Artigo de método

Um sistema celular de cultura tripla modelando a barreira hematoencefálica humana

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DOI:

10.3791/63134

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30 de novembro de 2021

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1Univ. Artois, UR 2465, Laboratoire de la Barrière Hémato-Encéphalique (LBHE), 2Queen Mary University of London, Department of Chemistry, 3Yamaguchi University Graduate School of Medicine, Department of Neurology and Clinical Neuroscience

* These authors contributed equally

Neste artigo

Resumo

Este protocolo descreve um método para estabelecer um modelo in vitro de barreira hematoencefálica humana (BBB). As células endoteliais e os pericitos são semeados em cada lado de um filtro de inserção (compartimento sanguíneo), e os astrócitos são semeados no poço inferior (compartimento cerebral). O modelo caracterizado foi utilizado para experimentos de transporte de nanopartículas.

Resumo

A entrega de drogas ao cérebro continua a ser um desafio devido às propriedades altamente específicas e restritivas da barreira hematoencefálica (BBB), que controla e restringe o acesso ao parênquima cerebral. No entanto, com o desenvolvimento das nanotecnologias, grandes painéis de novos nanomateriais foram desenvolvidos para melhorar a entrega de medicamentos, destacando a necessidade de microssistemas in vitro confiáveis para prever a penetração cerebral no quadro de ensaios pré-clínicos. Aqui está um método simples para configurar um sistema microfisiológico para modelar o BBB usando apenas células humanas. Em sua configuração, o modelo consiste em uma cultura tripla, incluindo células endoteliais semelhantes ao cérebro (BLECs), pericitos e astrócitos, os três principais atores celulares BBB necessários para induzir e regular as propriedades do BBB de maneira mais fisiológica, sem a necessidade de compostos de aperto. O modelo desenvolvido em formato de placa de 12 poços, pronto após 6 dias de tripla cultura, caracteriza-se em propriedades físicas, expressões gênicas e proteicas e utilizado para a medição do transporte de nanogel polimérico. O modelo pode ser usado para uma extensa gama de experimentos em condições saudáveis e patológicas e representa uma ferramenta valiosa para avaliações pré-clínicas do transporte de moléculas e partículas, bem como tráfico inter e intracelular.

Introdução

O BBB, localizado ao nível das células endoteliais capilares cerebrais (CE), controla e regula o acesso ao parênquima cerebral, crucial para a manutenção da homeostase cerebral e da função das células neurais 1,2. No entanto, no caso da patologia cerebral, a falta de acesso ao parênquima cerebral representa um obstáculo real para o desenvolvimento de estratégias terapêuticas.

As CEs BBB possuem um conjunto complexo de propriedades, incluindo proteínas de junção apertada (TJ), que selam o espaço intercelular, associadas a um sistema de bombas de efluxo, transportadores específicos e receptores, que controlam a via transcelular 1,2,3. Além disso, todas essas propriedades são induzidas e mantidas, graças às comunicações com os pericitos embutidos na membrana basal BBB EC e os astrócitos, cujas extremidades dos pés circundam os capilares cerebrais 1,2,3. Assim, estudar o BBB in vitro é um desafio considerando a complexidade de sua arquitetura e as comunicações entre os diferentes tipos celulares que constituem a unidade neurovascular (UVN)2. Além disso, os diferentes tipos de células são cruciais para a indução e manutenção das propriedades do BBB e, consequentemente, impactam a previsão do cruzamento através do BBB. Diferentes estratégias para a entrega de medicamentos ao cérebro já foram testadas usando um grande painel de táticas para contornar as propriedades restritas do BBB4. Mais recentemente, com o avanço das nanotecnologias, novos materiais estão sendo desenvolvidos para aplicações como portadores de fármacos 5,6. Além de sua maior carga, toxicidade reduzida e aumento da biodisponibilidade dos fármacos, esses novos nanomateriais podem ser funcionalizados para uma estratégia de cavalo de Tróia para atravessar o BBB e atingir especificamente as células do parênquima 5,6. Dentre os diferentes tipos de nanomateriais avaliados, os nanogéis têm atraído considerável atenção, principalmente devido às suas propriedades coloidais e capacidade de adaptar a estrutura química para introduzir propriedades responsivas a estímulos 7,8,9,10,11,12,13,14,15.

Modelos in vitro são agora desenvolvidos para estudos pré-clínicos utilizando células humanas para prever a penetração cerebral de fármacos16. Diferentes configurações desses modelos estão disponíveis, desde monocamadas de CEs cerebrais até múltiplos sistemas celulares16. Considerando a importância das células NVU na indução e manutenção do BBB e a resposta coordenada ao ambiente patológico, os modelos BBB in vitro precisam considerar todos esses protagonistas para melhorar a relevância da predição 2,17.

O método atual descreve a criação de um modelo de cultura tripla in vitro do BBB humano, que é totalmente desenvolvido com células humanas para estudar mecanismos moleculares celulares e humanos específicos. Para ser fisiologicamente relevante, o modelo consiste nos três principais atores celulares do BBB (CEs, pericitos e astrócitos) necessários para induzir e manter as propriedades do BBB, sem o uso de compostos de aperto e apresentando um conjunto de propriedades necessárias para ser considerado como um modelo BBB in vitro 16,18. O modelo é configurado em uma configuração que delimita o compartimento sanguíneo e cerebral, adequado para estudos pré-clínicos de transporte de drogas e partículas para prever a penetração cerebral. A utilidade do modelo é ilustrada pela medição do transporte de nanogéis poliméricos.

