Summary
Se han demostrado técnicas microquirúrgicas detalladas para establecer un modelo de rata de canulación de vena yugular a largo plazo para la recolección secuencial de sangre en el mismo animal. Los parámetros fisiológicos y hematológicos han sido monitoreados durante la fase de recuperación de la rata. Este modelo se ha aplicado para estudiar la farmacocinética del polifenol administrado por vía oral sin inducir estrés animal.
Abstract
El muestreo de sangre en pequeños animales de laboratorio es necesario para la optimización del plomo farmacéutico, pero puede causar un gran daño y estrés a los animales de experimentación, lo que podría afectar los resultados. La canulación de la vena yugular (JVC) en ratas es un modelo ampliamente utilizado para la recolección repetida de sangre, pero requiere un entrenamiento adecuado de las habilidades quirúrgicas y el cuidado de los animales. Este artículo detalla los procedimientos microquirúrgicos para establecer y mantener un modelo permanente de rata JVC con un enfoque específico en la colocación y sellado de la cánula yugular. Se destacó la importancia de monitorear los parámetros fisiológicos (por ejemplo, peso corporal, ingesta de alimentos y agua) y hematológicos, con resultados presentados durante 6 días después de la cirugía durante la recuperación de la rata. El perfil fármaco-concentración plasmática-tiempo del ácido elágico fenol natural administrado por vía oral se determinó en el modelo de rata JVC.
Introduction
La adquisición repetida de muestras de sangre de pequeños animales de laboratorio, como roedores, cobayas y conejos, es un aspecto importante para la optimización del plomo farmacéutico y también para reducir el número de animales utilizados en la investigación 1,2. La cartera para desarrollar nuevas herramientas de diagnóstico y formulación de medicamentos (por ejemplo, vacunas) requiere acceso a diferentes volúmenes de sangre para evaluar su robustez y rendimiento in vivo, como la farmacocinética (PK), la toxicidad y la sensibilidad 3,4,5.
El enfoque de laboratorio para la recolección de muestras de sangre se clasifica ampliamente en dos tipos, quirúrgico y no quirúrgico6. El enfoque no quirúrgico es relativamente fácil de comprender para el investigador, que incluye técnicas comunes, como la punción cardíaca, la punción del seno orbitario y el sangrado de la vena safena y de la cola. El muestreo múltiple de sangre es posible mediante algunos métodos no quirúrgicos, pero el volumen de la muestra es pequeño y puede causar heridas físicas y estrés psicológico a los animales1. Por otro lado, el abordaje quirúrgico es una alternativa favorita a la venopunción repetida, e implica la colocación de una cánula temporal o permanente en los vasos sanguíneos de los animales 7,8,9. El gran volumen de sangre podría extraerse repetidamente a través de la cánula en ratas conscientes, evitando el estrés y el dolor debido a la técnica de manipulación, la restricción y la anestesia 7,8,10,11. Sin embargo, la implantación de la cánula requiere un investigador experimentado con la capacitación adecuada para recolectar con éxito la sangre.
La recolección de sangre a través de la canulación de la vena yugular (JVC) en ratas es el método más utilizado para estudiar el fármaco PK 6,10,12,13. Sin embargo, el establecimiento del modelo de rata JVC necesita una práctica cuidadosa de las habilidades microquirúrgicas y el conocimiento de la atención y el mantenimiento postquirúrgicos. Especialmente, después de la cirugía, la rata requiere la administración de analgésicos y el tiempo de recuperación suficiente para alcanzar una condición fisiológica estable para experimentos posteriores 13,14,15. Aunque el aumento de peso corporal (es decir, >10 g) es un indicador válido y comúnmente aplicado para la recuperación de la rata, no es raro que las ratas tengan una muerte inesperada después de la operación debido a deshidratación, infección e inflamación, que podría ser sutil notar al inicio temprano14,15. Además, la obstrucción del catéter en el modelo JVC sigue siendo un problema durante la extracción de sangre.
El presente protocolo ha demostrado en detalle los procedimientos microquirúrgicos para JVC en una rata anestesiada con un enfoque específico en la identificación, aislamiento y canulación de la vena yugular. Se destaca la importancia del seguimiento fisiológico y hematológico de las ratas durante la fase de recuperación. Finalmente, se recogieron muestras de sangre seriadas a través del catéter venoso para estudiar el PK del ácido elágico fenol natural administrado por vía oral con mala biodisponibilidad (es decir, baja concentración sistémica) para verificar el modelo de rata JVC.
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Protocol
Los procedimientos que se describen a continuación se realizaron como parte de un protocolo aprobado por el Comité Institucional de Cuidado y Uso de Animales de la Universidad Politécnica del Noroeste (No. 202101117).
1. Preparación preoperatoria (el día antes de la cirugía)
NOTA: Soluciones requeridas: solución salina normal (cloruro de sodio al 0,9% p/v), solución salina heparinizada (1% p/v heparina sódica), solución de bloqueo del catéter, fármaco antiinflamatorio no esteroideo (AINE), como solución de meloxicam (2 mg/ml).
