Summary
В данной статье описан хорошо зарекомендовавший себя и воспроизводимый анализ лектиновых пятен для всего препарата сетчатки и протоколы, необходимые для количественного измерения сосудистых параметров, часто изменяющихся при пролиферативных и непролиферативных ретинопатиях.
Abstract
Ретинопатии представляют собой гетерогенную группу заболеваний, которые поражают нейросенсорную ткань глаза. Для них характерны нейродегенерация, глиоз и прогрессирующее изменение сосудистой функции и структуры. Хотя начало ретинопатий характеризуется тонкими нарушениями зрительного восприятия, модификации в сосудистом сплетении являются первыми признаками, обнаруженными клиницистами. Отсутствие или наличие неоваскуляризации определяет, классифицируется ли ретинопатия как непролиферативная (NPDR) или пролиферативная (PDR). В этом смысле несколько животных моделей пытались имитировать специфические сосудистые особенности каждой стадии, чтобы определить основные механизмы, участвующие в изменениях эндотелия, гибели нейронов и других событиях, происходящих в сетчатке. В этой статье мы предоставим полное описание процедур, необходимых для измерения сосудистых параметров сетчатки у взрослых и мышей с ранними родами на послеродовой день (P)17. Мы подробно расскажем о протоколах проведения окрашивания сосудов сетчатки изолектином GSA-IB4 в целых креплениях для последующей микроскопической визуализации. Также предусмотрены ключевые этапы обработки изображений с помощью программного обеспечения Image J Fiji, поэтому считыватели смогут измерять плотность сосудов, диаметр и извилистость сосудов, ветвление сосудов, а также аваскулярные и неоваскулярные области. Эти инструменты очень полезны для оценки и количественной оценки сосудистых изменений как при непролиферативных, так и при пролиферативных ретинопатиях.
Introduction
Глаза питаются двумя артерио-венозными системами: сосудисто-сосудистой, внешней сосудистой сетью, орошающей пигментированный эпителий сетчатки и фоторецепторы; и сосудисто-нервно-ретинальные сосуды, которые орошают слой ганглиозных клеток и внутренний ядерный слой сетчатки1. Сосудистая система сетчатки представляет собой организованную сеть сосудов, которые доставляют питательные вещества и кислород к клеткам сетчатки и собирают отходы для обеспечения надлежащей визуальной сигнальной трансдукции. Эта сосудистая система имеет некоторые отличительные особенности, в том числе: отсутствие автономной иннервации, регуляция сосудистого тонуса внутренними механизмами сетчатки и наличие сложного сетчаточно-гематоэнцефалического барьера2. Поэтому сосудистая система сетчатки была в центре внимания многих исследователей, которые широко изучали не только васкулогенез во время развития, но и изменения и патологический ангиогенез, которым подвергаются эти сосуды при заболеваниях3. Наиболее распространенными сосудистыми изменениями, наблюдаемыми при ретинопатиях, являются дилатация сосудов, неоваскуляризация, потеря сосудистой арборизации и деформация магистральных сосудов сетчатки, что делает их более зигзагообразными4,5,6. Одно или несколько из описанных изменений являются самыми ранними признаками, которые будут обнаружены клиницистами. Визуализация сосудов обеспечивает быстрый, неинвазивный и недорогой метод скрининга7. Обширное изучение изменений, наблюдаемых в сосудистом дереве, определит, является ли ретинопатия непролиферативной или пролиферативной, и дальнейшее лечение. Непролиферативные ретинопатии могут проявляться аберрантной морфологией сосудов, снижением плотности сосудов, бесклеточными капиллярами, гибелью перицитов, макулярным отеком и др. Кроме того, пролиферативные ретинопатии также развивают повышенную проницаемость сосудов, внеклеточное ремоделирование и образование сосудистых пучков к полости стекловидного тела, которые легко разрушаются или индуцируют отслоение сетчатки8.
После обнаружения ретинопатию можно контролировать через ее сосудистые изменения9,10. За прогрессированием патологии можно следить через структурные изменения сосудов, которые четко определяют стадии заболевания11. Количественная оценка сосудистых изменений в этих моделях позволила соотнести изменения сосудов и гибель нейронов и протестировать фармакологическую терапию для пациентов в разных фазах заболевания.
В свете вышеуказанных утверждений мы считаем, что распознавание и количественная оценка сосудистых изменений являются фундаментальными в исследованиях ретинопатий. В этой работе мы покажем, как измерять различные сосудистые параметры. Для этого мы будем использовать две модели животных. Одним из них является модель мышиной ретинопатии, индуцированная кислородом12, которая имитирует ретинопатию недоношенных и некоторые аспекты пролиферативной диабетической ретинопатии13,14. В этой модели мы будем измерять аваскулярные области, неоваскулярные области, а также дилатацию и извилистость магистральных сосудов. В нашей лаборатории была разработана модель мыши метаболического синдрома (MetS), которая индуцирует непролиферативную ретинопатию15. Здесь мы оценим плотность сосудов и ветвление.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
С мышами C57BL/6J обращались в соответствии с руководящими принципами ArVO Statement for the Use of Animals in Ophthalmic and Vision Research. Экспериментальные процедуры были разработаны и одобрены Институциональным комитетом по уходу за животными и их использованию (CICUAL) факультета химических наук Национального университета Кордовы (Res. HCD 1216/18).
1. Приготовление буферных растворов и реагентов
- Приготовление 1x фосфатного буферного физиологического раствора (PBS): Добавьте 8 г хлорида натрия (NaCl), 0,2 г хлорида калия (KCl), 14,4 г дигидрата динатрия-водород-фосфата (Na2HPO4 2H2O) и 0,24 г калия-дигидрофосфата (KH2PO4) до 800 мл дистиллированной воды. Перемешайте раствор до полного растворения солей. Отрегулируйте рН до 7,4 с хлоридной кислотой (HCl) и отрегулируйте объем до 1 л с дополнительной дистиллированной водой. Отфильтруйте раствор и храните при температуре 4 °C.
- Приготовление 4% параформальдегида (PFA): Добавьте 40 г твердого PFA к 800 мл свежеприготовленного PBS. Размешайте раствор в нагревательной пластине при постоянной температуре 60 °C. Добавьте 1 M гидроксида натрия (NaOH) до полного растворения PFA, проверяя, что pH поддерживается в диапазоне 7,2-7,4. Добавьте объем до 1 000 мл с помощью PBS и перемешайте. Выключите нагревательную пластину и фильтруйте раствор, когда его температура ниже 35 °C. Хранить раствор при температуре 4 °C до 3 дней.
