Artigo de método

Medindo a dinâmica de saliência da borda celular durante a disseminação usando microscopia de células vivas

DOI:

10.3791/63157

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1 de novembro de 2021

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1The Azrieli Faculty of Medicine, Bar-Ilan University, 2Department of Molecular Biophysics and Biochemistry, Yale University, 3Department of Neuroscience, Yale University

* These authors contributed equally

Neste artigo

Resumo

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Este protocolo visa medir os parâmetros dinâmicos (saliências, retrações, babados) de saliências na borda das células disseminar.

Resumo

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O desenvolvimento e a homeostase dos organismos multicelulares dependem da regulação coordenada da migração celular. A migração celular é um evento essencial na construção e regeneração de tecidos, e é fundamental no desenvolvimento embrionário, respostas imunológicas e cicatrização de feridas. A desregulação da motilidade celular contribui para distúrbios patológicos, como inflamação crônica e metástase do câncer. Migração celular, invasão de tecido, axônio e dendrito superam tudo iniciado com saliências mediadas por células mediadas por actina. Aqui, descrevemos um método simples, eficiente e de economia de tempo para a imagem e análise quantitativa da dinâmica de saliência de borda celular durante a disseminação. Este método mede características discretas da dinâmica da membrana de borda celular, como saliências, retrações e babados, e pode ser usado para avaliar como as manipulações de principais reguladores de actina impactam as saliências de borda celular em diversos contextos.

Introdução

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A migração celular é um processo crítico que controla o desenvolvimento e a função de todos os organismos vivos. A migração celular ocorre em ambas as condições fisiológicas, como embriogênese, cicatrização de feridas e resposta imune, e em condições patológicas, como metástase do câncer e doença autoimune. Apesar das diferenças nos tipos celulares que participam de diferentes eventos migratórios, todos os eventos de motilidade celular compartilham mecanismos moleculares semelhantes, que foram conservados na evolução do protozoário aos mamíferos, e envolvem mecanismos comuns de controle citoesquelético que podem sentir o ambiente, responder a sinais e modular o compor....

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Protocolo

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Todos os métodos descritos neste protocolo foram aprovados pelo Comitê institucional de Cuidados e Uso de Animais (IACUC) da Universidade bar-ilan.

NOTA: Uma representação gráfica passo a passo do procedimento descrito nesta seção aparece na Figura 1.

1. Cultura celular

NOTA: As células utilizadas no protocolo são fibroblastos embrionários de camundongos (MEFs) que foram gerados a partir de embriões E11.5-13.5 de camundongos tipo selvagem C57BL/6. Os MEFs primários foram gerados de acordo com o protocolo do laboratório Jack....

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Resultados

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No experimento descrito na Figura 2, MEFs imortalizados foram banhados em pratos de fundo de vidro pré-revestidos com fibronectina para ativar sinalização mediada por integrin, bloqueada pela BSA desnaturada, para bloquear locais potenciais livres para adesão celular que não depende da ativação do integrin. Para chegar à fase de crescimento logarítmico a 70%-80% de confluência de células no dia do experimento, 0,7 x 106 MEFs foram emplacados em uma placa de cultura tecidual de 10 .......

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Discussão

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A dinâmica de saliência de borda celular, composta por saliências, retrações e babados, é um pré-requisito e um evento potencial limitante de taxas na motilidade celular. Aqui descrevemos um método rápido e simples para medir a dinâmica das saliências de borda celular durante a disseminação. Este método permite imagens de curto prazo, gera uma quantidade significativa de dados, não requer rotulagem fluorescente de células ou equipamentos de microscopia fluorescente caros, e poderia ser usado como um método preliminar par.......

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Divulgações

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Os autores não têm conflito de interesses para divulgar.

Agradecimentos

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Este trabalho foi apoiado pelas bolsas NIH MH115939, NS112121, NS105640 e R56MH122449-01A1 (a Anthony J. Koleske) e pela Fundação Israel Science (bolsas nº 1462/17 e 2142/21) (para Hava Gil-Henn).

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Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo
NomeEmpresaNúmero de catálogoComentários
Placas de cultura de células de 10 cmGreinerP7612-360EA
Albumina de soro bovino (BSA)Sigma-AldrichA7906
Dulbecco' s meio de águia modificado (DMEM)Biological Industries, Israel01-055-1AO meio contém glicose alta (4,5 g/L de D-glicose)
Dulbecco' s solução salina tamponada com fosfato (1xDPBS)Biological Industries, Israel02-023-1A
Soro fetal bovino (FBS)Biological Industries, Israel04-001-1A
Fibronectina de plasma humano, líquido, 0,1%, adequado para cultura de célulasSigma-AldrichF0895
Pratos de fundo de vidroCellvisD35-20-1.5-NPrato de fundo de vidro de 35 mm, tamanho do prato 35 mm, tamanho do poço 20 mm, vidro de cobertura # 1,5 (0,16-0,19 mm).
Software ImageJNIHFeely disponível em: https://imagej.nih.gov/ij/download.html
LAS-AF Leica Application Suite 3.2Software de aquisição de microscópio equipado com um CMOS digital ORCA-Flash 4.0 V2
Leica AF6000LeicaMicroscópio de campo claro invertido (40x, NA 1.3 ) equipado com óptica de contraste de fase, uma incubadora e unidade de CO2 com software de aquisição LAS AF equipado com um Câmera digital CMOS ORCA-Flash 4.0 V2.
Solução de L-glutaminaBiological Industries, Israel03-020-1B
ORCA-Flash 4.0 V2 câmera digital CMOSHamamatsu Photonics
Biological Industries, Israel03-031-1B
Solução de tripsina-EDTA B (0,25%), EDTA (0,05%)Biological Industries, Israel03-052-1A
Solução de penicilina-estreptomicina

Referências

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  1. Kurosaka, S., Kashina, A. Cell biology of embryonic migration. Birth Defects Research Part C - Embryo Today: Reviews. 84 (2), 102-122 (2008).
  2. Pollard, T. D., Borisy, G. G. Cellular motility driven by assembly and disassembly of actin filaments. Cell. 112<....

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