- Preparación de la solución
- Alícuota de 200 μL de solución de bloqueo de catéter preempaquetada en un tubo de microcentrífuga estéril de 1,5 ml.
NOTA: La solución de bloqueo del catéter está compuesta de solución salina heparinizada (0,4% v/v de heparina sódica) mezclada con glicerol (v/v,1:1). - Mezcle 1 g de heparina sódica en 100 ml de solución salina normal para preparar solución salina heparinizada al 1%.
- Disuelva el meloxicam en solución salina normal para preparar una solución de concentración de 2 mg/ml para el alivio del dolor postoperatorio.
NOTA: La solución salina heparinizada preparada y la solución de meloxicam se filtran a través de un filtro de 0,22 μm. Todas las soluciones se esterilizan y almacenan a 4 °C para su uso futuro.
- Alícuota de 200 μL de solución de bloqueo de catéter preempaquetada en un tubo de microcentrífuga estéril de 1,5 ml.
- Instrumentos y materiales quirúrgicos
- Empaque todas las herramientas quirúrgicas limpias en una bolsa y péguelas con cinta adhesiva con un trozo de cinta de esterilización en autoclave. Consulte la Figura 1A para conocer los instrumentos quirúrgicos específicos utilizados.
- Autoclave la bolsa quirúrgica a 121 °C durante 30 min para el uso al día siguiente.
- Preparación animal
- Antes de la cirugía, aloje a todas las ratas macho Sprague-Dawley (SD) en la sala de animales estándar con temperatura controlada a 22 ± 1 ° C. Aliméntelos con los alimentos y agua de laboratorio estándar ad libitum durante al menos 7 días.
NOTA: Tanto las ratas macho como las hembras se pueden usar para el modelo JVC, y sus edades y pesos corporales típicos varían de 9 a 14 semanas y 294 ± 57 g, respectivamente. - Anestesiar a la rata con 3%-3.5% de isoflurano mezclado con oxígeno en una cámara de preanestesia. Determine si la rata queda inconsciente por la falta de respuesta al pellizco del pie.
- Saque suavemente la rata, coloque la nariz de la rata en una pieza nasal anestésica que suministre 2% -2.5% de isoflurano.
- En la posición ventral y dorsal, retire el pelaje a fondo alrededor de su hombro derecho y las áreas posteriores del cuello con crema depilatoria y una maquinilla de afeitar para mascotas. Devuelva la rata a la jaula para la cirugía que se realizará al día siguiente.
- Antes de la cirugía, aloje a todas las ratas macho Sprague-Dawley (SD) en la sala de animales estándar con temperatura controlada a 22 ± 1 ° C. Aliméntelos con los alimentos y agua de laboratorio estándar ad libitum durante al menos 7 días.
2. Antes de la cirugía en el día
- Preparar la estación de trabajo aséptica
- Rocíe alcohol medicinal al 75% para desinfectar el área de operación y luego coloque la almohadilla térmica cubierta con un cojín limpio. Coloque la lámpara LED con una fuente de luz fría al lado de la estación de trabajo.
- Precaliente las soluciones requeridas (paso 1.1) a temperatura ambiente.
- Llene 0,6 ml de solución salina heparinizada y 0,15 ml de solución de bloqueo de catéter en dos jeringas estériles de punta roma de 1,0 ml, respectivamente. Retire 2,5 ml de la solución salina normal con una jeringa estéril de 5,0 ml.
- Remoje las bolas de algodón en alcohol medicinal al 75%. Exprima el exceso de etanol antes de usarlo.
- Pesa y registra el peso corporal de la rata.
3. Durante la cirugía
- Preparación quirúrgica
- Use la bata quirúrgica, los guantes estériles y la máscara facial. Luego abra la bolsa quirúrgica esterilizada, deje todas las herramientas quirúrgicas en alcohol medicinal al 75% y séquelas antes de usarlas.
- Aislamiento de la vena yugular
NOTA: El tiempo estimado de operación para esta parte es de 10 min.- Anestesiar a la rata lista para la cirugía y afeitada con 3%-3.5% de isoflurano mezclado con oxígeno en una cámara de inducción y determinar si la rata queda inconsciente por la falta de respuesta al pellizco del pie.
- Coloque la nariz de la rata en la pieza nasal suministrada con 2% -2.5% de isoflurano para mantener la anestesia.
- Inyecte por vía subcutánea (s.q.) solución de meloxicam a una dosis de 2 mg/kg.
NOTA: Asegúrese de seleccionar analgésicos que no interactúen con el compuesto farmacológico de interés en el estudio farmacocinético. - Usando cinta adhesiva, sujete los antebrazos de la rata en su posición ventral a cada lado de la plataforma quirúrgica.
