי. סרטון 1 הוא סרטון מייצג המציג את כל התהליך עבור מספר אקסונים הניתנים לזיהוי בנפרד, שצולמו בתדירות של כל 20 דקות במשך 24 שעות. לפני ההרשמה באמצעות TurboReg, האקסונים מפגינים סחף רוחבי מסוים ככל שהמוח מתפתח (המחצית הראשונה של הסרטון). לאחר ההרשמה, הסחיפה מתוקנת (המחצית השנייה של הסרטון).
כדי להפריד בין כמה אקסונים של ORN לבין אותו אקספלנט, מוצגת דוגמה אחת באיור 5. בעקבות ההליך בשלב 4.3, אקסונים VA1d ו-VA1v מתוך ההסבר המוצג באיור 5A חולצו כדי ליצור תמונת מחסנית z חדשה עם שני האקסונים האלה בלבד (איור 5B). באופן דומה, אקסונים VM2 ו-VM3 (איור 5B') ואקסון DL2 (איור 5B'') חולצו. איור 5C מראה מיזוג של תמונות באיור 5B-B'' עם פסאודו-צבעים. הזהויות הגנטיות של כל אקסונים של ORN נחשפו על ידי סימון חיסוני של סמן נוירופיל N-cadherin של האקספלנט הקבוע (איור 5D,E).
איור 1: מבנה מעגל חוש הריח הזבובי. (A) ראש זבוב בוגר מוצג עם ORN אחד מהאנטנות הימניות (ירוק) ששולח את האקסון שלו לשתי אונות האנטנה (ALs) במוח ויוצר חיבור סינפטי בגלומרולוס מסוים עם דנדריטים של PNs (אדום) ב-ALs האיפסילטרליים והקנטרלטרליים. קו אנכי מקווקו מציין קו אמצע בדיאגרמה ובתמונות אלה ובתמונות הבאות. (B) דיאגרמה המציגה את התפתחות מעגל חוש הריח. (1) דנדריטים של PN מעצימים תחילה אזור באונה האנטנלית (אדום). אקסונים של ORN מגיעים לאונות האנטנה במוח. (2) אקסונים של ORN לוקחים מסלול דורסולטרלי (ירוק) או וונטרומדיאלי (כחול) כדי להקיף את אונת האנטנה. (3) אקסונים של ORN חוצים את קו האמצע. (4) אקסונים של ORN מעירים את הגלומרולי באונה האנטנלית. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה.
איור 2: הכנת תא ההדמיה לאקספלנט (A) הניחו שכבה של אלסטומר סיליקון (כ-0.5 ס"מ) בתחתית צלחת פטרי בקוטר 60 מ"מ. (ב-ב') יישור פינים על סרט וחתך לאורך של כ-2 מ"מ באמצעות זוג מספריים. (C) הצמד את סיכות המיקרו בשכבת אלסטומר הסיליקון של צלחת התרבית. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה.
איור 3: הליך הנתיחה של האנטנה-מוח מסביר. (A) חבר את הצד הגחוני של גולם נייר מיובש ברקמות על סרט דו-צדדי על מגלשת זכוכית. (ב-ג) השתמש במלקחיים כדי לחתוך את הציפורן החומה החיצונית כדי לחשוף את הגלם בפנים. (ד) להעביר את הגלמים לבאר כריתה עם מדיום מלא מחומצן. (ה-ג)) הפרד בזהירות את גזע הפופל מהראש באמצעות מיקרו-חתכים. (H) לחתוך את חתיכות הציפורן החצי-שקופה המכסות את הצדדים הגביים והגחוניים של המוח. שמור מעט ציפורניים בצד הקדמי והצידי של המוח כדי לשמור על קשרים בין הרשתית, האנטנות והמוח. (ח') הימנע מניתוק עצב האנטנה במהלך שלב זה. (I) נקו את הגוף השמן המכסה את המוח על ידי צניחה עדינה. (J) לנתק עצב אנטנה אחד או שניים באמצעות מיקרו-חתכים בניסויים מסוימים. (K) הניחו טיפה של מדיום מלא מחומצן על פני השטח של צלחת התרבית. מעבירים את האקספלנט המנותח באמצעות קצה פיפטה רחב. (L) השתמש במלקחיים כדי להצמיד את שתי האונות האופטיות של האקספלנט לשכבת אלסטומר הסיליקון. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה.