ВНИМАНИЕ: PFA вреден при проглатывании или вдыхании и, вероятно, является мутагенным соединением. Используйте перчатки и маску для лица в течение всего процесса и работайте в кабине безопасности. - Приготовление 1x Tris-буферного физиологического раствора (TBS): Добавьте 6,1 г Tris и 9 г NaCl к 800 мл дистиллированной воды. Перемешайте раствор до полного растворения солей. Отрегулируйте pH до 7,4 с HCl и отрегулируйте объем до 1 л с помощью дополнительной дистиллированной воды. Отфильтруйте раствор и храните при температуре 4 °C.
- Приготовление TBS- 0,1% Triton X-100: Добавьте 0,1 мл TritonX-100 до 100 мл TBS. Осторожно перемешайте и храните при 4 °C в течение 1 недели.
ПРИМЕЧАНИЕ: Поскольку Тритон является очень плотным моющим средством, слегка отрежьте клемму наконечника для лучшего пипетирования. - Приготовление TBS-5%-бычьего сывороточного альбумина (BSA)-0,1% Тритона-X-100: Взвесить 5 г BSA и добавить TBS-0,1% раствор тритона X-100 до конечного объема 100 мл. Осторожно перемешать. Аликвот и хранить при -20 °C до 2 месяцев.
- Изолектин GSA-IB4 Alexa fluor-488 конъюгат (Isolectin GSA-IB4): Вес 36,75 мг дигидрата хлорида кальция (CaCl2·2H2O) и добавьте его в 500 мл свежеприготовленного PBS. Перемешайте раствор с перемешиванием. Пипетку 500 мкл раствора CaCl2/PBS и добавляют ее во флакон, содержащий 500 мкг лиофилизированного порошка изолектина GSA-IB4. Аккуратно перемешать и аликвотировать раствор в тубах по 0,5 мл. Храните их при температуре -20 °C в защищенном от света месте.
- Поли (виниловый спирт) в глицерине / Трисе: взвесьте 2,4 г поли(винилового спирта), добавьте 6 г глицерина и осторожно перемешайте. Затем добавьте 6 мл воды и продолжайте помешивать в течение нескольких часов при комнатной температуре. Добавьте 12 мл предварительно нагретого 0,2 М раствора Триса (рН: 8,5) и нагрейте при постоянной температуре 50 °C в течение 10 мин и периодически перемешайте. Наконец, центрифугируют раствор при 5000 х г в течение 15 мин для осветления.
ПРИМЕЧАНИЕ: Дайте раствору остыть при комнатной температуре, аликвотируйте его и храните при -20 °C.
2. Флуоресцентное окрашивание лектином
- После жертвоприношения мышей путем вдыхания углекислого газа (CO2) энуклеируйте глаза ножницами16. Зафиксируйте энуклеированные глаза свежеприготовленным 4% PFA в течение 1 ч при комнатной температуре (RT).
ПРИМЕЧАНИЕ: Фиксация также может быть выполнена путем инкубации глаз в 4% PFA в течение ночи (ON) при 4 °C. Мыши были принесены в жертву в соответствии с руководящими принципами Заявления ARVO об использовании животных в офтальмологических исследованиях и исследованиях зрения и Институционального комитета по уходу за животными и их использованию (CICUAL) факультета химических наук Национального университета Кордовы (Res. HCD 1216/18). - Под рассекающим микроскопом удаляют роговицы ножницами, разрезая вдоль лимбуса и рассекая всю сетчатку. Отбросьте передний сегмент глаза, а затем отделите сетчатку от RPE-сосудистой оболочки.
ПРИМЕЧАНИЕ: Обязательно удалите оставшийся мусор и подъязычные сосуды из сетчатки щипцами. - Поместите сетчатку в трубки по 200 мкл. Затем блокируют и пермеабилизируют сетчатку в 100 мкл раствора трис-буферного физиологического раствора (TBS), содержащего 5% бычьего сывороточного альбумина (BSA) и 0,1% тритона-X-100 в течение 6 ч при 4 °C с мягким перемешиванием в шейкере.
ПРИМЕЧАНИЕ: Этот шаг может быть выполнен в течение 2 ч на RT. - Затем переверните трубку, чтобы поместить сетчатку в колпачок и удалите блокирующий раствор пипеткой.
- Добавьте 100 мкл раствора, содержащего 0,01 мкг/мкл изолектина GSA-IB4 (GSA-IB4). Оберните трубки алюминиевой фольгой, чтобы защитить образцы от света. Инкубировать сетчатку раствором лектина ON при 4 °C или в течение 2 ч при RT с мягким перемешиванием в шейкере.
- Промыть сетчатку 100 мкл TBS, содержащей 0,1% Triton-X-100, в течение 20 мин с мягким перемешиванием в шейкере. Для правильного мытья поместите сетчатку в колпачок трубки, перевернув ее. Верните трубку в стоячее положение и извлеките среду, оставшуюся в контейнере. Повторите этот шаг три раза.
- Поместите сетчатку в слайд и добавьте каплю PBS. Под рассекающим микроскопом выполните четыре одинаково удаленных разреза от краев сетчатки в сторону зрительного нерва.
- Чтобы развернуть лепестки сетчатки, используйте щипцы или небольшие кусочки фильтровальной бумаги. Убедитесь, что сторона фоторецептора обращена вниз.
- Удалите оставшуюся PBS слайда с помощью фильтровальной бумаги. Затем добавьте монтажную среду (Поли(виниловый спирт) в глицерине/Трисе) и крышку. Дайте высохнуть в течение 1 ч на RT.
- Храните слайды при температуре 4 °C, защищенные от света.
ПРИМЕЧАНИЕ: Сетчатка также может храниться в PBS при 4 °C до конфокальной микроскопической визуализации.
3. Визуализация конфокальной микроскопии и получение микрофотографии
- Перед визуализацией инкубируйте слайды в течение 10 минут на RT, покрытом светом.
- В конфокальном микроскопе поместите слайд в пластину лицевой стороной вниз.
- Сфокусируйте верхнее сплетение сосудистой системы сетчатки и выберите область для начала получения изображения.
- Установка общих параметров лазера в программном обеспечении: Длина волны: 488 нм; Интенсивность лазера; ВН; Смещение; Прибыль.