- Frote suavemente el área quirúrgica alternando entre bolas de algodón empapadas en alcohol medicinal al 75% y exfoliante a base de yodo para un total de tres veces.
- Levante cuidadosamente la piel cerca de la clavícula en el lado derecho de la línea media del cuello con fórceps y haga una incisión hacia el pecho de aproximadamente 1.5-2.0 cm de longitud con un par de tijeras quirúrgicas.
- Diseccionar la cubierta de tejido delgado con tijeras de iris para exponer la vena yugular inferior. El extremo cefálico proximal de la vena yugular externa consta de dos ramas, que se pueden identificar visualmente.
NOTA: Dependiendo de la edad y el sexo de la rata, el tejido blando (por ejemplo, glándulas salivales, ganglios linfáticos y tejidos grasos) que cubre la vena yugular varía. En comparación con las ratas jóvenes, las ratas viejas son más gordas (por ejemplo, BW > 300 g) y, por lo tanto, necesitan más separación de tejido antes de que la vena yugular sea visible. - Levante la vena yugular junto con sus tejidos membranosos conectivos para visualizar el ganglio linfático unido a la vena yugular. Separe cuidadosamente la vena a lo largo de la dirección vascular del músculo circundante, la grasa y otros tejidos.
- Empuje las pinzas debajo de la vena yugular sin dañar los vasos sanguíneos colaterales y pase dos piezas de sutura 6-0 debajo de la vena para marcar los dos extremos del vaso sanguíneo individualmente.
- Tire de una pieza de la sutura lo más lejos posible hacia la cabeza de la rata y ligar la vena cranealmente con 2-3 nudos usando fórceps.
- Coloque la segunda ligadura en el extremo caudal de la vena con 1 nudo suelto.
- Canulación de la vena yugular
NOTA: El tiempo estimado de operación para esta parte es de 15 min.- Abra el envase que contiene el catéter de poliuretano (PU) de 11 cm (I.D. 0,6 mm x O.D. 0,9 mm, Figura 1B) y conecte el catéter a la jeringa de punta roma preparada llena de solución salina heparinizada.
- Empuje lentamente la solución salina heparinizada en el catéter para evitar burbujas de aire.
- Empuje el lado plano sin punta de las pinzas debajo de la vena yugular para salir por el otro lado. Haga un pequeño corte en forma de V en la vena cerca de la corbata craneal con un par de micro tijeras castroviejo y abra suavemente la incisión con la punta de las pinzas dilatadoras del vaso del codo.
NOTA: Enjuague la incisión con solución salina normal precalentada (37 °C) si brota una pequeña cantidad de sangre. - Corte la abertura oblicua del extremo frontal del catéter de la vena yugular. Sujete el extremo oblicuo del tubo con fórceps y deslícelo en la vena yugular.
NOTA: Este paso puede necesitar otra persona para facilitar el deslizamiento del catéter. - Mientras avanza el catéter, retire lentamente las pinzas microquirúrgicas del codo y sujete la superficie externa del vaso con fórceps.
NOTA: Si se selecciona el vaso sanguíneo derecho y la punta del catéter se desliza con éxito en el vaso sanguíneo, todo el proceso de inserción del catéter no debe sentir ninguna resistencia al flujo. - Deje de insertar el catéter al golpear la primera marca azul del tubo de PU (Figura 1B), que tiene aproximadamente 3,0 cm de longitud.
- Asegure el catéter insertado a la vena con ligaduras caudales y rostrales con fórceps.
- Enhebrar una sutura 6-0 a través del tejido expuesto en el lado derecho de la incisión con una aguja de sutura (1/2 corte curvo, 12 mm) y atar la ligadura con un hemostático.
- Doble el catéter en la segunda marca azul (Figura 1B) para unirse con la misma ligadura (en el paso 3.3.8) y evitar ocluir el tubo de PU.
- Corte todo el hilo de sutura adicional y cierre el catéter reemplazando la jeringa de punta roma con un tapón de acero inoxidable de 22 G.
- Exteriorización del catéter
NOTA: El tiempo estimado de operación para esta parte es de 10 min.- Coloque la rata en la posición dorsal y limpie suavemente el área entre las escápulas con la bola de algodón empapada en alcohol medicinal al 75%.
- Haga una incisión muy pequeña en el centro del cuello dorsal con tijeras quirúrgicas. A través de la incisión dorsal, guíe y empuje suavemente el trochar debajo de la piel hacia la incisión ventral en el lado derecho del cuello.
- Coloque el catéter venoso en el trochar y luego extraiga y guíe el catéter venoso hacia la incisión dorsal.
- Asegure el catéter exteriorizado en la capa muscular de la misma manera que con la sutura (consulte el procedimiento en los pasos 3.3.8 y 3.3.9).
- Cierre la capa cutánea de las incisiones ventrales y dorsales con la sutura de nylon 6-0 y la aguja de sutura (corte curvo de 3/8, 17 mm). Frote todas las incisiones quirúrgicas con yodóforo.