Protocolo

O protocolo foi aprovado pelo Ministério do Ensino Superior e Pesquisa da França (referência: CODECOH DC2011-1321) e pelo conselho de revisão investigacional local (Béthune Maternity Hospital, Beuvry, França). Para a obtenção das células endoteliais (CE), obteve-se o consentimento escrito e informado dos pais do doador para a coleta de sangue do cordão umbilical, em conformidade com a legislação francesa. Os pericitos são fornecidos pelo professor Takashi Kanda (Departamento de Neurologia e Neurociência Clínica, Escola de Pós-Graduação em Medicina da Universidade de Yamaguchi, Ube, Japão) que foram isolados de acordo com a Referência19. Os astrócitos primários do córtex cerebral humano são comprados de um fornecedor comercial (consulte Tabela de Materiais).

1. Cultura celular

  1. Cultivo de células endoteliais
    NOTA: As células endoteliais (CE) são derivadas de células-tronco hematopoiéticas CD34+ isoladas do sangue do cordão umbilical humano, de acordo com o método descrito por Pedroso et al.20. O fenótipo endotelial das CEs é descrito em Pedroso et al.20.
    1. Cultive CEs humanas usando meio de células endoteliais suplementado com 5% de soro fetal de bezerro (FCS), 0,5% de gentamicina e 1% de suplemento de crescimento de células endoteliais (ECM) (ver Tabela de Materiais).
    2. Para CEs de subcultura, dois dias antes da configuração do modelo, revestir um prato com 10 mL de gelatina a 2% por 15 min a 37 °C e, em seguida, substituí-lo por 20 mL de ECM quente. Descongelar um frasco para injetáveis de CEs contendo 1 milhão de células (as células foram contadas manualmente, conforme descrito no passo 2.3.3, antes do congelamento celular) na placa de cultura celular pré-revestida.
    3. Após 3 h a 37 °C, renovar o meio e manter as células até o encaixe da tricultura em atmosfera umidificada dentro de uma incubadora a 37 °C a 5% de CO 2 e 21% de O2.
  2. Cultivo de pericitos
    NOTA: Os pericitos são isolados do cérebro humano de acordo com o protocolo publicado por Shimizu et al.19, cujo procedimento de isolamento segue o método publicado por Kanda et al.21 com modificações.
    1. Cultive os pericitos usando o meio Eagle modificado da Dulbecco suplementado com 4,5 g/L de glicose (DMEM HG), 10% de FCS, 1% de penicilina/estreptomicina e 1% de L-glutamina (ver Tabela de Materiais).
    2. Para a subcultura de pericitos, cinco dias antes da configuração do modelo, revestir duas placas com 8 mL/prato de 100 μg/mL de solução de colágeno tipo I em ácido acético 0,02 N por 1 h à temperatura ambiente (RT) e, em seguida, lavar duas vezes com RT DMEM HG. Descongelar um frasco para injetáveis de perícitos contendo 1 milhão de células num tubo cónico contendo 10 ml de meio quente e centrifugar a suspensão durante 5 minutos a 190 x g a 20 °C.
    3. Ressuspender o pellet em 10 mL de meio morno e semente nos pratos de cultura celular pré-revestidos pré-preenchidos com 15 mL de meio/prato quente. O meio é renovado após 3 dias, e as células são mantidas até o ajuste da tricultura em incubadora umidificada a 37 °C sob 5% de CO 2 e 21% de O2.
  3. Cultivo de astrócitos
    1. Cultive os astrócitos usando um meio de astrócitos suplementado com 20% de FCS, 1% de suplemento de crescimento de astrócitos e 1% de solução de penicilina/estreptomicina (AM) (ver Tabela de Materiais).
    2. Para a subcultura dos astrócitos, uma semana antes da fixação do modelo, revestir um balão de cultura de células T75 com 10 mL de poli-L-lisina (PLL)de 2 μg/cm 2 por 1 h a 37 °C e lavar duas vezes com água estéril RT. Descongelar um frasco para injetáveis de astrócitos contendo 1 milhão de células em 20 ml de meio quente e sementes no balão de cultura celular T75 pré-revestido.
      NOTA: Os frascos de células obtidos comercialmente confirmam a presença de ~ 1 milhão de células, de modo que a contagem de células não foi realizada aqui.
    3. Manter as células em incubadora umidificado a 37 °C a 5% de CO 2 e 21% de O2. O meio é renovado após 24 h e depois a cada 2 dias até o cenário da tricultura.

2. Configuração do modelo de cultura tripla

Observação : A montagem dos três tipos de célula é executada no mesmo dia. No dia anterior à configuração da tricultura, realize o revestimento de colágeno tipo I nos filtros de inserção revertidos (ver Tabela de Materiais) e semeie os astrócitos nos poços pré-revestidos com PLL de uma placa de 12 poços.