ПРИМЕЧАНИЕ: Интенсивность лазера, PMT, смещение и усиление могут варьироваться в зависимости от условий и использования лампы. Оптимальные настройки обеспечивают четкое изображение сосудов, избегая насыщения в чувствительности фотоумножителя трубки, имеющей линейную зависимость от флуоресцентного сигнала. - Установите другие параметры сбора: Режим; Размер; Объектив, без масштабирования; Нет Кальмана; Размер шага.
ПРИМЕЧАНИЕ: Для визуализации контрольных и экспериментальных образцов должны использоваться идентичные условия сбора. - Установите координаты по осям x и y: сканирование сетчатки в фокусе 2x. Если область показывает сосуды, выделите ее, дважды щелкнув область, чтобы отметить ее для последующего получения изображения.
ПРИМЕЧАНИЕ: Настоятельно рекомендуется выбирать область сетчатки, следуя верхнему сосудистому сплетению, так как флуоресценция более крупных сосудов выше. - Переместите сетку к соседнему квадрату, сфокусируйте сетчатку и выберите область, если она соответствует. Повторяйте этот шаг до тех пор, пока выбранная область не составит всю сетчатку.
- Выберите одну область и задайте координаты по оси z, чтобы определить экстент толщины для сканирования. Для этого визуализируйте сетчатку в фокусе 2х; с помощью микрометра перейдите в верхнюю часть сетчатки и нажмите «Установить » в начальном положении. Затем переместитесь в нижнюю часть сетчатки и нажмите «Установить » в конечном положении.
- Повторите шаг 3.8 на каждой области, выбранной в сетке.
ПРИМЕЧАНИЕ: Чтобы глубоко проверить отсканированную область, нажмите Go в начальном положении. Если сосуды все еще визуализированы, перенастройте положение, переместив микрометр, а затем нажмите «Установить». Повторите процесс в позиции End. - Инициализируйте автоматическое сканирование.
- После завершения процесса сканирования откройте изображение.
- Выберите формат Series , чтобы записать изображение как мозаику и сохранить его с предпочтительным расширением. Наконец, сшитое изображение будет показано на экране.
4. Обработка изображений
- В программном обеспечении ImageJ FIJI перейдите в строку меню и нажмите «Файл > Открыть». Выберите изображение для обработки. В окне Параметры импорта биоформатов выберите Отображение метаданных OME-XML и нажмите кнопку ОК.
ПРИМЕЧАНИЕ: Изображения с похожим именем должны быть сохранены в отдельных папках. - В окне Метаданные OME найдите информацию о размере пикселя с именами PhysicalSizeX, PhysicalSizeY и PhysicalSizeZ. Скопируйте эти данные.
- Для калибровки изображения перейдите в строку меню и выберите Image > Свойства. Скопируйте информацию об изображении на шаге 4.2 и нажмите OK. Изображение открывается в виде окна с несколькими фотографиями, каждая из которых представляет собой микрофотографы, полученные на оси z.
- Присвойте изображению предпочтительный лут, чтобы придать цвет флуоресцентной этикетке. Для этого перейдите в строку меню и нажмите на значок LUT .
- Чтобы визуализировать все стеки в одном изображении, перейдите в строку меню и выберите Image > Stacks > Z Project.
- В появившемся окне Z Projection выберите все стеки, в которых визуализируются сосуды. В поле Тип проекции выберите «Средняя интенсивность» и нажмите «ОК».
ПРИМЕЧАНИЕ: Результат суммы стеков будет показан на новом изображении с именем AVG (имя изображения). - Отрегулируйте яркость и контрастность в результирующем изображении, чтобы уменьшить фон и выделить сосуды. Перейдите в строку меню и нажмите «Изображение> «Настроить> «Яркость/Контрастность». В окнах B и C перемещайте стержни до тех пор, пока не будет наблюдаться лучшая интенсивность. Нажмите «Применить» и сохраните изменения.
- Скопируйте параметры, выбранные для параметров Яркость/Контрастность; они должны быть одинаковыми для всех изображений.
- Перед количественной оценкой изображения определите параметры, которые будут измеряться. В строке меню выберите Анализ > Набор измерений. В процедурах, описанных здесь, необходимо будет получить Площадь и Периметр (это в конечном итоге также необходимо для измерения расстояний). Нажмите OK.
- Загрузите плагин, необходимый для количественной оценки плотности сосудов17, и следуйте инструкциям по установке, предоставленным плагином.
- Продолжайте с количественной оценкой конкретного сосудистого параметра.
5. Количественная оценка аваскулярных областей
- В строке меню выберите инструмент «Палочка». Выберите область сетчатки, в которой отсутствуют сосуды.
ПРИМЕЧАНИЕ: Большие или меньшие области могут быть выбраны в зависимости от допуска. Чтобы настроить допуск, дважды нажмите на значок инструмента палочки. Используемый режим: Наследие. - Нажмите букву T на клавиатуре, чтобы записать выбранную область в менеджере ROI. Повторите шаги 5.1 и 5.2 со всеми аваскулярными областями сетчатки.
- Нажмите « Измерить» в менеджере ROI, чтобы получить информацию об аваскулярной области. Программа отобразит новое окно с необходимой информацией. Скопируйте данные в другую программу или сохраните файл.
ПРИМЕЧАНИЕ: На некоторых изображениях можно предпочесть выбрать аваскулярные области вручную. В этом случае выберите инструмент «Выделение полигонов», рисуйте короткие расстояния вокруг аваскулярной области и нажимайте на изображение, когда новое расстояние вот-вот начнется. Закройте выбранную область, нажав на первую точку. - Повторите шаги 5.1, 5.2 и 5.3, чтобы измерить общую площадь сетчатки.
- Рассчитайте аваскулярную область сетчатки как сумму всех измеренных аваскулярных областей, деленную на общую площадь сетчатки.
6. Количественная оценка неоваскулярных областей
- В строке меню выберите инструмент «Палочка».
- Увеличьте масштаб изображения, чтобы лучше визуализировать неососуды. Выделите неососуды один за другим с помощью инструмента «Палочка».
ПРИМЕЧАНИЕ: Отрегулируйте допуск не выше 20, чтобы обеспечить выбор одного неососуда. Этот уровень допуска должен оставаться постоянным во время всех количественных показателей изображения. - Нажмите букву T на клавиатуре, чтобы записать выбранную область в менеджере ROI. Повторите шаги 6.1 и 6.2 со всеми неоваскулярными областями сетчатки.
