Demonstramos como estabelecer um modelo murino de implantação de raízes pulmonares na aorta descendente para simular o procedimento ross. Este modelo permite a avaliação a médio/longo prazo da remodelação do autoenxerto pulmonar em posição sistêmica, representando a base do desenvolvimento de estratégias terapêuticas para promover sua adaptação.
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Artigo de método
Um modelo de roedor da operação Ross: Implantação de enxerto de artéria pulmonar sinténica em posição sistêmica
* These authors contributed equally
Neste artigo
Resumo
Resumo
A operação Ross para doença da válvula aórtica recuperou novos interesses devido aos seus excelentes resultados a longo prazo. No entanto, quando empregada como substituição de raiz autônoma, descreve-se a possível dilatação do autoenxerto pulmonar e posterior regurgitação aórtica. Vários modelos animais foram propostos. No entanto, estes geralmente são limitados a modelos ex-vivo ou experimentos in vivo com modelos animais grandes relativamente caros. Neste estudo, buscou-se estabelecer um modelo de roedor de implantação de enxerto de artéria pulmonar (PAG) em posição sistêmica. Um total de 39 ratos adultos de Lewis foram incluídos. Imediatamente após a eutanásia, a raiz pulmonar foi colhida de um animal doador (n=17). Os ratos síndicos (n=17) e operados por farsa (n=5) foram sedados e ventilados. No grupo receptor, o PAG foi implantado com anastomose de ponta a ponta na posição aórtica abdominal infra-renal. Ratos operados por sham foram submetidos apenas à transeção e à re-anastomose da aorta. Os animais foram acompanhados com estudos de ultrassom em série por dois meses e análise histológica pós-morte. O diâmetro médio do PAG na posição nativa foi de 3,20 mm (IQR=3,18-3,23). No seguimento, o diâmetro médio do PAG foi de 4,03 mm (IQR=3,74-4,13) em 1 semana, 4,07 mm (IQR=3,80-4,28) em 1 mês e 4,27 mm (IQR=3,90-4,35) aos 2 meses (p<0,01). A velocidade sistólica máxima foi de 220,07 mm/s (IQR=210,43-246,41) em 1 semana, 430,88 mm/s (IQR=375,28-495,56) em 1 mês, e 373,68 mm/s (IQR=305,78-429,81) aos 2 meses (p=0,02) e não diferiram do grupo operado por farsa no final do experimento (p=0,5). A análise histológica não mostrou nenhum sinal de trombose endotelial. Este estudo mostrou que modelos de roedores podem permitir a avaliação da adaptação a longo prazo da raiz pulmonar a um sistema de alta pressão. Uma implantação sistênica de PAG sistênica representa uma plataforma simples e viável para o desenvolvimento e avaliação de novas técnicas cirúrgicas e terapias medicamentosas para melhorar ainda mais os resultados da operação Ross.
Introdução
A estenose da válvula aórtica congênita é um subgrupo de doença cardíaca congênita caracterizada por uma obstrução do trato ventricular esquerdo no qual a lesão está localizada no nível valvular. A malformação afeta aproximadamente 0,04-0,38 por 1000 nascidos vivos1.
As opções disponíveis para a correção são muitas, cada uma com suas próprias vantagens e desvantagens. Para pacientes adequados para correção biventricular2, a abordagem pode ser direcionada para reparação da válvula (valvulotomia percutânea ou cirúrgica) ou sua substituição3. Esta última é a preferida quando a válvula aórtica é considerada inalvagável; no entanto, as opções disponíveis são limitadas para pacientes pediátricos. De fato, as válvulas bioprostéticas não são indicadas para substituição aórtica na população jovem devido à sua calcificação precoce4. Por outro lado, a degeneração em válvulas mecânicas é consideravelmente mais lenta, mas estas requerem terapia anticoagulante ao longo da vida5. Além disso, a maior limitação dessas próteses é representada pela falta de potencial de crescimento, o que predispõe os pacientes a reintervenções adicionais.
Uma opção terapêutica interessante na população pediátrica é a transferência do autoenxerto pulmonar para a posição aórtica chamada "Operação Ross". Neste caso, a válvula pulmonar é então substituída por um homoenerto (Figura 1)6. Este procedimento pode possivelmente representar a melhor escolha cirúrgica para as crianças porque o autoenxerto pulmonar preserva seu potencial de crescimento e não carrega os riscos da terapia anticoagulante ao longo da vida. Além disso, o procedimento Ross pode ser de grande valor também em adultos jovens para evitar uma válvula mecânica ou biológica, tendo o potencial de se tornar a melhor solução cirúrgica.