NOTA: Los clips de la herida son un método alternativo para cerrar la incisión en la piel. - Retire el tapón del catéter sujetando el catéter con las yemas de los dedos. Coloque una jeringa nueva con punta roma y retire lentamente la jeringa para analizar el flujo sanguíneo.
NOTA: Dado que la rata está en posición supina, es posible que no se puedan obtener muestras de sangre. Las muestras de sangre se pueden obtener cambiando a una posición lateral del cuerpo. - Sostenga el catéter nuevamente con las yemas de los dedos e inyecte 0.2 ml de solución salina heparinizada y 0.1 ml de solución de bloqueo en el catéter usando la jeringa de punta roma.
- Sostenga el catéter con las yemas de los dedos y reemplace la jeringa con un tapón de acero inoxidable. Desenganche el catéter y empuje el tapón ligeramente hacia adentro para asegurar la estanqueidad del catéter.
4. Atención postquirúrgica inmediata
- Recupere la rata en la posición de decúbito dorsal enjaulando individualmente con ropa de cama de mazorca de maíz fresca. A menudo, proporcione una almohadilla térmica con temperatura regulada para mantener la temperatura corporal central.
NOTA: Para el bienestar animal, dejar comida y agua en la ropa de cama es una forma efectiva de aliviar el dolor causado por los movimientos del cuello al comer y beber. - Registre la hora de finalización de la cirugía y controle a la rata a intervalos de 2 h durante al menos 4 h. Proporcione analgesia adicional para la recuperación si la rata muestra signos de dolor o angustia.
5. Seguimiento fisiológico y hematológico durante la fase de recuperación
- Controle el peso corporal y la ingesta de alimentos y agua diariamente y registre los datos.
- Para recolectar un pequeño volumen de sangre fresca para la prueba hematológica, coloque a la rata en un retenedor. Abra el tapón e inserte la jeringa en el catéter venoso de PU para asegurarse de que el catéter no esté obstruido.
NOTA: La extracción de sangre se realizó al mismo tiempo diariamente durante 6 días consecutivos. - Deseche la sangre extraída inicialmente, que contiene una mezcla de sangre, solución salina heparinizada y solución de bloqueo del catéter.
- Use una jeringa nueva para recolectar 150 μL de muestra de sangre fresca y transfiera la muestra de sangre al tubo de 0.5 ml que contiene K2EDTA (1.8 mg / ml de sangre) secado por pulverización en la pared del tubo.
NOTA: Si el catéter está bloqueado, se pueden inyectar 0,2 ml de solución salina heparinizada en el catéter para enjuagar el catéter unos minutos antes de la próxima hora de extracción de sangre. - Inyecte solución salina estéril en el mismo volumen para compensar la sangre extraída. Inyecte 150 μL de solución salina normal precalentada (37 °C) e infunda 0,2 ml de solución salina normal heparinizada estéril a través del catéter.
- Inyecte 100 μL de la solución de bloqueo en el catéter para asegurar el sellado y la esterilidad del catéter antes de la siguiente recolección de muestras.
- Analice las muestras de sangre dentro de las 2 h posteriores a la recolección utilizando un contador automatizado de células sanguíneas.
6. Muestreo de sangre repetido para estudios farmacocinéticos de fármacos administrados por vía oral
NOTA: Se sugiere que las ratas con aumento de peso >10 g y nivel hematológico estable se inscriban para futuros estudios. Siguiendo el protocolo actual, las ratas JVC requirieron de 4 a 6 días para recuperarse.
- Después de 4-6 días de cirugía, ayune a la rata durante 12 h con acceso gratuito al agua.
NOTA: Dependiendo del objetivo experimental, el ayuno del animal es opcional. - Sonda oral de la rata en ayunas con ácido elágico bioactivo fenol natural a una dosis de 6 mg/kg con una aguja de sonda recta16.
- Recolectar 200 μL de muestras de sangre en los tubos heparinizados a través de la cánula de la vena yugular en puntos de tiempo predeterminados durante 24 h después de la administración oral. El proceso de recolección de sangre sigue el procedimiento en el paso 5.5.
NOTA: No es necesario cerrar el catéter con la solución de bloqueo hasta que se complete la extracción de sangre. - Centrifuga inmediatamente la muestra de sangre a 3000 x g a 4 °C durante 10 min.
- Analizar la muestra de plasma extraída mediante cromatografía líquida-espectroscopia de masas17,18.
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Representative Results
Este protocolo ha demostrado a fondo cómo establecer un modelo JVC a largo plazo utilizando habilidades microquirúrgicas para la recolección de sangre en serie. La Figura 1A muestra los instrumentos y materiales quirúrgicos esenciales utilizados para llevar a cabo la cirugía. También se ilustra la especificación del catéter de PU con tres marcas azules, lo que es útil para guiar al investigador a colocar la cánula venosa en el paso 3.3., cómo usar las marcas en el catéter de PU para guiar la canulación (Figura 1B). También es importante conocer la línea de tiempo requerida para establecer el modelo de rata JVC (Figura 1C). Aunque el tiempo de operación para el JVC es de aproximadamente 35 minutos, si el investigador es hábil, toma de 10 a 14 días (la fase de adaptación y recuperación) para que el modelo de rata JVC esté listo para su uso, en comparación con el enfoque no quirúrgico, como el corte de la cola o la punción del seno orbitario, que se puede usar inmediatamente con el entrenamiento adecuado.