- Нажмите «Измерить» в менеджере ROI, чтобы получить данные о области. Программа отобразит новое окно с необходимой информацией. Скопируйте данные в другую программу или сохраните файл.
- Повторите шаги 6.1, 6.2 и 6.3, чтобы количественно оценить общую площадь сетчатки.
- Рассчитайте неоваскулярную область сетчатки как сумму всех измеренных площадей неосколков, деленную на общую площадь сетчатки.
7. Количественная оценка диаметра сосуда
- В строке меню выберите инструмент «Прямая линия».
- Увеличьте изображение, чтобы лучше визуализировать стену сосуда. Выполните три поперечные линии к основному судну перед первой веткой. Это необходимо сделать, проведя линию от границы одной стенки сосуда к противоположной.
ПРИМЕЧАНИЕ: Линия должна быть идеально перпендикулярна стенке сосуда, чтобы избежать ошибок количественной оценки. - Нажмите букву T на клавиатуре, чтобы записать выбранную область в менеджере ROI. Повторите шаги 7.1 и 7.2 на всех судах, которые необходимо количественно оценить.
- Нажмите «Измерить» в менеджере ROI, чтобы получить данные о расстоянии. Программа отобразит новое окно с необходимой информацией. Скопируйте данные в другую программу или сохраните файл.
8. Количественная оценка извилистости судна
- В строке меню щелкните правой кнопкой мыши значок инструмента «Прямая линия» и выберите «Сегментированная линия» или «Линия от руки». Проведите линию внутри сосуда от зрительного нерва до первого разветвления сосуда после сосудистой формы.
ПРИМЕЧАНИЕ: Линия должна следовать за сосудистой формой, чтобы избежать ошибок количественной оценки. - Нажмите букву T на клавиатуре, чтобы записать выбранную область в менеджере ROI.
- В строке меню выберите инструмент «Прямая линия». Проведите линию от зрительного нерва до первого разветвления сосуда.
- Нажмите букву T на клавиатуре, чтобы записать выбранную область в менеджере ROI.
- Нажмите «Измерить» в менеджере ROI, чтобы получить данные о расстояниях. Программа отобразит новое окно с необходимой информацией. Скопируйте данные в другую программу или сохраните файл.
- Рассчитайте индекс извилистости следующим образом: расстояние, полученное с помощью сегментированной линии, деленное на расстояние, полученное с помощью прямой линии.
9. Количественная оценка сосудистых ветвей
- С помощью овального инструмента строки меню определите область, применяемую одинаково ко всем экспериментальным условиям. Выбранная область должна представлять собой концентрический круг, нарисованный вокруг зрительного нерва.
- Нажмите букву T на клавиатуре, чтобы записать выбранную область в менеджере ROI.
ПРИМЕЧАНИЕ: В этом случае рекомендуется сохранить РЕНТАБЕЛЬНОСТЬ ИНВЕСТИЦИЙ, так как количественная оценка медленная, и во всех изображениях должна использоваться одинаковая рентабельность инвестиций. Для этого в ROI Manager нажмите на MORE > Сохранить. - Вручную подсчитайте количество первичных ветвей, возникающих из основных сосудов внутри зоны выбора.
- Повторите шаги 9.2 и 9.3 в соседних областях, сохраняя критерии зрительного нерва-периферии.
10. Количественная оценка плотности сосудов
- Преобразуйте изображение в 8-битный режим.
- Перейдите в плагины в строке меню, выберите Анализ сосудов > плотность сосудов.
- Определите область с помощью инструмента «Квадрат» строки меню, где необходимо измерить плотность сосуда. Нажмите OK.
- Программа отобразит новое окно с необходимой информацией. Скопируйте данные в другую программу или сохраните файл.
- Повторите шаги 10.2, 10.3 и 10.4 в соседних областях, сохраняя рентабельность инвестиций, но размещая ее девять раз, охватывая периферию и центр всей сетчатки.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Как описано в разделе протокола, из одного флуоресцентного окрашивания можно получить морфологию сосудов и количественно оценить несколько интересующих параметров. Поиск конкретного изменения будет зависеть от типа изучаемой ретинопатии. В этой статье аваскулярные и неоваскулярные области, извилистость и дилатация были оценены в мышиной модели пролиферативной ретинопатии, тогда как ветвление и плотность сосудов были проанализированы в мышиной модели MetS, которая индуцирует непролиферативную ретинопатию.
В первом экспериментальном примере была использована мышиная модель кислородно-индуцированной ретинопатии (OIR), которая напоминает ретинопатию недоношенных и некоторые особенности пролиферативной стадии диабетической ретинопатии. В этой модели пометы содержатся вместе с кормящей матерью в гипероксичной камере с послеродового дня (P)7 до P1218. Интравитреальные инъекции выполняли при Р12 для определения эффективности препарата в качестве антиангиогенного (состояние, называемое лечением). Мышей приносили в жертву в P17, точке времени формирования максимальных неососудов19. Мыши, которым вводили транспортное средство, использовались в качестве контроля. Оба образца были зафиксированы и окрашены изолектином GSA-IB4 вместе. После конфокального получения изображения были проанализированы с помощью программного обеспечения ImageJ FIJI, как указано выше. С модулем Stitching, интегрированным в Confocal Microscope, все крепление наблюдалось как уникальное изображение (рисунок 1). При Р17 можно наблюдать гиалоидную сосудистую систему, преходящую сосудистую систему, необходимую во время внутриутробной жизни (рисунок 1, белые стрелки)20.
Как следствие избыточного обеспечения кислородом в гипероксичной камере, мыши OIR останавливают физиологическое развитие сосудов и генерируют аваскулярные области в сетчатке. Затем аваскулярные области определяются как зоны, в которых отсутствуют кровеносные сосуды сетчатки (рисунок 2). Из полученных изображений аваскулярные области могут быть количественно определены как сумма областей без сосудов, разделенных на общую площадь сетчатки. Участки с механическими повреждениями также показывают отсутствие сосудов. Чтобы выявить поврежденные участки, проанализируйте целостность нейронных слоев с помощью пятна Hoechst.
Аваскулярные области сетчатки избегают доставки кислорода и, следовательно, устанавливается сильный проангиогенный ответ, вызывающий неоваскуляризацию16. Неовесили представляют собой сосуды малого калибра, которые происходят из ранее существовавшего сосуда верхнего сосудистого сплетения. Их структура дезорганизована, поэтому неососуды растут пучками по направлению к стекловидной полости21. Мы рассчитали площадь, занимаемую пучками неосколков, путем количественной оценки неоваскулярной области сетчатки, разделенной на общую площадь сетчатки (рисунок 3). Поскольку форма и размер неосуходов варьируются, иногда они могут выглядеть похожими на обломки и артефакты. Чтобы отличить неосмешники, убедитесь, что хохолок растет из зрелого сосуда.