Os resultados após a substituição da válvula aórtica com autoenxerto pulmonar são excelentes, com sobrevida superior a 98% e bons resultados a longo prazo7. Estudos de literatura relatam 93% e 90% de liberdade de substituir o homoenerto pulmonar aos 4 e 12 anos, respectivamente, 8 anos.
A maior limitação deste procedimento é a tendência do autoenxerto dilatar a longo prazo, especialmente quando empregado como uma substituição de raiz autônoma. Isso pode causar incompetência valvular que pode exigir uma reintervenção. De fato, o estudo de acompanhamento mais longo realizado até agora relata a liberdade de reoperação para substituição de autoenxerto de 88% aos 10 anos e 75% aos 20 anos9.
A possibilidade de recriar uma operação Ross em um cenário experimental representa um pré-requisito fundamental para investigar o mecanismo subjacente da adaptação do autoenxerto pulmonar às pressões sistêmicas. Vários modelos foram propostos no passado. No entanto, estes são geralmente limitados a experimentos ex-vivo ou modelos animais in vivo com animais de grande porte relativamente caros. Neste estudo, buscou-se estabelecer um modelo de roedor de implantação de enxerto de artéria pulmonar (PAG) em posição sistêmica, como raiz autônoma.
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Protocolo
Todos os procedimentos foram aprovados pelo Comitê de Atenção Animal da Universidade de Padova (OPBA, protocolo n° 55/2017) e autorizados pelo Ministério da Saúde italiano (Autorização n° 700/2018-PR), em cumprimento à Diretiva da União Europeia 2010/63/UE e à Lei Italiana 26/2014 para o Cuidado e Uso de Animais de Laboratório.
1. Cuidados com animais e modelo experimental
- Certifique-se de que todos os ratos de Lewis sejam obtidos de uma única empresa (Tabela de materiais). Mantenha os ratos em instalações convencionais com livre acesso a comida e água.
- Certifique-se de que o peso dos ratos varia de 320-400 g para o grupo receptor e 200-250 g para o grupo de doadores.
2. Protocolo pré-operatório
NOTA: Todas as operações devem ser realizadas em condições limpas. Use ratos jovens e adultos de Lewis como receptores e doadores também para realizar um transplante sinténico.
- Realize uma injeção intraperitoneal de tramadol (5 mg/kg) 15 minutos antes da cirurgia.
- Administre uma única dose de Gentamicina intramuscular (5 mg/kg) imediatamente antes da cirurgia.
- Para indução de anestesia, forneça 4% de sevoflurano em 1 L/min de oxigênio para uma câmara de poli (metil metil) onde o animal é colocado. Para manutenção da anestesia, utilize 2,0-2,5% de sevoflurano em 1 L/min de oxigênio durante todo o procedimento.
- Raspe o animal ao longo da linha média por 2 cm de largura do esterno até 1 cm acima da área genital com uma navalha. Em seguida, esterilize a pele com solução de iodo.
- Para evitar que o animal se molhe e para evitar a dispersão do calor durante a cirurgia, cubra o animal com uma película plástica transparente.
- Avalie o nível de anestesia antes de realizar o procedimento avaliando a ausência de resposta a um estímulo nocivo.
3. Operação de doadores
- Preparação animal e cardíaca:
- Coloque o animal anestesiado em uma bandeja de rolha com o lado caudal voltado para o cirurgião. Realize uma incisão xipho-púbica de cerca de 5-6 cm, e retraia os dois retalhos musculocutâneos lateralmente.
- Administre um volume de 1 mL de solução salina a 4 °C contendo 500 UI de heparina através da veia cava abdominal.
- Depois de 1 min, corte o diafragma da esquerda para a direita e faça uma toracotomia anterior para expor o coração.
- Esfrie o coração batendo pingando solução salina a 4 °C.
- Realize uma pericardiectomia e uma timectomia para obter uma visão completa do arco aórtico. Remova os tecidos gordurosos restantes ao redor da aorta.
- Corte no arco, logo acima da origem da artéria innominada; cortar o último, também.