También se investigaron las condiciones fisiológicas y hematológicas durante 6 días postoperatorios (Figura 2). El aumento de peso corporal de la rata, la ingesta de alimentos y agua, y el recuento completo de células sanguíneas fueron variables durante la fase de recuperación (Figura 2A, B). Se encontró que la mayoría de las ratas bajo la presente condición de estudio se recuperan dentro de los 4-6 días posteriores a la cirugía, como lo demuestran los niveles restaurados de algunas características clave, como el aumento de peso corporal >10 g, la ingesta regular de dieta y los componentes sanguíneos seleccionados relacionados con la infección, la deshidratación y la inflamación, incluido el recuento de glóbulos blancos, el recuento de glóbulos rojos, hemoglobina y recuento de plaquetas (Figura 2C-F). Vale la pena señalar que la cantidad de ingesta de agua en ratas fue relativamente grande en el primer día después de la operación, lo que indica deshidratación.
La farmacocinética del polifenol natural, ácido elágico se estudió en el modelo de rata JVC establecido (Figura 3). El ácido elágico se caracteriza por una mala biodisponibilidad del fármaco. Cuando se administra en una dosis baja (por ejemplo, 6 mg/kg), se requiere un gran volumen de muestra de sangre para detectar su concentración en el plasma. La Figura 3 muestra una baja concentración plasmática de ácido elágico en ng/mL durante 24 h y su variada absorción en el tracto gastrointestinal (GIT) debido a su escasa solubilidad y permeabilidad.
Figura 1: Descripción general de los principales instrumentos y suministros quirúrgicos utilizados para el establecimiento del modelo de rata JVC. (A) Arriba: a-d es solución salina normal, yodóforo, artículos de plástico, botella de spray con 75% de alcohol medicinal, respectivamente; Medio: e-o es una jeringa de 5.0 ml, una jeringa de 1.0 ml, una jeringa de punta roma, cánula estéril, tijeras quirúrgicas, tijeras de iris, pinzas semicurvas, pinzas balanceadas dilatadoras de vasos, micro tijeras castroviejo, trochar de acero inoxidable, maquinilla de afeitar para mascotas, respectivamente; abajo: p-w son hisopos de algodón, hilo de sutura de nylon no absorbible estéril 6-0, bolas de algodón, dos tipos de aguja de sutura, tapón de acero inoxidable, hemostático curvo, cinta adhesiva, pieza nasal anestésica, respectivamente. (B) Especificación del catéter de PU utilizado para la canulación de la vena yugular en ratas. El catéter mide 11 mm de longitud total con O.D 0,6 mm x I.D 0,9 mm. El catéter tiene tres marcas azules para servir como punto de anclaje durante la canulación; (C) Cronología sugerida para establecer el modelo de rata JVC. En este estudio, el peso corporal de la rata, así como la ingesta de alimentos y agua, se registraron diariamente durante la fase de recuperación, y las muestras de sangre se recolectaron una vez al día para el monitoreo hematológico de rutina. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 2: Monitorización fisiológica y hematológica de ratas durante 6 días postoperatorios. (A) Cambio de peso corporal; B) El cambio en la ingesta de agua y alimentos; (C-F) Recuento de glóbulos blancos, recuento de glóbulos rojos, hemoglobina y recuento de plaquetas, respectivamente. Los datos representan la media ± SEM con n = 6. Los valores numéricos en azul representan el valor medio. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 3: Perfiles plasmáticos de concentración de ácido elágico-tiempo de ratas durante 24 h después de la sonda oral. Los datos representan la media ± SEM con n = 3. Los valores de los parámetros PK se obtienen mediante el programa de complementos PKSolver en un software de hoja de cálculo (por ejemplo, Microsoft Excel)19. Cmáx.: concentración máxima, Tmáx.: tiempo para alcanzar Cmáx.; AUCinf: área bajo la curva de concentración plasmática-tiempo desde el tiempo cero hasta el infinito. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
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Discussion
Dominar la técnica de canulación de vasos requiere una práctica significativa y aprender la lección de cada operación. Christakis et al. utilizando el análisis de suma acumulativa (CUSUM), encontraron que un investigador necesita practicar 200 ratas durante un período de un año antes de estar listo para la evaluación pk de los candidatos a fármacos20. Sin embargo, el tiempo de operación requerido para la canulación de la vena puede reducirse significativamente por el número de ratas realizadas13,20. Usando nuestro protocolo, la tasa de éxito de la canulación efectiva de la vena yugular y la recolección de la muestra de sangre aumentó de aproximadamente el 50% a más del 80% (el total de ratas realizadas fue de 15), y el tiempo de operación inicial se redujo a 35 min desde 2 h.