  1. Semeadura de astrócitos nos poços
    1. Revestir os poços com 500 μL de 2 μg/cm desolução de 2 PLL, conforme descrito na etapa 1.3.2.
    2. Lavar as células uma vez com 10 ml de solução salina tampão fosfato quente - 1X (1X PBS-CMF) isenta de cálcio e magnésio (Tabela 1) antes de incubar durante 3 min a 37 °C com 10 ml de solução quente de tripsina/EDTA (T/E) a 20% e separar mecanicamente as células do balão. Transfira a suspensão para um tubo cônico contendo 5 mL de FCS quente não diluído.
      NOTA: De acordo com o protocolo22 do fornecedor, a coleta de astrócitos pode ser otimizada colocando o frasco na incubadora por 1 min e tocando no frasco para ajudar a completar o descolamento. As células restantes devem ser coletadas com 5 mL de solução de neutralização T/E e colocadas no tubo cônico contendo FCS.
    3. Centrifugar a suspensão durante 5 minutos a 20 °C a 190 x g.
    4. Ressuscite o pellet celular em 5 mL de AM morno. Contar as células diluindo 20 μL da suspensão celular em 80 μL de 1X PBS-CMF utilizando uma câmara de contagem manual ao microscópio (ver Tabela de Materiais). Placa em torno de 40.000 células/cm2 em cada poço pré-revestido com PLL em um volume de 1,5 mL de AM quente.
  2. Semeadura de pericitos nos filtros de inserção revertidos
    1. Adicionar 250 μL de solução de colagénio tipo I (100 μg/ml) nos filtros de inserção invertidos, colocados na periferia de um prato coberto de 25 mm de altura (ver Tabela de Materiais) utilizando pinças estéreis. Deixe o revestimento por 1 h no RT em condições estéreis.
      NOTA: O prato usado precisa ser alto o suficiente para garantir a manutenção da esterilidade quando estiver fora do exaustor e evitar o contato entre as soluções no filtro revertido e a tampa do prato.
    2. Retire cuidadosamente a solução de colagénio tipo I com uma pipeta de vidro ligada a um sistema de aspiração. Lavar duas vezes com 250 μL de RT DMEM HG e, em seguida, remover cuidadosamente toda a solução dos filtros de inserção. Deixe os filtros de inserção revestidos em RT em condições estéreis até a semeadura das células.
      NOTA: Durante o procedimento de revestimento, tenha cuidado para não tocar no filtro para evitar danos à membrana. Uma vez revestidos com colágeno tipo I, os filtros de inserção podem ser armazenados durante a noite no RT.
    3. No dia da configuração da tricultura, lavar os pericitos duas vezes com 10 mL de 1X PBS-CMF morno e incubar as células com 2 mL de tripsina morna. Monitore a ação da tripsina observando as células sob o microscópio. Uma vez que as células comecem a se desprender, remova a tripsina e adicione 5 mL de ECM quente antes da dissociação mecânica.
    4. Contar as células diluindo 20 μL da suspensão celular em 80 μL de 1X PBS-CMF utilizando uma câmara de contagem manual ao microscópio e semear 44.500 células/cm 2 nos filtros de inserção revertidos pré-revestidos num volume de 250 μL. Manter os filtros de inserção numa incubadora humidificada a 37 °C durante 3 h a 5% de CO 2 e 21% de O2.
    5. Reverta cuidadosamente os filtros de inserção usando pinças estéreis em uma placa de 12 poços contendo 1,5 mL de ECM/poço quente. Os filtros de inserção agora estão prontos para serem revestidos do outro lado.
  3. Semeadura de células endoteliais nos filtros de inserção
    1. Revestir o lado superior dos filtros de inserção com 500 μL de hidrogel extracelular à base de matriz (1/48 v/v) (ver Tabela de Materiais). Após 1 h, em incubadora umidificada a 37 °C a 5% de CO 2 e 21% de O2, lavar uma vez com 500 μL de RT DMEM HG.
    2. Lavar uma vez com 10 mL de 1X PBS-CMF morno e incubar as células com 2 mL de tripsina morna. Uma vez que as células comecem a se desprender, remova a tripsina e adicione 5 mL de ECM quente antes da dissociação mecânica.
    3. Contar as células diluindo 20 μL da suspensão celular em 80 μL de 1X PBS-CMF utilizando uma câmara de contagem manual ao microscópio e semear as CEs a uma densidade de 71.500 células/cm2 nos filtros de inserção pré-revestidos num volume de 500 μL de ECM quente.
    4. Substitua a MA por 1,5 mL de ECM/poço quente e, em seguida, transfira os filtros de inserção semeados (CEs + pericitos) sobre os poços que contêm os astrócitos.
    5. Colocar os sistemas celulares de tricultura numa incubadora humidificada a 37 °C a 5% de CO 2 e 21% de O2.
  4. Manutenção da cultura de células triplas para a indução das propriedades BBB
    NOTA: Para a indução das propriedades BBB nas CEs, são necessários 6 dias de cultura tripla.
    1. Renove o meio a cada dois dias até o dia 6, retirando cuidadosamente o meio do compartimento superior e inferior usando uma pipeta de vidro conectada a um sistema de aspiração.
    2. Substitua rapidamente por ECM quente em um volume de 500 μL no compartimento superior e 1,5 mL no compartimento inferior e coloque de volta as células em uma incubadora umidificada a 37 °C sob 5% de CO 2 e 21% de O2.

