Aqui, apresentamos protocolos para detectar óxido nítrico e seus derivados biologicamente relevantes usando ensaios baseados em chemiluminescência com alta sensibilidade.
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Artigo de método
Ensaios baseados em chemiluminescência para detecção de óxido nítrico e seus derivados de Autoxidação e Compostos Nitrosated
Neste artigo
Resumo
Resumo
A atividade de óxido nítrico (NO) in vivo é o resultado combinado de seus efeitos diretos, a ação de seus derivados gerados a partir da autoxidação no no, e os efeitos dos compostos nitrosos. Medir metabólitos NO é essencial para estudar nenhuma atividade tanto em níveis vasculares quanto em outros tecidos, especialmente nos ambientes experimentais onde o NO exógeno é administrado. Os ensaios de chemiluminescência à base de ozônio permitem medições precisas de metabólitos NO e NO em ambos os fluidos (incluindo plasma, homogeneizadores de tecido, culturas celulares) e misturas de gás (por exemplo, respiração exalada). NÃO reage com ozônio para gerar dióxido de nitrogênio em um estado animado. A consequente emissão de luz permite a fotodetecção e a geração de um sinal elétrico refletindo o teor NO da amostra. Alíquotas da mesma amostra podem ser usadas para medir metabólitos não específicos, como nitrato, nitrito, S-nitrosothiols e complexos ferro-nitrosilo. Além disso, o NO consumido pela hemoglobina livre de células também é quantificado com a análise de quimiluminescência. Uma ilustração de todas essas técnicas é fornecida.
Introdução
Desde que Os ganhadores do Salvador Moncada e do Nobel Robert Furchgott, Louis Ignarro e Ferid Murad identificaram o óxido nítrico (NO) como o anteriormente conhecido fator de relaxamento derivado da endotelia (EDRF), o papel central do NO foi estabelecido em vários mecanismos-chave que abrangem toda a biologia vascular, neurociências, metabolismo e resposta ao hospedeiro 1,2,3,4,5,6,7 . A administração exógena do GÁS NO tornou-se um tr....
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Protocolo
Os procedimentos indicados neste protocolo estão de acordo com o conselho de revisão do Hospital Geral de Massachusetts. As amostras de sangue utilizadas foram coletadas durante um estudo anterior e foram desidentifidas para a finalidade atual18.
NOTA: Consulte as instruções do fabricante para obter orientações específicas sobre as conexões ideais entre tubos e vidros que constituem o vaso de purga, a lavagem e a manutenção geral. As conexões precisam ser firmes e cuidadosamente feitas para não danificar os vidros. Identifique os componentes do vaso de purga de vidro: linha de entrada de gás, vaso de purga com jaquet....
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Resultados
O ensaio de Não-consumo por Hb livre de células foi utilizado em amostras contendo concentrações conhecidas de oxicodona livre de células (Figura 4). Como um heme de oxyHb stoichiometricamente libera uma molécula NO no ensaio, o oxyHb purificado sem células é usado para construir a curva de calibração para o ensaio (Figura Suplementar 3).
A relação dose-resposta entre hb livre de células (medida com um assiiz colorimétrico) e NO consumo em pacient.......
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Discussão
Devido à alta sensibilidade, ensaios baseados em chemiluminescência para a determinação de NO e compostos relacionados têm alto risco de contaminação nº2. Cada reagente (especialmente a solução de bloqueio NO 2) e dilutante (incluindo ddH2O) usado no experimento devem ser testados para seu conteúdo NO 2 para corrigir o sinal de fundo. O nitrito é extremamente reativo com meia-vida em sangue inteiro em torno de 10 minutos e rapidamente gera NO
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Divulgações
L.B. recebe apoio salarial da K23 HL128882/NHLBI NIH como principal investigador por seu trabalho em hemólise e óxido nítrico. A LB recebe bolsas de "Bolsas Rápidas para pesquisa COVID-19" no Mercatus Center da Universidade George Mason e na iNO Therapeutics LLC. A B.Y. é apoiada por subsídios de uma NHLBI/#R21HL130956 e do DOD/The Geneva Foundation (W81XWH-19-S-CCC1, Log DM190244). B.Y. recebeu patentes na MGH sobre a geração elétrica de óxido nítrico.