La demostración de establecer un modelo de rata JVC implica varios pasos críticos. En primer lugar, el área de incisión alrededor del cuello es importante para localizar inicialmente la vena yugular. Si se realiza la JVC derecha, generalmente se selecciona el área de incisión en la parte superior de la clavícula a lo largo del lado derecho de la línea media del cuello (ver sección 3.2 Aislamiento de la vena yugular). En segundo lugar, JVC depende de la preparación de un segmento limpio de la vena. Tras la disección contundente del tejido blando, la vena yugular es visible e identificada por estas dos características: 1) dos ramas en el extremo proximal, y 2) un ganglio linfático unido a ella. En tercer lugar, al deslizar el catéter hacia la vena yugular (ver sección 3.3 canulación de la vena yugular), recortar la parte frontal del catéter y apoyar el vaso sanguíneo con fuerza externa constante podría mejorar en gran medida la tasa de éxito de la canulación. Además, se debe proporcionar analgesia y calor adecuados para reconfortar a la rata, ya que el estrés y el dolor pueden causar alteraciones en el comportamiento del animal que pueden influir en su recuperación postoperatoria. Por último, la duración de la anestesia, la pérdida de calor y la complicación pueden causar la muerte inesperada de la rata; por lo tanto, es importante monitorear de cerca a las ratas durante y después de la cirugía durante al menos 3 días. La evaluación de múltiples indicadores de salud, como el aumento de peso corporal, la dieta y el estado de consumo de alcohol, y los componentes hematológicos de las ratas durante el período de recuperación, podría proporcionar información que pueda compararse con los valores de referencia de interés de las ratas SD sanas en la base de datos 21,22,23,24 . Si las ratas experimentan deshidratación, los fluidos isotónicos estériles al 3% -5% del peso corporal se pueden inyectar por vía subcutánea al final de la cirugía para compensar la pérdida de líquido. La mayoría de las ratas aumentan su peso corporal (por ejemplo, >10 g) para el día 3 después de la cirugía y, por lo tanto, deben estar listas para su uso. Sin embargo, para los estudios que involucran la evaluación de biomarcadores sanguíneos (por ejemplo, leucocitos, citoquinas), se recomienda inscribir a las ratas antes del día 4-6 después de la cirugía, para garantizar los índices hematológicos normales para las ratas.
A pesar de su utilidad en el estudio pk, dependiendo de los materiales del catéter, no todos los candidatos a fármacos son adecuados para la canulación única. Gaud et al. encontraron que los compuestos log P altos estaban unidos al material del catéter de PE, lo que resultó en PK25 alterado. Además, los analgésicos (por ejemplo, meloxicam) a menudo se aplican para reducir el dolor en ratas después de la cirugía. Teniendo en cuenta que la vida media de eliminación de meloxicam es de alrededor de 19-23 h 26,27, la dosis única de meloxicam (2 mg / kg) inyectado s.q. casi se elimina del cuerpo después de 24 h. Sin embargo, las posibles interacciones medicamentosas pueden ocurrir en el uso de meloxicam. Por ejemplo, meloxicam puede competir con otros fármacos para el metabolismo del citocromo P45028,29. Por lo tanto, la dosis y el tipo de analgésicos seleccionados deben ser examinados en función del fármaco elegido para el estudio farmacocinético. Si el medicamento de interés interactúa con meloxicam, se pueden usar otros analgésicos (por ejemplo, buprenorfina).
En conclusión, este protocolo ha demostrado a fondo cómo establecer un modelo de rata JVC a largo plazo para la recolección de sangre en el entorno de laboratorio e investigar el estado fisiológico de las ratas durante la fase de recuperación postquirúrgica. Los pasos y experiencias quirúrgicas vitales destacadas podrían ser útiles para que el investigador logre de manera eficiente la aplicación del modelo de canulación.
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Disclosures
Los autores no tienen nada que revelar.