3. Validação do fenótipo BBB

NOTA: Após 6 dias de tripla cultura, o tempo necessário para induzir o fenótipo BBB nas CEs, o modelo BBB humano está pronto para experimentos. A integridade física das células endoteliais semelhantes ao cérebro (BLECs) é visualizada pela coloração por imunofluorescência de proteínas TJ avaliadas usando ensaio de permeabilidade para marcadores de integridade BBB. A validação do fenótipo BBB também inclui análise da expressão de genes/proteínas e funcionalidade das bombas de efluxo de acordo com o procedimento descrito em Deligne et al.,23. Pericitos e astrócitos são visualizados pelos respectivos marcadores de coloração de acordo com o procedimento descrito em Deligne et al. 202023.

  1. Coloração por imunofluorescência
    1. Fixe os filtros de inserção e astrócitos em metanol/acetona gelado (50/50 v/v) durante 1 min e lave duas vezes com RT 1X PBS-CMF.
    2. Separe cuidadosamente o filtro da pastilha cortando a membrana usando um bisturi. Realizar imunocitoquímica na membrana e nos poços de fundo de acordo com Deligne et al.23.
      NOTA: Para a etapa de bloqueio, use 250 μL de buffer SEA BLOCK Blocking (consulte Tabela de Materiais) por 30 minutos em RT.
  2. Ensaio de integridade BBB
    1. Avaliar a integridade física dos BLECs por um ensaio de permeabilidade usando marcadores de integridade BBB com diferentes pesos moleculares, como fluoresceína de sódio (NaF) e 20 kDa Dextran (FD20) (ver Tabela de Materiais).
      NOTA: O experimento pode ser realizado de acordo com o procedimento descrito em Deligne et al.23.
  3. Funcionalidade da bomba de efluxo
    1. Avaliar a funcionalidade da glicoproteína-P (P-gp) e da proteína de resistência ao cancro da mama (BCRP) medindo a acumulação intracelular de rodamina 123 (R123) com e sem Elacridar, um inibidor de P-gp e BCRP (ver Tabela de Materiais).
      NOTA: O experimento pode ser realizado de acordo com o procedimento descrito em Deligne et al.23.
  4. Expressões gênicas e proteicas
    1. Realizar coleta de amostras de genes e proteínas no gelo após uma rápida lavagem com Ringer HEPES (RH) frio (Tabela 1) das células. Antes da recolha de amostras CE, raspar os pericitos dos filtros de inserção invertidos20.

4. Transporte de nanogel

NOTA: Para estimar a passagem de nanogéis poliméricos (NGs) do compartimento luminal para o abluminal do modelo BLEC de tricultura, 0,1 mg/mL de solução de NG foi adicionado no dia 6 no compartimento luminal por 24 h. Os NGs estudados foram marcados fluorescentemente com hidrogéis à base de N-isopropilacrilamida (NIPAM) com um tamanho médio de 8-10 nm (ver Tabela de Materiais).

  1. Pesar o pó de nanogel e solubilizá-lo em ECM a uma concentração de 1 mg/mL. Sonicate a solução por 10 min e filtro usando um filtro PTFE 0,2 μm.
    NOTA: Prepare uma solução fresca de GN no dia do experimento.
  2. Trocar o meio no compartimento luminal e adicionar 50 μL de solução de GNs no compartimento superior para uma concentração final de 0,1 mg/ml.
    NOTA: Efectuar uma diluição de 1:10 a partir da solução original.
  3. Após 24 h de incubação, coletar alíquotas dos compartimentos luminal (20 μL) e abluminal (200 μL) e colocá-las em uma placa preta de 96 poços.
  4. Quantifique a fluorescência usando um leitor multiplaca fluorescente (ver Tabela de Materiais) com uma placa preta de 96 poços usando a configuração de comprimentos de onda de excitação/emissão a 477/540 nm. Calcular a percentagem de cruzamento referida à solução de trabalho inicial adicionada no momento = 0 h (t0)6,15.
    NOTA: Para preparar a placa de 96 poços para a medição de fluorescência, adicionar 200 μL de solução do compartimento abluminal e 20 μL de solução do compartimento luminal e preparação t0 (adicionar 180 μL de ECM para atingir um volume final de 200 μL). Inclua também uma curva de calibração e um espaço em branco na placa de leitura. Parâmetros instrumentais: Método de detecção - Fluorescência, Posição óptica - Topo, Tipo de leitura - Ponto de extremidade, Comprimento de onda de excitação - 477 nm, Comprimento de onda de emissão - 540 nm, Sensibilidade - 100, Agitação - Orbital duplo para 5 s.

Resultados

Definição do modelo BBB de tripla cultura humana
O protocolo necessário para a configuração do modelo humano BBB in vitro está descrito na Figura 1 e inclui etapas sucessivas cuja ordem deve ser rigorosamente respeitada. Primeiramente, os três tipos de células são cultivados individualmente em placas de cultura celular (Figura 1A) antes de serem montados em um sistema de filtro de pastilha. O cenário de cultura tripla começa com a semeadura do primeiro tipo de célula, os astrócitos, no poço de fundo pré-revestido. No dia seguinte, os perícitos e os CEs são semeados nas superfícies abluminal e luminal pré-revestidas do filtro de pastilha, respectivamente. O filtro de inserção é então transferido sobre os astrócitos. O modelo é mantido em cultura por 6 dias, tempo necessário para induzir as propriedades BBB em CEs, com renovação de meio a cada dois dias de acordo com o modelo de cocultura patenteado24. Os ECs são então renomeados como BLECs (Figura 1B).