- Corte a veia cava inferior torácica (IVC) e insira uma cânula de 22 G para infundir o coração com 20-25 mL de solução salina a 4 °C, exercendo pressão leve. Descontinuar a perfusão quando o coração parar de bater e fluir da aorta ficou claro.
- Explanta PAG:
NOTA: Uma colheita precisa e um manuseio delicado do PAG são obrigatórios para alcançar a implantação ideal no receptor. Não toque diretamente nele com instrumentos, em vez disso use cotonetes de algodão.- Realize um estudo de ultrassom para avaliar o diâmetro da AF em sua posição nativa.
- Insira um micro-plier sob a parede posterior do vaso e corte este último usando uma micro-tesoura o mais perto possível de sua bifurcação para maximizar o comprimento do PAG.
- Segure suavemente o PA com os micro-fórceps com ponta a anel e separe-o do ventrículo direito com a tesoura de micro-mola. Colher o PAG, incluindo alguns músculos ventriculares direito.
- Preparação pag:
- Coloque o PAG em uma gaze umedecida com soro fisiológico frio na mesa de operação e inspecione o vaso sob o microscópio operacional.
- Corte qualquer tecido circundante abundante, deixando apenas 1 mm de músculo ventricular. Coloque o comprimento da nave em 5 mm.
4. Implantação de enxerto de artéria pulmonar (PAG)
- Preparação do animal receptor:
- Coloque o animal anestesiado em uma bandeja de rolha com o lado caudal voltado para o cirurgião.
- Realize uma incisão longitudinal mediana e use dois mini retílos para manter o abdômen aberto.
- Extraia os intestinos com dois cotonetes de algodão e cubra-os com uma gaze encharcada com soro fisiológico de 39 °C permitindo a visualização da área retroperitoneal com exposição da aorta abdominal infra-renal (AA).
NOTA: Durante a cirurgia, é importante ocasionalmente umedecer os intestinos usando uma seringa contendo soro fisiológico de 39 °C para prevenir hipotermia, condição crítica comum em roedores. - Retire o peritônio parietal posterior entre as duas artérias renais e a bifurcação ilíaca usando dois cotonetes de algodão e remova o tecido gorduroso ao redor do AA infrarenal. Deixe apenas uma pequena porção de gordura acima do AA, para facilitar o manuseio no vaso.
- Separe o AA do IVC. Para realizar este procedimento, primeiro, passe um fórceps curvo atrás da parede aórtica posterior e use-a para abrir uma passagem entre o AA e o IVC. Em seguida, use uma sutura de seda 2-0 para criar um loop em torno do AA, a fim de levantar o vaso e separar o AA do IVC. Ligar qualquer artéria lombar decorrente do AA infrarenal com sutura de seda 6/0 e dividi-la.
- Gire o animal 90° no sentido anti-horário, colocando a cabeça no lado esquerdo do operador. O AA agora estava horizontalmente no campo microscópico.
- Use dois clipes Yasargil para fixar o AA infra-renal e colocá-los a uma distância de 1,5 cm um do outro. Transectar o AA no ponto médio entre os dois clipes.
- Irrigar as duas extremidades dos vasos com heparina (1 UI/mL) em solução salina para remover quaisquer coágulos. Remova os detritos aventureiros dos vasos.
- Implantação pag:
- Coloque o PAG entre as duas extremidades, com a extremidade ventricular em direção à porção craniana do animal.
- Use uma sutura de polipropileno 10-0 para realizar dois pontos únicos marcantes ligando o PG ao AA. Realize o procedimento em ambas as extremidades do PAG colocando a sutura em lados opostos da circunferência do vaso.
- Realize uma anastomose de ponta a ponta entre PAG e AA, começando com o final distal. Use uma das duas extremidades da sutura de referência distal para a anastomose posterior usando uma sequência de enxerto para enxerto para realizar uma sutura de execução de cerca de seis pontos.
- Uma vez que a sutura atinja o marco proximal, realize um engate duplo e meio concluído por um nó quadrado usando a sutura e uma das duas extremidades da sutura de marco proximal. Aplique asseps de mosquitos emborrachado nas suturas para fornecer tração.
- Faça a mesma anastomose na parede anterior. Continue todo o procedimento na extremidade proximal do PAG. Tome especial atenção ao realizar a anastomose proximal para evitar incluir qualquer folheto na linha de sutura.