Дилатация сосудов и извитость являются двумя другими частыми изменениями, которые оказывают негативное влияние на сосудистую биологию, поскольку они вызывают турбулентное кровообращение. Для анализа дилатации мы измерили диаметр основных сосудов на трех высотах перед первой ветвью22,23 (рисунок 4). Исследователи должны определить заранее определенное расстояние для измерения диаметра сосуда, чтобы уменьшить изменчивость результатов. В идеале самая дальняя точка от зрительного нерва должна составлять около 300 мкм. Мы предлагаем провести анализ, а затем взять в среднем не менее шести мышей на состояние.
Что касается извилистости, мы измеряем расстояние, покрываемое основными сосудами, следующими за его формой, относительно прямого расстояния между зрительным нервом и первой точкой ветвления24 (рисунок 5). Как мы видим на изображении, существует неоднородность в извилистости основных сосудов. Для получения репрезентативного результата необходимо количественно оценить не менее шести мышей на каждое состояние.
Последние параметры, ветвление и плотность сосудов, были проанализированы в модели MetS, демонстрирующей непролиферативную ретинопатию. В MetS нарушения как липидов, так и углеводов связаны с дисфункцией и гибелью перицитов сетчатки и эндотелиальных клеток, что приводит к образованию бесклеточных капилляров или уменьшению ветвления сосудов25. В нашей модели мышей ApoE-KO кормили фруктозой, добавленной в питьевую воду, в концентрации 10% мас./об. Контрольные животные только что получили водопроводную воду. После 4 месяцев диеты мышей приносили в жертву, а сетчатку обрабатывали, как указывалось ранее. Для измерения ветвления сосудов мы определили площадь количественного определения, нарисовав концентрическую окружность, а затем посчитали одну за другой первичные ветви, возникающие из главного центрального сосуда (рисунок 6).
Из полученных изображений плотность сосудов количественно определялась как площадь, занимаемая сосудами, деленная на площадь ROI (квадрат 0,015 мм2, см. сплющение на рисунке 7), которая была расположена в разных местах на каждой микрофотографии, как это было объяснено в разделе протокола. Избегайте количественной оценки областей с механическими повреждениями (рисунок 7, белые стрелки). Если есть более двух областей с проколами, сетчатку необходимо отбросить.
Рисунок 1: Сосудистое окрашивание всего крепления сетчатки, помеченного изолектином GSA-IB4: Репрезентативные конфокальные изображения сетчатки мышей P17 OIR, вводимых с помощью транспортного средства или лечения при P12. Флуоресцентное окрашивание проводилось в цельных маунт-сетчатках изолектином GSA-IB4 Alexa 488 согласно протоколу. Показаны аваскулярные области (AV) и неоваскулярные области (NV). Шкала: 500 мкм. Белые стрелки показывают остаток гиалоидной сосудистой системы. Желтые стрелки показывают неполные области сканирования во время получения конфокального изображения. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 2: Количественная оценка аваскулярных областей: (A) Репрезентативные изображения целых маунтовых сетчаток на P17, показывающие окрашивание сосудов GSA-IB4 у мышей, получающих OIR-транспортное средство и OIR-лечение. Участки с вазооблитерацией обозначены желтым цветом. Шкала бара: 500 мкм. (B) Av-область (%) была количественно определена как отношение центральной аваскулярной области ко всей области сетчатки. Для статистического сравнения использовался двуххвостый непарный т-тест. Данные представлены как среднее значение ± SEM. *** p < 0,001. По крайней мере, шесть животных были использованы для каждого состояния в исследуемом времени выживания. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 3: Количественная оценка неоваскулярных областей: (A) Репрезентативные изображения цельной сетчатки маунта на P17, показывающие окрашивание сосудов GSA-IB4 у мышей, прошедших лечение OIR-транспортным средством и OIR. Участки с неоваскуляризацией обозначены белым цветом. Шкала: 500 мкм. (B) Площадь NV (%) была количественно определена как отношение площади, занимаемой неосеменами, ко всей площади сетчатки. Для статистического сравнения использовался двуххвостый непарный т-тест. Данные представлены как среднее значение ± SEM. *** p < 0,001. По крайней мере, шесть животных были использованы для каждого состояния в исследуемом времени выживания. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 4: Количественная оценка дилатации сосудов: (A) Репрезентативные изображения целых сетчаток маунта на P17, показывающие окрашивание сосудов GSA-IB4 у мышей, получающих OIR-транспортное средство и лечение OIR. Левые панели: ROI, выбранные для количественной оценки. Правые панели: масштабирование ROI, показывающее прямые линии, выполняемые в основном сосуде для измерения диаметра сосуда. Три линии были прослежены поперечно до судна и усреднены. Шкала бара: 100 мкм. (B) Диаметр сосуда (%) был количественно определен как средний диаметр, измеренный в крупных сосудах сетчатки. Для статистического сравнения использовался двуххвостый непарный т-тест. Данные представлены как среднее ± SEM. *p < 0,05. По крайней мере, шесть животных были использованы для каждого состояния в исследуемом времени выживания. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 5: Определение индекса извитости: (A) Репрезентативные изображения всей сетчатки в P17, показывающие окрашивание сосудов GSA-IB4 у мышей, обработанных OIR и OIR. Левые панели: ROI, выбранные для количественной оценки. Центральные панели: масштабирование ROI, показывающее сегментированные линии, прослеживаемые в главном сосуде от зрительного нерва до первой точки ветвления. Правые панели: масштабирование ROI, показывающее прямые линии, проложенные в главном сосуде от зрительного нерва до первой точки ветвления. Шкала: 100 мкм. (B) Индекс извилистости был получен путем деления расстояния сегментированной линии на расстояние прямой линии. Для статистического сравнения использовался двуххвостый непарный т-тест. Данные, представленные как средние ± SEM. ns, несущественные. По крайней мере, шесть животных были использованы для каждого состояния в исследуемом времени выживания. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 6: Количественная оценка ветвления сосудов: (A) Репрезентативные изображения целых сетчаток маунта, показывающие сосудистое окрашивание изолектина GSA-IB4 у мышей, получавших ApoE-KO и ApoE-KO + фруктозу. Области круговой количественной оценки были определены желтым цветом. Шкала: 100 мкм, 100-кратное увеличение. (B) Число ветвей было количественно определено как число первичных ветвей от главного сосуда, начиная с зрительного нерва до периферии. Для статистического сравнения использовался двуххвостый непарный т-тест. Данные, представленные как средние ± SEM. ns, несущественные. По крайней мере, шесть животных были использованы для каждого состояния. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 7: Количественная оценка плотности сосудов: (A) Репрезентативные изображения всей сетчатки маунта, показывающие сосудистое окрашивание изолектина GSA-IB4 у мышей, получавших ApoE-KO и ApoE-KO + фруктозу. Площадь квадрата 0,015 мм2 была определена желтым цветом. Шкала: 100 мкм, 100-кратное увеличение. (B) Плотность сосудов была количественно определена как отношение сосудистой площади к общей площади ROI, которая была расположена девять раз в разных местах в каждой микрофотографии. Белыми стрелками показаны участки с механическими повреждениями. Для статистического сравнения использовался двуххвостый непарный т-тест. Данные, представленные как средние ± SEM. ns, несущественные. По крайней мере, шесть животных были использованы для каждого состояния. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Животные модели ретинопатий являются мощными инструментами для изучения развития сосудов, ремоделирования или патологического ангиогенеза. Успех этих исследований в этой области зависит от легкого доступа к тканям, что позволяет выполнять широкий спектр методов, предоставляя данные от in vivo и посмертных мышей26,27. Кроме того, была обнаружена большая корреляция между исследованиями in vivo и клиническим анализом, обеспечивающая надежную прослеживаемость и надежность этих моделей28. В этой статье мы представляем простое и достоверное описание шагов по характеристике сосудистой сети в мышиных моделях сосудистых заболеваний сетчатки. В литературе читатели найдут другие возможные параметры для измерения и параллельные подходы к количественной оценке выбранных здесь. Скомпилированные протоколы имеют много преимуществ перед другими, потому что они воспроизводимы, и они просто требуют свободного программного обеспечения для выполнения анализа (Image J Fiji).
Более того, эти протоколы легко выполняются студентами, которые не имеют обширных знаний о программе и большинство измерений не нуждаются в дополнительных плагинах (кроме плотности сосудов).
Метод экстракции образцов и флуоресцентного окрашивания прост и краток29. Очень важно работать со свежими сетчатками, хотя они могут храниться при 4 °C в PBS с ингибиторами бактериального роста. Поскольку ткань тонкая и мягкая, то старые образцы часто разрушаются во время инкубации или при развертывании образца перед установкой. Кроме того, чрезмерная фиксация с 4% PFA делает сетчатку чрезмерно жесткой и хрупкой, но это не влияет на окрашивание лектина. Окрашивание изолектином GSA-IB4 позволяет визуализировать всю сосудистую сеть на каждом слое, включая неососуды и пролиферирующие эндотелиальные клетки. Другие маркеры, такие как CD 31, требуют инкубации образца с концентрированными антителами, и они имеют больший фон. С другой стороны, в ангиографии флуоресцентный краситель имеет тенденцию диффундировать из сосудов, что увеличивает вариабельность калибра сосуда и количественное определение изгиба. Одним из недостатков изолектина GSA-IB4 является то, что он также может маркировать клетки микроглии30. Следует соблюдать осторожность при проведении интравитреальных инъекций или других экспериментальных процедур, которые вызывают чрезмерную инфильтрацию, поскольку клетки микроглии могут образовывать агломераты.
Получение изображения может быть выполнено с помощью любого конфокального микроскопа. Использование моторизованной пластинчатой пары с программным обеспечением, которое включает в себя модуль Stitching, обеспечит полную визуализацию всей смонтированной сетчатки в одном изображении. При выборе области сетчатки убедитесь, что включены все крайние части образца, иначе фотография будет неполной (рисунок 1, желтые стрелки). Это не очень актуально в мышиной модели OIR, например, потому что сосудистые изменения находятся вблизи зрительного нерва. В то время как в крысиной модели OIR эта ошибка может привести к неточной количественной оценке, так как аваскулярная и неоваскулярная области находятся рядом с лимбусом. Другой возможностью является проведение индивидуальных микрофотографий сетчатки. Позже пользователь может организовать их как головоломку с помощью соответствующего программного обеспечения. Не рекомендуется использовать эпифлуоресцентный микроскоп, особенно при анализе ветвления, потому что сосуды прорастают по всей толщине сетчатки и некоторые сосуды не будут обнаружены в исключительно z-стеке.
Во время обработки изображений с помощью ImageJ FIJI рекомендуется не обновлять программное обеспечение до тех пор, пока все изображения не будут количественно определены, чтобы сохранить идентичные условия в программном обеспечении. Калибровка изображений (присвоение размера пикселя в микронах) является критическим шагом, поскольку эти протоколы подразумевают количественную оценку расстояний и областей. При ознакомлении с программой пользователь может изучить другие инструменты для выбора неоваскулярной и аваскулярной области в дополнение к инструменту палочки. Инструмент выделения полигонов особенно полезен для измерения аваскулярных областей, которые были разрезаны на две части на этапе монтажа. Другие исследователи создали специальные плагины для автоматизации выбора неосвейников на основе интенсивности флуоресценции этих структур. Эти методы являются более быстрыми и менее трудоемкими, хотя рекомендуется проверить, что перед количественной оценкой были выбраны небольшие менее блестящие неосколки31. Области неосвещиков будут флуоресцировать более интенсивно, чем окружающие нормальные сосуды. Инструмент «Волшебная палочка» выбирает области одинакового цвета, а допуск определяет, насколько похожи по цвету выбранные пиксели. Если неосеменение имеет ту же интенсивность, что и нормальные сосуды, допуск может быть скорректирован вниз, чтобы увеличить чувствительность к тонким различиям интенсивности. Хотя отбор неосколков в каждом образце будет выполняться с одинаковым порогом, некоторые неосеменяющие сосуды характеризуются незначительной интенсивностью флуоресценции. В этом случае для правильного выбора потребуется более низкий допуск.