Caracterização do modelo BBB humano
O modelo de cultura de células triplas tem sido caracterizado pela presença de um conjunto de propriedades específicas do BBB. Primeiramente, os dados imunocitoquímicos confirmaram a expressão de marcadores convencionais como o receptor do fator de crescimento derivado de plaquetas β (PDGFR-β)25,26 e a desmina para pericitos e a proteína glial fibrilar ácida (GFAP)26 para astrócitos (Figura 2A). Assim, após os 6 dias de cultura com os pericitos e astrócitos, a monocamada de BLECs, visualizada com a coloração da junção aderente de VE-Caderina, apresenta uma localização contínua das proteínas TJ, Claudin-5 e ZO-1, nas bordas celulares (Figura 2A). A configuração dos TJs está correlacionada com baixos coeficientes de permeabilidade paracelular medidos por meio de marcadores de integridade BBB de baixo peso molecular, ou seja, NaF (376 Da)16,27 e alto peso molecular, ou seja, FD20 (20 kDa)27, como mostra a Figura 2B. Os valores medidos são comparáveis com modelos BBB in vitro validados utilizando a fonte exata de CEs23,24,28. Em conjunto, esses resultados destacam a baixa permeabilidade paracelular da monocamada BLEC de cultura tripla, característica do BBB in vivo. Além disso, o acúmulo intracelular de R123 em BLECs apresentou um aumento significativo na presença do inibidor da bomba de efluxo Elacridar 23,24 em comparação com a condição de controle com sua ausência (Figura 2C). Isso indica a presença de moléculas ativas da bomba de efluxo, ou seja, P-gp e BCRP, nas BLECs.

Para caracterizar melhor as BLECs, foram estudadas a expressão gênica e o nível proteico das principais características do BBB (Figura 3). Os dados obtidos com o modelo de tríplice cultura foram comparados com o modelo de cocultura validado e patenteado composto por CEs e pericitos24 utilizados como modelo controle. Os astrócitos representam o terceiro tipo de célula adicionado no modelo inicial de co-cultura no modelo de cultura tripla. Assim, a análise da expressão gênica (Figura 3A) de BLECs de cultura tripla, em comparação com as BLECs de cocultura, mostrou a manutenção da expressão de características-chave do BBB, como proteínas TJ (claudina-5 e zonula occludens-1) e bombas de efluxo (P-gp e BCRP), e a regulação positiva dos transportadores BBB mais estudados (transportador de glicose 1) e receptores (receptor de transferrina). Os dados de quantificação de proteínas (Figura 3B) mostraram-se de acordo com os resultados transcricionais. No geral, esses dados suportam a indução positiva de propriedades BBB na camada BLEC de cultura tripla semelhante ao modelo de cocultura validado. Ao todo, o modelo de cultura tripla exibe as propriedades físicas e metabólicas necessárias para que um sistema microfisiológico in vitro modele o BBB.

Aplicabilidade a estratégias de administração de medicamentos - medição do transporte de nanogel
Para avaliar a possibilidade de utilização do modelo de cultura tripla para estudar novas estratégias de entrega cerebral, avaliou-se o transporte de NGs neutros à base de NIPAM marcados fluorescentemente 6,15. No momento 0, os GNs foram colocados no compartimento luminal na concentração de 0,1 mg/mL (Figura 4A). Após 24 h de incubação, 5,82% dos GNs foram encontrados no compartimento abluminal (Figura 4B), comprovando sua capacidade de atravessar os BLECs.

Os resultados demonstram a adequação do modelo para medir a permeabilidade de compostos pequenos e maiores, conforme descrito com os marcadores de integridade, e avaliar o transporte de nanomateriais, como NGs poliméricos.

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Figura 1: Representação de etapas críticas para o estabelecimento do modelo de tríplice cultura in vitro do BBB humano. (A) Imagens de contraste de fase dos três componentes celulares do modelo BBB: células endoteliais (CE), pericitos (PC) e astrócitos (CA). Barra de escala = 250 μm. (B) Linha do tempo esquemática e ilustrativa para a configuração do modelo humano BBB in vitro de tripla cultura. A caixa realçada representa o procedimento de revestimento para o filtro de inserção invertido. Por favor, clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

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Figura 2: Avaliação das propriedades do modelo BBB de cultura tripla. (A) Imagens imunocorantes representativas dos marcadores distintivos para BLECs (Claudin-5: CLD5, Zona Occludens-1: ZO1 e VE-Caderina: Ve-Cadh), pericitos (Receptor do Fator de Crescimento Derivado de Plaquetas-β: PDGFR-β e desmina) e astrócitos (Glial Fibrillary Acidic Protein: GFAP). Barra de escala = 10 μm. (B) Permeabilidade paracelular de BLECs a marcadores fluorescentes de integridade BBB, Fluoresceína de Sódio (NaF, 376 Da, Pe: 0,61 ± 0,062) e FITC-Dextran (FD20, 20 kDa, Pe: 0,04 ± 0,005). N = 3; n = 9. A média ± funcionalidade do MEV (C) P-gp e BCRP em CEs foi avaliada quantificando-se a R123 intracelular com (124,2% ± 3,39%) e sem (100% ± 8,79%) Elacridar. N = 4; n = 12. A média ± MEV. p = 0,017 usando um teste t não pareado. Por favor, clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