איור 4: הדמיה בהילוך מהיר של אקסון ORN יחיד המכוון מתוך אקספלנט. (A) בחר אקספלנט עם כמה אקסונים של ORN שרק מגיעים לאונה האנטנה. להעריך את הצורה של שתי אונות אנטנה על ידי העקמומיות של האקסונים ולרכז את אונות האנטנה בשדה ההדמיה. (B) הגדר את אזור ההדמיה לאורך ציר z. קחו בחשבון שהאונה האנטנלית תזוז כלפי מעלה ככל שהמוח יגדל ויתפתח. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה.
איור 5: חלצו ORNs בודדים וחשפו את זהותם הגלומרולרית. (A) תמונת הקרנה מקסימלית של אקספלנט עם 5-10 אקסונים בודדים של ORN באמצעות מיקרוסקופיה של שני פוטונים עם 20x אובייקטיבי והגדלה של פי 3. (B-B'') 1-2 אקסונים בודדים מופקים מ-(A) על ידי יצירה ידנית של מסכות במקטעי תמונה מנתוני התמונה הגולמיים. (C) למזג את התמונות של (B-B'') עם כל אקסון בצבע פסאודו שונה. (ד-ד') תמונות קונפוקליות של הקרנה מקסימלית שצולמו עם מטרה של פי 40 וזום של פי 1.5. האקספלנט שהוצג ב-(A) תוקן ואחריו הכתם עם אנטי-GFP ואנטי-N-קדהרין (סמן נוירופיל). החצאים הקדמיים והאחוריים של אונות האנטנה הם ערימות נפרדות ב-(D) ו-(D). (E) מפת אונת האנטנה מראה אקסונים של ORN שחולצו ב-(B,C). חלק מהתמונות המוצגות באיור זה שונו ממחקר קודם8. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה.
סרטון 1: תמונות המבוססות על מיקרוסקופיית זמן מבוססת שני פוטונים מראות מיקוד של שני אקסונים של ORN, לפני ואחרי רישום התמונה. אנא לחץ כאן כדי להוריד את הסרטון הזה.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
האקספלנט המוחי של אנטנות Drosophila שומר על מיקוד תקין של מעגל חוש הריח. שמנו לב שההתפתחות איטית פי 2 ב-ex vivo בהשוואה ל-in vivo. צוין כי מערכת ההסבר אינה שומרת על מישוש מקסילרי, המארח שישה סוגים של ORNs. כדי להבטיח שהתפתחות תקינה תחזור על עצמה ex vivo, יש להימנע ממתיחה של עצבי האנטנה במהלך כריתת אקספלנט. במהלך תרבית ex vivo גידול חיידקים בדרך כלל גורם להתפתחות עצורה של מעגל חוש הריח. לכן, יש חשיבות לעיקור יסודי של תבשיל התרבית והסיכות לפני ההדמיה ושמירה על חדר ההדמיה נקי ומבודד.
אקספלנט זה תומך בהדמיה ארוכת טווח של מיקרוסקופיה דו-פוטונית המבוססת על קיטועי זמן. בשילוב עם כתב שפותח לאחרונה לתיוג דליל של ORNs בודדים, מערכת האקספלנט מאפשרת הדמיה ברזולוציה גבוהה ממסוף אקסון יחיד. מערכת זו היא רבת עוצמה לחקר המנגנונים הביולוגיים של התא העומדים בבסיס התהליך הדינמי של הרכבת מעגלי חוש הריח8. למרות שפיתוח מעגלי חוש הריח הוצג כאן כדוגמה, ניתן להרחיב מערכת זו למחקרים של מעגלים אחרים או תהליכים התפתחותיים אחרים במוח המרכזי המתפתח.