Извилистость и дилатация являются измерениями расстояния. Комплексное исследование сосудистого дерева помогает подобрать сосуды одинакового типа (артерии или вены) и калибра. Мы измеряем дилатацию в сосудах на трех высотах, как показано на рисунке 4. Угол прямого выбора по отношению к стенке сосуда является еще одним важным моментом, который следует учитывать. Это должно быть как можно ближе к 90°, чтобы избежать возможных ошибок. При рисовании прямой линии пользователи могут использовать инструмент масштабирования, чтобы приблизиться к интересующему судну.
Ветвление сосудов также может быть измерено в двух или более областях количественной оценки разной высоты, если это необходимо. В этом случае исследователи должны сохранить область анализируемой сетчатки (центральную, среднюю или периферическую сторону зрительного нерва). Хотя ветвление изменено на нескольких животных моделях ретинопатии, ранние стадии ретинопатии, связанные с MetS, представленные здесь, все еще не показывают таких изменений15. Для обширных исследований капилляров сетчатки промежуточного и глубокого сплетения и прорастания сосудов 3D вычислительные методы предоставляют ценные данные тонких вариаций в морфологии сосудов и сети32. Наконец, плотность сосудов определяется площадью, занимаемой сосудами, по отношению к общей площади выбранного ROI. Измерение этого параметра требует использования плагина и актуализированной версии ImageJ FIJI, где должны быть доступны инструменты Auto Threshold и Geometry to Distance Map. Несмотря на эти дополнительные шаги, плагин прост в использовании, воспроизводим и надежен. Для измерения плотности сосудов был выбран ROI 0,015 мм2 , чтобы сделать десять измерений интенсивности флуоресценции в разных областях сетчатки. Такой размер позволил охватить всю фотографию, получив таким образом более репрезентативное среднее значение и его отклонение в каждой сетчатке.
В целом, несмотря на то, что эти наборы методов не автоматизированы и требуют ручного подбора параметров, они способны обеспечить количественные и строгие данные о сетчатке. Основное ограничение в отношении представленных выше протоколов для сосудистых измерений основывается на межэксперской изменчивости при анализе одного и того же изображения. Чтобы свести к минимуму это смещение, важно заранее установить общую установку в виде границ стенок сосудов, идентификацию аваскулярных областей и неосколков, а также критерии исключения поврежденных тканей. Что касается извития сосудов, требуется согласованная отправная точка рядом с зрительным нервом. Для начинающих пользователей настоятельно рекомендуется усреднять данные, собранные двумя или более экспертами. У обученных пользователей не было обнаружено существенных различий в измерении различных параметров, пока согласие в критериях количественной оценки остается постоянным. Аналогичным образом, к перечисленным протоколам могут быть добавлены дополнительные параметры, в зависимости от сосудистых изменений, обнаруженных при ретинопатии. При непролиферативных ретинопатиях измерение бесклеточного капиллярного числа, мигрирующих перицитов, соотношения перицитов/эндотелиальных клеток и проницаемости барьера сетчатки крови являются самыми ранними параметрами, измененными в сосудистой системе сетчатки33,34,35. Для хронических моделей и легких ретинопатий целесообразно включить эти дополнительные измерения. Большое количество измеряемых параметров обеспечит более верный ландшафт событий, происходящих в сосудистой системе. Таким образом, в этой статье мы показали классические, хорошо зарекомендовавшие себя и воспроизводимые методы количественной оценки некоторых наиболее релевантных параметров, учитываемых в клинической практике.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Авторы заявляют, что исследование проводилось при отсутствии каких-либо коммерческих или финансовых отношений, которые могли бы быть истолкованы как потенциальный конфликт интересов.
Acknowledgments
Мы благодарим Карлоса Маса, Марию Пилар Креспо и Сесилию Сампедро из CEMINCO (Centro de Micro y Nanoscopía Córdoba, CONICET-UNC, Кордова, Аргентина) за помощь в конфокальной микроскопии, Соледад Миро и Викторию Бланко за специализированный уход за животными и Лауру Гатику за гистологическую помощь. Мы также благодарим Виктора Диаса (просекретаря по институциональной коммуникации FCQ) за производство и издание видео и Пола Хобсона за его критическое чтение и языковой пересмотр рукописи.
Эта статья финансировалась за счет грантов Секретариата по вопросам науки и технологии, Национального университета Кордовы (SECyT-UNC) Consolidar 2018-2021, Фонда научных исследований и технологий (FONCyT), Проекта исследований в области науки и технологии (PICT) 2015 N° 1314 (все до M.C.S.).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Aluminuim foil | |||
| Bovine Serum Albumin | Merck | A4503 | quality |
| Calcium chloride dihydrate | Merck | C3306 | |
| Hydrochloric acid | Biopack | 9632.08 | |
| Confocal Microscope FV1200 | Olympus | FV1200 | with motorized plate |
| Covers | Paul Marienfeld GmnH & Co. | 111520 | |
| Dissecting Microscope | NIKON | SMZ645 | |
| Disodium-hydrogen-phosphate dihydrate | Merck | 119753 | |
| 200 µL tube | Merck | Z316121 | |
| Filter paper | Merck | WHA5201090 | |
| Incubator shaker GyroMini | LabNet International | S0500 | |
| Isolectin GS-IB4 From Griffonia simplicifolia, Alexa Fluor 488 Conjugate | Invitrogen | I21411 | |
| Poly(vinyl alcohol) (Mowiol 4-88) | Merck | 475904 | |
| Paraformaldehyde | Merck | 158127 | |
| pHmeter | SANXIN | PHS-3D-03 | |
| Potassium chloride | Merck | P9541 | |
| Potassium-dihydrogen phosphate | Merck | 1,04,873 | |
| Slides | Fisher Scientific | 12-550-15 | |
| Sodium chloride | Merck | S3014 | |
| Sodium hydroxide | Merck | S5881 | |
| Tris | Merck | GE17-1321-01 | |
| Triton X-100 | Merck | X100-1GA | |
| Vessel Analysis Fiji software | Mai Elfarnawany | https://imagej.net/Vessel_Analysis |
References
- Kur, J., Newman, E. A., Chan-Ling, T. Cellular and physiological mechanisms underlying blood flow regulation in the retina and choroid in health and disease. Progress in Retinal and Eye Research. 31 (5), 377-406 (2012).
- McDougal, D. H., Gamlin, P. D.
- Selvam, S., Kumar, T., Fruttiger, M. Retinal vasculature development in health and disease. Progress in Retinal and Eye Research. 63, 1-19 (2018).
- Wei, Y., et al. Age-related alterations in the retinal microvasculature, microcirculation, and microstructure. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 58 (9), 3804-3817 (2017).