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Figura 3: Avaliação da expressão gênica de BLEC e do nível proteico de marcadores distintivos no modelo de cultura tripla em comparação com o modelo BBB de cocultura. (A) Expressão gênica de proteínas de junção apertada (Claudin-5: CLD5 e Zona Occludens-1: ZO1), transportadores (Transportador de Glicose-1: GLUT1, P-glicoproteína: PGP e Proteína de Resistência ao Câncer de Mama: BCRP) e receptores de moléculas grandes (Receptor de Transferrina: TRFR), normalizados pela expressão de RPLP0. N = 3; n = 9. (B) Nível proteico de proteínas de junção apertada (CLD5 e ZO1), transportadores (GLUT1, PGP e BCRP) e receptores de moléculas grandes (TRFR), normalizados pela expressão de β-actina. N = 3; n = 9. Média ± MEV. Para (A) e (B), os valores>1 correspondem a maiores expressão gênica ou níveis de proteína no modelo de cultura tripla. A linha vermelha corresponde a um valor de 1 onde o nível de expressão (genes ou proteínas) dos dois modelos é equivalente. Por favor, clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

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Figura 4: Medição do transporte de nanogel no modelo de cultura tripla. (A) Representação esquemática do ensaio de transporte de nanogel. (B) Porcentagem de transporte de nanogel após 24 h de incubação no modelo de tríplice cultura (5,82% ± 0,09%). N = 2; n = 6. Significa ± SEM. Por favor, clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Nome do bufferComposiçãoNota
Peso molecular
Tampão fosfato salino, livre de cálcio e magnésioPBS-CMFNaCl8 g/L58.4Adicione todo o composto à água estéril e aguarde a solubilização completa. O pH da solução obtida tem de estar no intervalo de 7,3-7,4. Filtrar a solução utilizando uma membrana de 0,22 μm e conservar a solução estéril a 4 °C.
Kcl0,2 g/L74.55
KH2PO40,2 g/L136.09
NaHPO4-12 H2O2,87 g/L358.14
Água
Toque HEPESRHNaCl8,8 g/L58.4Adicione todo o composto à água estéril e aguarde a solublização completa. Ajustar o pH para 7,4 (pH da solução inicial em torno de 6,8). Filtrar a solução utilizando uma membrana de 0,22 μm e conservar a solução estéril a 4 °C.
Kcl0,387 g/L74.55
CaCl20,244 g/L110.99
MgCl 2 6H2 O0,0406 g/L203.3
NaHCO30,504 g/L84.1
HEPES1,19 g/L238.3
Glicose0,504 g/L180.16
Água

Tabela 1: Composição dos diferentes buffers utilizados no protocolo.

Discussão

O tratamento de doenças cerebrais continua a ser um desafio, considerando a dificuldade das drogas para o obstáculo sobre o BBB para atingir seus alvos celulares e moleculares no parênquima cerebral.

O desenvolvimento de medicamentos para doenças cerebrais atualmente exibe uma baixa taxa de sucesso, uma vez que a maioria dos medicamentos que exibem resultados promissores em modelos pré-clínicos não mostrou nenhum benefício quando usado na clínica. Seguindo a "regra dos 3R", que visa reduzir o número de animais utilizados para experimentação, modelos in vitro do BBB são desenvolvidos para estudar patologias cerebrais e predizer a penetração cerebral de fármacos29. Modelos in vitro de BBB têm sido desenvolvidos principalmente utilizando células animais e têm se tornado mais sofisticados para melhorar a relevância dos resultados obtidos16. Um dos avanços significativos no uso de células humanas, que traz inegável nova visão e mais especificidade, nos níveis celular e molecular, para estudar os mecanismos da doença humana16. No entanto, o desenvolvimento de modelos relevantes requer considerar a melhoria das configurações do modelo BBB in vitro e o conhecimento surgido, graças aos modelos animais. Assim, é preciso considerar a complexidade da arquitetura BBB e a importância das comunicações célula-célula para o estudo do BBB em condições fisiológicas e patológicas30.

O protocolo aqui apresentado descreve um método para a criação de um modelo completo de BBB humano in vitro compreendendo os três principais tipos celulares do BBB, sem limitação de acesso ao tecido cerebral. Como um sistema celular múltiplo, a indução e a manutenção das propriedades do BBB, sem o uso artificial de compostos de aperto, mas induzidas pelas comunicações célula-célula, é mais fisiologicamente relevante e em consonância com a indução in vivo das propriedades do BBB31. Assim, o respeito à cronologia do protocolo é primordial para o sucesso do protocolo. Além disso, os tempos de incubação durante a configuração da tríplice cultura e uma vez que os três tipos de células são montados representam as principais etapas críticas do protocolo.

As propriedades BBB em CEs são induzidas pela co-cultura com pericitos, conforme descrito para o modelo de co-cultura24. Assim, a cultura de pericitos no verso do filtro de inserção é o ponto mais crítico e requer seguir rigorosamente o protocolo, sob o risco de não haver pericitos suficientes para a indução das propriedades BBB. Em primeiro lugar, durante o procedimento de revestimento e também a semeadura celular, deve-se ter atenção para não ter a cobertura da placa de Petri em contato com o revestimento e também com o meio, uma vez que as células são semeadas para garantir um bom revestimento do filtro e não perder células (etapas 2.2.1 e 2.2.4). Além disso, uma vez semeadas os pericitos, é essencial aguardar o tempo indicado para a fixação dos pericitos (passo 2.2.4) antes de reverter o filtro de inserção para o revestimento e semeadura das CEs do outro lado (passos 2.2.5 e 2.3). Uma vez semeado, são necessários seis dias para induzir as propriedades BBB através de comunicações célula-célula (etapa 2.4).