האקספלנט שומר על התפתחות תקינה בתרבית במשך 24 שעות לפחות, מה שיכול ללכוד את כל התהליך של מיקוד ORN. היא מאפשרת לחוקרים לחשוף את הזהות הגנטית של אקסונים בודדים של ORN באמצעות צביעה נגדית עם סמן נוירופיל לאחר קיבוע, שכן אונת האנטנה כבר מפתחת מבנה גלומרולרי ברור בסוף התרבות. אסטרטגיה זו עוקפת את הבעיה של היעדר מניעים גנטיים ספציפיים עבור סוגי ORN רבים בשלב התפתחותי מוקדם כדי להשיג הדמיה של סוגים ספציפיים של ORN באמצעות נהג pan-ORN.
כדי להשיג רזולוציה מרחבית-טמפורלית גבוהה יותר, ניתן לצלם את מערכת האקספלנט הזו באמצעות מיקרוסקופיה מתקדמת יותר, מיקרוסקופיית יריעת האור אדפטיבית של אופטיקה-סריג (AO-LLSM). הוכח כי AO-LLSM מאפשר הדמיה של מבנים עדינים של מסופי אקסון ותדר סריקה בכל 30 שניות לכלנפח 8,9,10,11. יתרון אחד של האקספלנט הוא התאמתו לצבע Janelia Fluorophore 12,13,14 תיוג על ידי דגירה של האקספלנט המבטא את תג Halo בתאי עצב ספציפיים עם צבעים בתווך לפני ההדמיה. הבחין כי דגירה של האקספלנט עם מדיום המכיל צבע גורמת לסימון חזק בהרבה מאשר האכלת הזחלים בצבע. יתרון ייחודי זה איפשר לנו לצלם אקסונים בשלב התפתחותי מוקדם שכמעט ולא הודגם על ידי GFP המתייג8.
בנוסף להדמיה בהילוך מהיר, למערכת האקספלנט יש יתרונות נוספים. לדוגמה, ניתן לנתק את עצבי האנטנה מהאקספלנט המנותח באופן חד צדדי או דו-צדדי בנקודות זמן התפתחותיות ספציפיות (שלב 2.8). זה מאפשר לחוקרים לחקור את הדרישה של אקסונים של ORN במיקוד של כל סוגי הנוירונים במעגל חוש הריח בשלבי התפתחות מובהקים. בפרט, מבחני ניתוק עצבי אנטנה חד-צדדיים, שלא ניתן להשיגם על ידי מניפולציה גנטית מסורתית, הובילו לתגלית מעניינת כי נדרשת אינטראקציה בין אקסונים דו-צדדיים של ORN לצורך מיקוד קונטרה-צדדי נכון של אקסונים של ORN8. יתר על כן, האקספלנט מתורבת ישירות במדיום במקום להיות מוטבע באגרוז, ולכן מאפשר אספקה מהירה ושטיפה של כמה מולקולות קטנות או תרופות. בהשוואה למניפולציה גנטית, לטיפול תרופתי יש את היתרונות של השפעה מהירה והפיכות של המניפולציה. היא מאפשרת לחוקרים להעריך כמה תהליכים חיוניים עבור תאים בשלבים התפתחותיים מאוחרים יותר על ידי עקיפת קטלניות של תאים או בעיות לא בריאות עקב הפרעה מכוננת באמצעות מניפולציות גנטיות. זה גם עוזר לדמיין של שינויים עדינים על ידי השוואה לפני ואחרי טיפול תרופתי, ואחרי שטיפת סמים.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
למחברים אין מה לחשוף.