Acknowledgments
Este trabajo cuenta con el apoyo de la Fundación Nacional de Ciencias Naturales de China (No. 82003692) a R.X. Zhang; Beca Académica Superior en la Universidad Politécnica del Noroeste a R. Miao.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.5 mL test tube containing EDTA anticoagulant | Xinkang | N/A | collecting blood samples for hematology test |
| 0.5*20 mm 1.0-mL syringe | KLMEDICAL | N/A | washing or replacing the fluid with saline |
| 0.6*28.5 mm 5.0-mL syringe | HD | N/A | Subcutaneous injection |
| 1.0-mL Blunt tipped syringe (22G) | skillsmodel | S4-PKT22G | Inject the saline and collect blood samples through catheter |
| 1.5 mL sterile microcentrifuge tube | Axygen | MCT-150-C-S | Store sterile catheter lock solution heparinized saline and meloxicam solution |
| 1.5 mL microcentrifuge tubes | Biosharp | BS-15-M | blood collection |
| 1/2 circle cutting 5*12 mm suture needle | skillsmodel | S4-FHZ | Thread the muscle layer to fix the catheter |
| 3/8 circle cutting 7*17 mm suture needle | skillsmodel | S5-FHZ | Suture the incision of rat cortex |
| 6-0 sterile non-absorbable silk suture thread | JUNSHENG | N/A | ligature |
| 75% medical alcohol | HONGSONG | N/A | Disinfection |
| Adhensive tape | LIUTAI | N/A | positioning the rat |
| Autoclave sterilization tape | Biosharp | BS-QT-028 | Mark sterilized items |
| Automated blood cell counter | Sysmex | XN-550 | Hematology test |
| Castroviejo micro scissors | skillsmodel | WA1010 | Cut the opening in the blood vessel |
| Centrifuge | Thermo Fisher Scientific | 75002402 | Plasma preparation |
| Clean cushion | Qingjie | N/A | Prepare the operation area |
| Cotton balls | HC | N/A | Wound disinfection and sterilization |
| Cotton swabs | BEITAGOGO | N/A | Disinfection |
| Curved hemostat | skillsmodel | N/A | ligature |
| DN50 Stainless-steel rat restrainer | skillsmodel | S4-RGDQ1 | Restrict the movement of rats for easy operation |
| Ellagic acid | Aladdin | E102710-25g | natural phenol for oral administration |
| Half-curved forceps | skillsmodel | 53072 | Lift the muscle layer and tissue, isolate the jugular vein and tie the suture |
| Heating pad | Warm mate | N/A | preventing heat loss of animal |
| Heparin sodium | Solarbio | H8060 | anticoagulant |
| Iodophor | Xidebao | N/A | Clean the wound |
| Iris scissors | skillsmodel | 54002 | Bluent separation the muscle layer |
| Isoflurane | RWD | R510-22-16 | anaesthesia |
| LED lamp | EMPERORFEEL | N/A | sugery |
| Liquid chromatography-mass spectroscopy | Thermo Fisher Scientific | VQF01-20001/ TSQ02-10002 | detection of drug concentration in plasma |
| Meloxicam | Hongqiang | N/A | Analgesic |
| Normal saline | KL | N/A | Prepara the solution and protect blood vessels from drying out |
| Pet razor | Codos | 3180 | Shaving the fur |
| Phosphate-buffered saline | ZHHC | PW012 | Preparation of Ellagic acid solution |
| PU catheter | skillsmodel | RJVC-PU | Jugular vein cannulation |
| Small animal operation anesthesia console | RWD | 68620 | Operation workstation |
| Spray bottle | Other | N/A | aseptic workstation |
| Stainless steel plug (22G) | skillsmodel | S4-PKD22G | Plug the catheter to ensure its sealing |
| Stainless steel trochar | skillsmodel | S$-PKDGZ | Guide the catheter exteriorization |
| Sterile lock solution | skillsmodel | SK-FB | lock the catheter to ensure its sterility |
| Straight feeding needle | skillsmodel | N/A | Oral gavage |
| Surgical pouch | BKMAM | N/A | container for sterilization of surgical instruments |
| Surgical scissors | skillsmodel | J21070 | Cut incision on rat skin |
| Vessel dilator balanced forceps | skillsmodel | WA3020 | Expand the blood vessel and guide the cannula to slide in |
| ZS-MV Small animal anesthesia machine | ZSLab | 1057003 | inducing and maintaining anaesthesia |
References
- Parasuraman, S., Raveendran, R., Kesavan, R. Blood sample collection in small laboratory animals. Journal of Pharmacology and Pharmacotherapeutics. 1 (2), 87-93 (2010).
- Sadler, A. M., Bailey, S. J. Validation of a refined technique for taking repeated blood samples from juvenile and adult mice. Laboratory Animals. 47 (4), 316-319 (2013).
- Zhang, R. X., et al. Coordinating biointeraction and bioreaction of a nanocarrier material and an anticancer drug to overcome membrane rigidity and target mitochondria in multidrug-resistant cancer cells. Advanced Functional Materials. 27 (39), 12 (2017).
- Zhang, R. X., et al. Polymer-lipid hybrid nanoparticles synchronize pharmacokinetics of co-encapsulated doxorubicin-mitomycin C and enable their spatiotemporal co-delivery and local bioavailability in breast tumor. Nanomedicine-Nanotechnology Biology and Medicine. 12 (5), 1279-1290 (2016).
- Zhang, R. X., et al. Sample extraction and simultaneous chromatographic quantitation of doxorubicin and mitomycin C following drug combination delivery in nanoparticles to tumor-bearing mice. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (128), e11 (2017).