O modelo é validado em termos de permeabilidade restrita (associada à fixação das junções apertadas), uma vez que as CEs do modelo de cultura tripla apresentam valores de permeabilidade a marcadores de integridade BBB semelhantes ao modelo de cocultura validado e também medidos em modelos animais ou humanos validados 16,27,32. Além disso, a validação de um modelo de BBB in vitro requer, além da permeabilidade restrita, a responsividade a outros tipos celulares da NVU e a expressão de receptores e transportadores funcionais16. Além disso, o modelo é reprodutível e produz vários filtros de inserção e poços para realizar inúmeras análises (expressão gênica e proteica, coloração fluorescente, testes de toxicidade) em cada tipo de célula separadamente, sem a necessidade de um método de classificação celular.

O modelo foi desenvolvido usando um filtro de tamanho de poro de 0,4 μm para ter um tipo de célula em cada lado do filtro de inserção. O sistema de filtro de inserção permitiu o estudo das comunicações célula-célula em condições fisiológicas, transferindo-as sobre astrócitos bem contidos. A presença de astrócitos no sistema representa um valor positivo em relação ao modelo inicial de cocultura in vitro 24. De fato, considerando a importância dos astrócitos na fisiologia do BBB, esse terceiro tipo de célula permite uma maior compreensão das comunicações célula-célula dentro do BBB. Além disso, o sistema de cultura de células triplas também pode ser estudado em condições patológicas como o acidente vascular encefálico, em que os astrócitos desempenham um papel essencial 33,34,35. Além disso, o desenho de BLECs/pericitos em ambos os lados do filtro de inserção pode ser facilmente colocado em outros tipos de células para imitar condições patológicas, como câncer cerebral23.

O tamanho dos poros do filtro de inserção pode trazer limitações com alguns experimentos, como a transmigração celular através do BBB. No entanto, o desenvolvimento do modelo com maior tamanho de poros requer a adaptação do protocolo para garantir a formação de uma monocamada fisiológica de CEs e não de múltiplas camadas, o que não é fisiologicamente relevante para mimetizar o BBB36.

A aplicabilidade do modelo foi demonstrada usando o experimento de transporte de NGs exibindo a possibilidade de fazer experimento de transporte usando um sistema multicelular. No entanto, deve-se estar ciente das dificuldades em ter um composto ou molécula de controle para o experimento de transporte, compartilhando propriedades comparáveis com NGs, uma vez que cada nanoestrutura exibe um conjunto único de propriedades (peso molecular, carga, forma, propriedades físicas, formação de corona de proteína).

Uma limitação do modelo é a ausência de tensão de cisalhamento, que demonstrou influenciar a diferenciação das CEs e a expressão das proteínas TJ37. No entanto, o desenvolvimento de um sistema fluídico imitando o capilar cerebral é um desafio, considerando a complexidade de adicionar uma parte fluídica, exigindo um dispositivo específico, em um sistema de múltiplas células. Além disso, o dispositivo em particular geralmente não está disponível comercialmente e não permite muitas replicações, tornando os sistemas fluídicos menos adaptados para uso de alto rendimento.

Em resumo, este sistema de cultura tripla constituído por células humanas reproduz in vitro a arquitetura do BBB. Permite a geração de muitas pastilhas que podem ser usadas para triagem extensiva de compostos.

Divulgações

Os autores declaram que não têm conflito de interesses.

Agradecimentos

Este trabalho é concedido pelo programa de investigação e inovação Horizonte 2020 da União Europeia ao abrigo do acordo de subvenção n.º 764958, no âmbito do projeto NANOSTEM, uma Rede de Formação Inovadora (ITN) Marie Skłodowska-Curie (Fellowship Eleonora Rizzi). Este estudo é concedido pelo «Conseil régional du Nord-Pas-de-Calais» (Fellowship to Clémence Deligne), pela "Société Française de lutte contre les Cancers et les leucémies de l'Enfant et de l'adolescent" (SFCE), pela Association "l'étoile de Martin" e pela Association "Cassandra contre la leucémie".