Acknowledgments
אנו מודים לנ 'אוזל ור' היסינגר על עצתם לגבי תרבות ההסבר; מ. וגנר על העזרה הטכנית של המיקרוסקופיה הדו-פוטונית; D.J. Luginbuhl ליצירת זבובים מהונדסים; ד. פרידמן להצעות לניתוח תוכנה של פיג'י; י. גה לסיוע בעבודה בטיסה; ק. מקלפלין וק.ק.ל. וונג להערות על כתב היד. ל.ל. הוא חוקר במכון הרפואי ע"ש הווארד יוז. עבודה זו נתמכה על ידי מענקי המכונים הלאומיים לבריאות 1K99DC01883001 (ל- T.L.) ו- R01-DC005982 (ל- L.L.).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 20-hydroxyecdysone | Sigma | H5142 | |
| Chameleon Ti:Sapphire laser | Coherent | Coherent MRU X1 | |
| Fetal Bovine Serum | Thermo Fisher Scientific | 10082147 | |
| Human insulin | Thermo Fisher Scientific | 12585014 | |
| Imaging software | Prairie | ||
| Micro Scissors | World Precision Instruments | 501778 | |
| Minutien Pins | Fine Science Tools | 26002-10 | |
| Oxygen cylinder | Praxair | OX M-E | |
| Penicillin-Streptomycin | Thermo Fisher Scientific | 15140122 | |
| Schneider’s Drosophila Medium | Thermo Fisher Scientific | 21720024 | |
| SYLGARD 184 Silicone Elastomer | Thermo Fisher Scientific | NC0162601 | |
| Two-photon microscopy | Bruker | ||
| water immerse objective (20X) | Zeiss | 421452-9800-000 |
References
- Kolodkin, A. L., Tessier-Lavigne, M. Mechanisms and molecules of neuronal wiring: a primer. Cold Spring Harbor Perspective Biology. 3 (6), 001727 (2011).
- Vosshall, L. B., Stocker, R. F. Molecular architecture of smell and taste in Drosophila. Annual Review Neuroscience. 30, 505-533 (2007).
- Hong, W., Luo, L. Genetic control of wiring specificity in the fly olfactory system. Genetics. 196 (1), 17-29 (2014).
- Bentley, D., Caudy, M. Pioneer axons lose directed growth after selective killing of guidepost cells. Nature. 304 (5921), 62-65 (1983).
- Godement, P., Wang, L. C., Mason, C. A. Retinal axon divergence in the optic chiasm: dynamics of growth cone behavior at the midline. Journal of Neuroscience. 14 (11), Pt 2 7024-7039 (1994).
- Harris, W. A., Holt, C. E., Bonhoeffer, F. Retinal axons with and without their somata, growing to and arborizing in the tectum of Xenopus embryos: a time-lapse video study of single fibres in vivo. Development. 101 (1), 123-133 (1987).
- Ozel, M. N., Langen, M., Hassan, B. A., Hiesinger, P. R. Filopodial dynamics and growth cone stabilization in Drosophila visual circuit development. Elife. 4, 10721 (2015).
- Li, T., et al. Cellular bases of olfactory circuit assembly revealed by systematic time-lapse imaging. Cell. 184, 5107-5121 (2021).
- Chen, B. C., et al. Lattice light-sheet microscopy: Imaging molecules to embryos at high spatiotemporal resolution. Science. 346 (6208), 1257998 (2014).
- Liu, T. L., et al. Observing the cell in its native state: Imaging subcellular dynamics in multicellular organisms. Science. 360 (6386), (2018).
- Wang, K., et al. Rapid adaptive optical recovery of optimal resolution over large volumes. Nature Methods. 11 (6), 625-628 (2014).
- Kohl, J., et al. Ultrafast tissue staining with chemical tags. Proceedings of the National Academy of Science U. S. A. 111 (36), 3805-3814 (2014).
- Sutcliffe, B., et al. Second-Generation Drosophila Chemical Tags: Sensitivity, Versatility, and Speed. Genetics. 205 (4), 1399-1408 (2017).
- Grimm, J. B., Brown, T. A., English, B. P., Lionnet, T., Lavis, L. D. Synthesis of Janelia Fluor HaloTag and SNAP-Tag Ligands and Their Use in Cellular Imaging Experiments. Methods Molecular Biology. 1663, 179-188 (2017).