- Solte o clipe distal primeiro para deixar o PAG ser preenchido com sangue retrógrado (fluxo de baixa pressão) a fim de verificar a anastomose. Repare qualquer vazamento de sangue com uma única sutura. Uma vez avaliada a anastomose distal, realize o mesmo procedimento na extremidade proximal.
- Etapas finais da operação no destinatário:
- Avalie a patência do PAG e aplique duas tiras de esponja de gelatina sobre as linhas de sutura em ambos os lados do PAG (se necessário). Exerça pressão suave por alguns segundos com dois cotonetes de algodão para ajudar a hemostasia.
- Realoque os intestinos na cavidade abdominal e feche as paredes com uma sutura de polipropileno 4/0.
5. Procedimento operado por Sham
- Realize uma preparação idêntica do animal como ilustrado anteriormente para ratos receptores.
- Corte o AA infra-renal, no meio do caminho entre a origem renal e as artérias ilíacas.
- Reaproximar as duas extremidades do AA usando uma anastomose de ponta a ponta, como descrito anteriormente. Remova os dois clipes e realize um procedimento preciso de hemostasia.
- Reposicione os intestinos e feche a parede abdominal em camadas, como para os animais receptores.
6. Cuidados pós-operatórios e acompanhamento
- Administre a solução salina quente (5 mL) no tecido subcutâneo das costas do animal para hidratação. Coloque o rato sob uma lâmpada de aquecimento e monitore-o visualmente até o despertar, que geralmente leva até 5 minutos após a anestesia ser interrompida. Coloque o animal em uma gaiola a uma temperatura ambiente de 22-24 °C, com acesso imediato e irrestrito à comida e água.
- Administrar tramadol intramuscular (5 mg/kg) para analgesia pós-operatória duas vezes por dia durante as primeiras 48 horas após a cirurgia. Posteriormente, monitore diariamente o estado de saúde e o peso corporal do receptor.
- Acompanhamento: Durante o acompanhamento, realize estudos de ultrassom em uma semana, um mês e dois meses para avaliar a função PAG. Durante esses estudos, meça o diâmetro do vaso, o pico da velocidade sistólica (PSV) e a velocidade diatólica final. Meça esses parâmetros dentro do PAG e ao nível de AA proximal e distal.
- Eutanize os animais após dois meses de acompanhamento por aplicação de CO2 por alguns minutos, e depois explane o PAG, que passará por análise histopatológica.
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Resultados
Um total de 39 ratos adultos de Lewis foram incluídos neste estudo: 17 animais foram usados como doadores de PAG, 17 animais como receptores e 5 como operados por farsa (grupo controle) (Tabela 1). Os ratos do sexo masculino foram 22 (56%) e as do sexo feminino 17 (44%); estes últimos foram utilizados apenas no grupo de doadores.
Nenhum evento fatal ocorreu durante a operação com 100% de sobrevivência. Durante o acompanhamento, dois animais do grupo transplantado tiveram desfe...
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Discussão
A substituição da válvula aórtica com a raiz pulmonar autóloga (operação Ross) representa uma opção atraente para o reparo da estenose da válvula aórtica congênita devido ao perfil favorável e ao crescimento potencial do autoenxerto10. A maior limitação para este procedimento é a dilatação potencial da neorre válvula aórtica, que predispõe ao desenvolvimento da regurgitação a longo prazo. A possibilidade de caracterizar as modificações na artéria pulmonar após a exposição a pressões sistêmicas pod...
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Divulgações
Os autores não têm nada a revelar.
Agradecimentos
O estudo foi financiado pelo orçamento integrado para pesquisa interdepartamental (BIRD) 2019.