- Bakar, S. K., Niazi, S. Simple reliable method for chronic cannulation of the jugular vein for pharmacokinetic studies in rats. Journal of Pharmaceutical Sciences. 72 (9), 1027-1029 (1983).
- Harms, P. G., Ojeda, S. R. A rapid and simple procedure for chronic cannulation of the rat jugular vein. Journal of Applied Physiology. 36 (3), 391-392 (1974).
- Thrivikraman, K. V., Huot, R. L., Plotsky, P. M. Jugular vein catheterization for repeated blood sampling in the unrestrained conscious rat. Brain Research Protocols. 10 (2), 84-94 (2002).
- Weeks, J. R., Davis, J. D. Chronic intravenous cannulas for rats. Journal of Applied Physiology. 19 (3), 540-541 (1964).
- Goldkuhl, R., et al. Plasma concentrations of corticosterone and buprenorphine in rats subjected to jugular vein catheterization. Laboratory Animals. 44 (4), 337-343 (2010).
- Steffens, A. B. A method for frequent sampling of blood and continuous infusion of fluids in the rat without disturbing the animal. Physiology & Behavior. 4 (5), 833-836 (1969).
- Terao, N., Shen, D. D. Alterations in serum protein binding and pharmacokinetics of l-propranolol in the rat elicited by the presence of an indwelling venous catheter. Journal of Pharmacology and Experimental Therapeutics. 227 (2), 369-375 (1983).
- Feng, J., et al. Catheterization of the carotid artery and jugular vein to perform hemodynamic measures, infusions and blood sampling in a conscious rat model. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (95), e51881 (2015).
- Karim, N., Ali, S. Jugular vein cannulation in rats - A mini review. Canadian Journal of Pure and Applied Sciences. 3, 929-935 (2009).
- Ling, S., Jamali, F. Effect of cannulation surgery and restraint stress on the plasma corticosterone concentration in the rat: application of an improved corticosterone HPLC assay. Journal of Pharmacy & Pharmaceutical Sciences. 6 (2), (2003).
- Lei, F., et al. Pharmacokinetic study of ellagic acid in rat after oral administration of pomegranate leaf extract. Journal of Chromatography B-Analytical Technologies in the Biomedical and Life Sciences. 796 (1), 189-194 (2003).
- Yan, L. L., et al. Method development and validation for pharmacokinetic and tissue distributions of ellagic acid using Ultrahigh Performance Liquid Chromatography-Tandem Mass Spectrometry (UPLC-MS/MS). Molecules. 19 (11), 18923-18935 (2014).
- Long, J. F., et al. Bioavailability and bioactivity of free ellagic acid compared to pomegranate juice. Food & Function. 10 (10), 6582-6588 (2019).
- Zhang, Y., et al. PKSolver: An add-in program for pharmacokinetic and pharmacodynamic data analysis in Microsoft Excel. Computer Methods and Programs in Biomedicine. 99 (3), 306-314 (2010).
- Christakis, I., et al. Learning curve of vessel cannulation in rats using cumulative sum analysis. Journal of Surgical Research. 193 (1), 69-76 (2015).
- Nm, S., Oduola, A. Haematological profile shows that Inbred Sprague Dawley rats have exceptional promise for use in biomedical and pharmacological studies. Asian Journal of Biomedical and Pharmaceutical Sciences. 4 (37), 33-37 (2014).
- Lillie, L. E., Temple, N. J., Florence, L. Z. Reference values for young normal Sprague-Dawley rats: weight gain, hematology and clinical chemistry. Human & Experimental Toxicology. 15 (8), 612-616 (1996).
- He, Q. L., et al. Sex-specific reference intervals of hematologic and biochemical analytes in Sprague-Dawley rats using the nonparametric rank percentile method. PLoS One. 12 (12), 18 (2017).
- EPA. Recommendations for and Documentation of Biological Values for Use in Risk Assessment. U.S. Environmental Protection Agency. , EPA/600/6-87/008 (NTIS PB88179874) (1988).
- Gaud, N., et al. Single jugular vein cannulated rats may not be suitable for intravenous pharmacokinetic screening of high logP compounds. European Journal of Pharmaceutical Sciences. 99, 272-278 (2017).
- Turck, D., et al.
- Aghazadeh-Habashi, A., Jamali, F. Pharmacokinetics of meloxicam administered as regular and fast dissolving formulations to the rat: Influence of gastrointestinal dysfunction on the relative bioavailability of two formulations. European Journal of Pharmaceutics and Biopharmaceutics. 70 (3), 889-894 (2008).
- Ludwig, E., et al. Activation of human cytochrome P-450 3A4-catalyzed meloxicam 5 '-methylhydroxylation by quinidine and hydroquinidine in vitro. Journal of Pharmacology and Experimental Therapeutics. 290 (1), 1-8 (1999).
- Zhang, R. X., et al. Nanoparticulate drug delivery strategies to address intestinal cytochrome P450 CYP3A4 metabolism towards personalized medicine. Pharmaceutics. 13 (8), (2021).