- Lavia, C., et al. Reduced vessel density in the superficial and deep plexuses in diabetic retinopathy is associated with structural changes in corresponding retinal layers. PLoS One. 14 (7), 0219164 (2019).
- Rosenblatt, T. R., et al. Key factors in a rigorous longitudinal image-based assessment of retinopathy of prematurity. Scientific Reports. 11 (1), 5369 (2021).
- Edwards, A. L. Funduscopic examination of patients with diabetes who are admitted to hospital. Canadian Medical Association Journal. 134 (11), 1263-1265 (1986).
- Lechner, J., O'Leary, O. E., Stitt, A. W. The pathology associated with diabetic retinopathy. Vision Research. 139, 7-14 (2017).
- Sun, Z., et al. angiography metrics predict progression of diabetic retinopathy and development of diabetic macular edema: A prospective study. Ophthalmology. 126 (12), 1675-1684 (2019).
- Jia, Y., et al. Quantitative optical coherence tomography angiography of vascular abnormalities in the living human eye. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 112 (18), 2395-2402 (2015).
- Pauleikhoff, D., Gunnemann, F., Book, M., Rothaus, K. Progression of vascular changes in macular telangiectasia type 2: comparison between SD-OCT and OCT angiography. Graefe's Archive for Clinical and Experimental Ophthalmology. 257 (7), 1381-1392 (2019).
- Gammons, M. V., Bates, D. O. Models of oxygen induced retinopathy in rodents. Methods in Molecular Biology. 1430, 317-332 (2016).
- Grossniklaus, H. E., Kang, S. J., Berglin, L. Animal models of choroidal and retinal neovascularization. Progress in Retinal and Eye Research. 29 (6), 500-519 (2010).
- Han, N., Xu, H., Yu, N., Wu, Y., Yu, L. MiR-203a-3p inhibits retinal angiogenesis and alleviates proliferative diabetic retinopathy in oxygen-induced retinopathy (OIR) rat model via targeting VEGFA and HIF-1α. Clinical and Experimental Pharmacology & Physiology. 47 (1), 85-94 (2020).
- Paz, M. C., et al. Metabolic syndrome triggered by fructose diet impairs neuronal function and vascular integrity in ApoE-KO mouse retinas: Implications of autophagy deficient activation. Frontiers in Cell and Developmental Biology. 8, 573987 (2020).
- Connor, K. M., et al. Quantification of oxygen-induced retinopathy in the mouse: a model of vessel loss, vessel regrowth and pathological angiogenesis. Nature Protocols. 4 (11), 1565-1573 (2009).
- Zarb, Y., et al. Ossified blood vessels in primary familial brain calcification elicit a neurotoxic astrocyte response. Brain. 142 (4), 885-902 (2019).
- Smith, L. E., et al.
- Subirada, P. V., et al. Effect of autophagy modulators on vascular, glial, and neuronal alterations in the oxygen-induced retinopathy mouse model. Frontiers in Cellular Neuroscience. 13, 279 (2019).
- Lutty, G. A., McLeod, D. S. Development of the hyaloid, choroidal and retinal vasculatures in the fetal human eye. Progress in Retinal and Eye Research. 62, 58-76 (2018).
- Kim, C. B., D'Amore, P. A., Connor, K. M. Revisiting the mouse model of oxygen-induced retinopathy. Eye and Brain. 8, 67-79 (2016).
- Guaiquil, V. H., et al. A murine model for retinopathy of prematurity identifies endothelial cell proliferation as a potential mechanism for plus disease. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 54 (8), 5294-5302 (2013).
- Mezu-Ndubuisi, O. J. In vivo angiography quantifies oxygen-induced retinopathy vascular recovery. Optometry and Vision Science: Official Publication of the American Academy of Optometry. 93 (10), 1268-1279 (2016).
- Scott, A., Powner, M. B., Fruttiger, M. Quantification of vascular tortuosity as an early outcome measure in oxygen induced retinopathy (OIR). Experimental Eye Research. 120, 55-60 (2014).
- Kim, A. Y., et al. Quantifying microvascular density and morphology in diabetic retinopathy using spectral-domain optical coherence tomography angiography. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 57 (9), 362 (2016).
- Liu, C. H., Wang, Z., Sun, Y., Chen, J. Animal models of ocular angiogenesis: from development to pathologies. FASEB Journal. 31 (11), 4665-4681 (2017).
- Grossniklaus, H. E., Kang, S. J., Berglin, L. Animal models of choroidal and retinal neovascularization. Progress in Retinal and Eye Research. 29 (6), 500-519 (2010).
- Kern, T. S., Antonetti, D. A., Smith, L. E. H. Pathophysiology of diabetic retinopathy: Contribution and limitations of laboratory research. Ophthalmic Research. 62 (4), 196-202 (2019).
- Lorenc, V. E., et al. IGF-1R regulates the extracellular level of active MMP-2, pathological neovascularization, and functionality in retinas of OIR mouse model. Molecular Neurobiology. 55 (2), 1123-1135 (2018).
- Ma, N., Streilein, J. W. Contribution of microglia as passenger leukocytes to the fate of intraocular neuronal retinal grafts. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 39 (12), 2384-2393 (1998).
- Mazzaferri, J., Larrivée, B., Cakir, B., Sapieha, P., Costantino, S. A machine learning approach for automated assessment of retinal vasculature in the oxygen induced retinopathy model. Scientific Reports. 8 (1), 3916 (2018).
- Milde, F., Lauw, S., Koumoutsakos, P., Iruela-Arispe, M. L. The mouse retina in 3D: quantification of vascular growth and remodeling. Integrative Biology: Quantitative Biosciences from Nano to Macro (Camb). 5 (12), 1426-1438 (2013).
- Yang, T., et al. Pericytes of indirect contact coculture decrease integrity of inner blood-retina barrier model in vitro by upgrading MMP-2/9 activity. Disease Markers. 2021, 7124835 (2021).
- Huang, Q., Wang, S., Sorenson, C. M., Sheibani, N. PEDF-deficient mice exhibit an enhanced rate of retinal vascular expansion and are more sensitive to hyperoxia-mediated vessel obliteration. Experimental Eye Research. 87 (3), 226-241 (2008).
- Jiang, H., Zhang, H., Jiang, X., Wu, S. Overexpression of D-amino acid oxidase prevents retinal neurovascular pathologies in diabetic rats. Diabetologia. 64 (3), 693-706 (2021).