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Materiais
| Nome | Empresa | Número de catálogo | Comentários |
|---|---|---|---|
| Cloreto de sódio a 0,9% | Monico SpA | AIC 030805105 | Dois frascos de 100 mL. O frio (4° C) para a lavagem do órgão de colheita; O Quente (39° C) para umedecimento e reidratação do receptor |
| 7,5% de iodopovidona | B Braun | AIC 032151211 | |
| Barraquer | Aesculap | FD 232R | Porta-microagulhas reto para as anastomoses vasculares |
| Porta-agulhas Castroviejo | Não disponível | J 4065 | Para fechar o animal |
| Pinça de aplicação de clipe | Rudolf Medical | RU 3994-05 | Para aplicação de clipe |
| Cotonetes | Johnson & amp Johnson Medical SpA | N/A | Produto de supermercado. |
| Pinça de microjoalheiro curvada | Rudolf Medical | RU 4240-06 | Usado para passar suturas por baixo dos vasos. |
| Creme depilatório | RB healthcare | N/A | Produto de supermercado |
| Máquina de eletrocautério | LED SpA | Surton 200 | |
| Tesoura fina | Rudolf Medical | RU 2422-11 | Para abrir o abdômen (receptor) |
| Micro tesoura Vannas curva de ponta fina | Aesculap | OC 497R | Apenas para preparar a raiz pulmonar, corte os vasos lombares e o Prolene |
| 10/0Unidade de limpeza de isoflurano / halotano Fluovac | Harvard Apparatus Ltd | K 017041 | Completo de máquina de anestesia, tubo de anestesia, câmara de indução e unidade de limpeza com filtro absorvível |
| Gentamycin | MSD Italia | Srl AIC 020891014 | Antibiótico. Dose única, 5 mg / kg intramuscular, administrada durante a cirurgia |
| Heparin | Pharmatex Italia Srl | AIC 034692044 | 500 UI na veia cava abdominal receptora |
| Cateter IV | Smiths Medical Ltd | 4036 | Seringa de insulina 20G |
| , 1 mL | Fisher Scientific | 14-841-33 | Para injetar heparina no animal de colheita e lavar a aorta seccionada no receptor |
| Pinça bipolar de joalheiro | GIMA SpA | 30665 | ponta de 0,25 mm. Para eletrocautério de vasos muito pequenos |
| Ratos Lewis (LEW/HanHsd) | Envigo RMS SRL, San Pietro al Natisone, Udine, Itália | 86104M | Macho ou fêmea, pesando 200-250 g (animais que colhem raízes pulmonares) e 320-400 g (receptores) |
| Micro-Mosquito | Rudolf Medical | RU 3121-10 | Em número de quatro, com pontas cobertas com tubos de silicone. Para manter em tração a sutura de Prolene durante a anastomose |
| Microscópio cirúrgico | Leica Microsystems | M 400-E | Usado com ampliações intercambiáveis de 6x, 10x e 16x no procedimento |
| Perma-Hand silk 2-0 | Johnson & Johnson Medical SpA | C026D | Para levantar a aorta |
| Pomada oftálmica Petrolatum | Dechra | NDC 17033-211-38 | |
| Prolene 10-0 | Johnson & Johnson Medical SpA | W2790 | Sutura não absorvível muito fina, com uma agulha de corpo redondo BV75-3, para as anastomoses vasculares |
| Retractores | Não qualquer | N/A | Dois retractores caseiros |
| Micro fórceps de ponta de anel | Rudolf Medical | RU 4079-14 | Para manipulação delicada |
| Sevoflurane | AbbVie Srl | AIC 031841036 | Misturado com oxigénio, para anestesia |
| inalatóriaMicrotesoura tipo mola | Rudolf Medical | RU 2380-14 | Reta; 14 cm de comprimento |
| Clipes padrão para aneurisma | Rudolf Medical | RU 3980-12 | Dois clipes (7,5 mm; 180 g; 1,77 N) para fechar a aorta |
| Gaze estéril de material não tecido | Luigi Salvadori SpA | 26161V | 7,5x7,5 cm, quatro camadas |
| Tesoura reta Doyen | Rudolf Medical | RU/1428-16 | Para uso no doador |
| Pinça de microjoalheiro reta | Rudolf Medical | RU 4240-04 | 10,5 cm de comprimento. Utilizado em toda a anastomose |
| Seringas | Artsana SpA | N/A | 20 mL (para o animal de colheita) e 5 mL (para o receptor). Para lavagem e imersão salina |
| TiCron 4-0 | Covidien | CV-331 | Para fechar músculos e pele |
| Fórceps de tecido V. Mueller | McKesson | CH 6950-009 | Usado para pele e músculos |
| Tramadol | SALF SpA | AIC 044718029 | Analgésico. Dose única, 5 mg / kg intramuscular |
| Virgin silk 8-0 | Johnson & amp Johnson Medical SpA | W818 | para ligadura de ramo arterial |
Referências
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Reimpressões e permissões