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo
NomeEmpresaNúmero de catálogoComentários
Cultura de Células
Meio de Astócitos (AM)ScienCell 1801
ScienCell 1852Suplemento de crescimento de astrócitos é fornecido no conjunto AM.
Placa de cultura de células 100 mmCorning 430293100 mm x 20 mm; prato usado para o descongelamento de ECs e PCs antes da configuração de tricultura
Prato de cultura de células 150 mmCorning 430599A altura dessas placas (25 mm) permite a semeadura de PCs no inserto revertido para a configuração do modelo de tricultura.
Colágeno I Corning354236Cauda de Rato 
Dulbecco's Modified Eagle MediumGibco31600-083Suplemento
Crescimento de Células Endoteliais emScienCell 1051O suplemento de crescimento de células endoteliais é fornecido no conjunto ECM.
Meio de Células Endoteliais (ECM)ScienCell 1001
Soro Fetal para Bezerros Gelatina SigmaF7524
SigmaG25002% gelatina de pele suína em PBS-CMF
GentamicinaBiochromA6A-2712
GlicoseSigmaG6152Pó
GlutaminaMerck1002891000
Cérebro Humano Córtex AstrócitosScienCell Câmara de contagem de células de Malassez 1800-SC
vWRHECH40453702A contagem foi realizada manualmente.
MatrigelCorning354230Hidrogel extracelular baseado
em matriz Penicilina/EstreptomicinaScienCell 0503solução de penicilina/estreptomicina é fornecida nos conjuntos ECM e AM.
Poli-L-lisinaScienCell 0413
Sistema SteritopMilliporeSCGPT0SRE0.22 µ tamanho de poro m
Inserção Transwell Corning34010.4 µ Filtro de Policarbonato de Poro M 
Solução de neutralização de tripsina/EDTAScienCell 0113
Solução de tripsina/EDTAScienCell 0103
Imunocitoquímica
SEA BLOCK bloqueando o tampãoThermoScientific37527
Alexa Fluor 568 anticorpo secundário anti-camundongoThermofisherA11031Diluição 1:500
Alexa Fluor 568 anticorpo secundário anti-coelhoThermofisherA11036Diluição 1:500
Anticorpo primário anti-claudina-5InVitrogen34-1600Diluição 1:100
Anticorpo primário anti-desminaAbcamab6322Diluição 1:200
Anticorpo primário anti-proteína ácida fibrilar glialDakoZ0334Diluição 1:500
Fator de crescimento derivado de plaquetas -β anticorpo primárioAbcamab51090Diluição 1:200
Anticorpo primário anti-VE-caderinaAbcamab207732Diluição 1:200
Anti-Zona Occludens-1 anticorpo primárioInVitrogen61-7300Diluição 1:200
Soro de cabra normalSigmaG6767
ProLong Diamond Antifade Mountant com DAPIInvitrogen P36962
Expressão gênica
NucleoSpin Rna/Proteína Macherey Nagel KitMacherey-Nagel740,933,250
96 poço multiplacaBioradHSP9601
iSCRIPTBiorad1708841
Folha de selante BioradMSB1001
SsoFast EvaGreen SupermixBiorad172-5201
Expressão de proteína
2x Tampão de Amostra LaemliBiorad161-0737Adicione 50 µ L de bMercaptoetanol para 950 µ L de Tampão Laemmli e armazene a -20 ° C. Dilua 1: 1 com a amostra de proteína para o ensaio.
Anticorpo primário da proteína de resistência ao câncer de mamaAbcamab207732Pré-tratamento 15 minutos em RT sob agitação; diluição 1:1000, O.N. a 4° C
Anticorpo primário Anti-Claudin-5Abcamab15106Pré-tratamento 5 minutos a 95° C; diluição 1:1000, O.N. a 4&graus; C
Anti-Glucose Transporter 1 anticorpo primárioMillipore07-1401Pré-tratamento 5 minutos a 95° C; diluição 1:1000, O.N. a 4&graus; Anticorpo
secundário anti-camundongoC DakoP0447Diluição 1:5000 em TBS-Tween
Anticorpo primário anti-glicoproteína PGenetexGTX23364Pré-tratamento 15 minutos em RT sob agitação; diluição 1:400, 3 horas em RT
Anticorpo secundário anti-coelhoDakoP0448Diluição 1:8000 em TBS-Tween
Anticorpo primário do receptor anti-transferrinaAbcamab84036Pré-tratamento 5 minutos a 95° C; diluição 1:1000, O.N. a 4&graus; C
Anti-Zona occludens-1 anticorpo primárioAbcamab216880Pré-tratamento 5 minutos a 95° C; diluição 1:1000, O.N. a 4&graus; Gel TGX
C CriterionSoluçãoBiorad 5678083
ECL PrimeAmersham RPN2236Solução de revelação para manter no escuro
Coquetel de inibidor de fosfatase 2SigmaP5726
Coquetel de inibidor de fosfatase 3SigmaP0044
Inibidor de proteaseSigmaP8340
Padrões de proteínaBiorad161-0373 Marcadores depeso molecular
RIPA 10xMillipore20-188
TBS 10xBiorad1706435
TRIS-GlicinaBiorad1610771
Tween Biorad1706531
BBB integrity assay
Sodium FluoresceinAmpresco0681λ ex= 490 nm; λ em= 525 nm   
ElacridarSigmaSML0486GF120918
FITC-Dextran 20 kDaSigmaFD-20Sλ ex= 490 nm; λ em=  525 nm   
Rodamina 123SigmaR8004λ ex= 501 nm; λ em= 538 nm   
SynergyTM H1 Leitor multiplaca fluorescenteBioTek Instruments
Transporte de Nanogel
SeringaTerumoSS+01T1Seringa de 1 mL 
FiltroFisherScientific151614990.2 µ m Filtro de membrana PTFE,
hidrogéis à base de N-Isopropilacrilamida (NIPAM) de 15 mm de diâmetro   Os nanogéis (NGs) usados no estudo são fornecidos por nosso colaborador na Queen Mary University London, Departamento de Química. Os NGs são marcados covalentemente com uma molécula fluorescente (λ ex= 477 nm; λ em= 540 nm). Os NGs são liofilizados e enviados como pó, neste estado eles são estáveis à temperatura ambiente por um longo período de tempo. 
Suplemento de Crescimento de Astrócito de Pó A

Referências

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