L.B. e B.Y. registraram pedido de patente para não entrega no número de solicitação pct da doença COVID-19: PCT/US2021/036269 arquivado em 7 de junho de 2021. A RWC recebe apoio salarial da Unitaid como principal pesquisadora para o desenvolvimento tecnológico voltada para o diagnóstico descentralizado da tuberculose em crianças localizadas em ambientes de baixo recurso.
Agradecimentos
Os protocolos relatados neste manuscrito foram possíveis pelas contribuições acumuladas de bolsistas anteriores do laboratório de Pesquisa de Anestesia em Cuidados Críticos do Dr. Warren Zapol. Reconhecemos a contribuição dos Drs. Akito Nakagawa, Francesco Zadek, Emanuele Vassena, Chong Lei, Yasuko Nagasaka, Ester Spagnolli e Emanuele Rezoagli.
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Materiais
| Nome | Empresa | Número de catálogo | Comentários |
|---|---|---|---|
| Ácido Acético | Sigma | 45754 | 500 mL - líquido |
| Antiespumante B Emulsão | Sigma | A5757 | 250 mL - líquido |
| DETA NONOate | Cayman | 82120 | 10 mg |
| Gibco DPBS (1x) sem cálcio, sem magnésio | ThermoFisher | 14190144 | 500 mL |
| Ácido Clorídrico 37% (1 M) | Sigma | 258148 | 500 mL - líquido |
| Iodo | SAFC | 207772 | 100 g - sólido |
| Kimwipes | Kimtech | 34155 | |
| Mercúrio (II) Cloreto ACS reagente> 99,5% | Sigma | 215465 | 100 g - sólido (dissolver em água) |
| Sistema de Purificação de Água Mili-Q | Millipore | ||
| Modelo 705 RN 50 μ L seringa | Hamilton | 80530 | Microlitro |
| modelo 802 N 25 μ Seringa L | Hamilton | 84854 | Seringa de microlitro |
| N-etilmaleimida | Sigma | 4260 | 25 g - |
| de óxido nítrico cristalino + pacote de software - Recipiente de purga | Detector de quimioluminescência | Zysense | NOA 280i |
| Nonidet p-40 (NP-40) | ThermoFisher | 85125 | 10% - 500 mL |
| de hexacianoferrato de potássio (III) ACS reagente≥ 99% | Sigma | 244023 | 100 g - pó |
| de iodeto de potássio ACS reagente> 99% | Sigma | 221945 | 100 g - cristal sólido |
| de nitrito de potássio. Para análise EMSURE ACS | Supelco | 105067 | 250 g - cristalino |
| PowerGen 125 | Fisher Scientific | 14-359-251 | Homogeneizador Mecânico |
| RV3 Bomba de palhetas rotativas de dois estágios | Edwards | A65201906 | - Empacotada com analisador |
| Heparina sódica - BD Hemogard Clo | BD Biosciences | BD367871 | 75 unidades USP |
| Reagente ACS anidro de hidróxido de sódio ≥ 97% | Sigma | 795429 | 1 kg - pellets |
| Nitrato de sódio ACS reagente ≥ 99% | Sigma | 221341 | 500 g - pó |
| Nitrito de sódio ≥ 99% | Sigma | S2252 | 500 g - |
| sulfanilamida cristalina ≥ 98% | Sigma | S9251 | 100 g - sólido |
| Cloreto de vanádio (III) Sigma | 112393 | 25 g - sólido - Cuidado (exotérmico) | |
| Papel de Filtro Whatman 1 | Sigma | WHA10010155 |
Referências
- Palmer, R. M. J., Ferrige, A. G., Moncada, S. Nitric oxide release accounts for the biological activity of endothelium-derived relaxing factor. Nature. 327 (6122), 524-526 (1987).
- Furchgott, R. F.
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Reimpressões e permissões
