Artigo de método

Cartografia Química se aproxima para estudar infecção por tripanosmatotida

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DOI:

10.3791/63255

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21 de janeiro de 2022

 ,  ,  , 
1Department of Chemistry and Biochemistry, University of Oklahoma, Norman, 2Laboratories of Molecular Anthropology and Microbiome Research, University of Oklahoma, Norman, 3Department of Anthropology, University of Oklahoma, Norman, 4Department of Microbiology and Plant Biology, University of Oklahoma, Norman

* These authors contributed equally

Neste artigo

Resumo

Este protocolo descreve os passos para gerar um modelo 3D de distribuição metabólica durante a infecção por triplosomatida, incluindo coleta de amostras, extração metabólica, uma visão geral da aquisição de dados de espectrometria de massa de cromatografia líquida-tandem, geração de modelo 3D e, finalmente, visualização de dados.

Resumo

O tropismo patógeno e o tropismo da doença referem-se aos locais de tecido seletivamente colonizados ou danificados por patógenos, levando a sintomas localizados da doença. Os parasitas trypanosomatid humanos incluem Trypanosoma cruzi, o agente causador da doença de Chagas; Trypanosoma brucei, o agente causador da doença do sono; e espécies leishmania, agentes causadores da leishmaniose. Em conjunto, afetam 20 milhões de pessoas em todo o mundo. Esses parasitas apresentam tropismo específico: coração, esôfago, cólon para T. cruzi, tecido adiposo, pâncreas, pele, sistema circulatório e sistema nervoso central para T. brucei, pele para cepas dermotropic Leishmania, e fígado, baço e medula óssea para cepas de Leishmania víscero. Uma perspectiva espacial é, portanto, essencial para entender a patogênese da doença trypanosomatida. A cartografia química gera visualizações 3D da abundância de pequenas moléculas geradas através da espectrometria de massa cromatografia líquida, em comparação aos parâmetros microbiológicos e imunológicos. Este protocolo demonstra como a cartografia química pode ser aplicada para estudar processos patogênicos durante a infecção por tripanosomatidas, a partir da amostragem sistemática de tecido e extração metabólica, seguida pela aquisição de dados de espectrometria de massa da cromatografia líquida-tandem, e concluindo com a geração de mapas 3D de distribuição metabólica. Este método pode ser usado para múltiplas questões de pesquisa, como requisitos de nutrientes para colonização tecidual por T. cruzi, T. brucei ou Leishmania, imunometabolismo em locais de infecção, e a relação entre perturbação metabólica do tecido local e sintomas de doenças clínicas, levando a uma visão abrangente da patogênese da doença trypanosomatid.

Introdução

Os parasitas trypanosomatid consistem em espécies de Leishmania, tripanossomos africanos (Trypanosoma brucei) e trypanossoms americanos (Trypanosoma cruzi). Leishmania protozoário causa leishmaniose, que inclui auto-cura e leishmaniose cutânea localizada auto-limitada, leishmaniose mucocutânea na qual os tecidos mucosas da boca, nariz e garganta ficam danificados, e leishmaniose visceral com tropismo parasita aos órgãos viscerais causando febre e hepatosplenomegaly1,2. T. brucei causa tripanosomiase africana humana (HAT), também conhecida como doença do sono, relatada principalmente em países africanos3. Os sinais e sintomas clínicos incluem hepatosplenomegaly, febre, dor de cabeça, dores musculoesqueléticas, linfadenopatias e anemia no estágio hemo-linfático quando os parasitas se localizam na corrente sanguínea e linfáticas. Isso é seguido pelo estágio meningo-encefálico, onde os parasitas se localizam no sistema nervoso central e causam distúrbios do sono, alteração comportamental e, eventualmente, comas4 fatais. T. cruzi causa doença de Chagas, endêmica nas Américas. Indivíduos infectados experimentam um estágio agudo inicial, geralmente assintomático, com tropismo de parasitas amplos. Cerca de 10%-30% dos indivíduos infectados experimentam sintomas crônicos após décadas de infecção, caracterizados por megaófago, megacólon e complicações cardiovasculares5,6.

Metabolômica estuda pequenas espécies moleculares (50-1.500 Da), incluindo compostos biológicos do metabolismo primário ou secundário e compostos derivados externamente, como drogas ou moléculas derivadas de alimentos. No contexto das interações hospedeiro-patógeno, a metabolômica pode explorar o impacto da infecção em ambientes metabólitos hospedeiros, cruciais para acessar o efeito do patógeno no hospedeiro. Também pode avaliar adaptações patógenas ao ambiente nutricional e imunológico hospedeiro7,8,9. Espectrometria de massa (MS) e espectroscopia magnética nuclear (NMR) são ferramentas comuns de metabolômica usadas para identificar, quantificar e caracterizar metabólitos. Essa abordagem "omics" também pode ser aplicada à descoberta de biomarcadores e ao desenvolvimento de medicamentos10,11.

Dado o tropismo tecidual específico dos parasitas trypanosomatid, as análises de metabolômica espacial podem permitir uma visão significativa da patogênese das doenças que causam. O mapeamento da distribuição espacial dos metabólitos revelou metabólitos localmente afetados pela infecção crônica do Trypanosoma cruzi no tecido cardíaco do rato e infecção aguda e de longo prazo do Trypanosoma cruzi no trato gastrointestinal do camundongo6,12,13. Especificamente, a cartografia química 3D demonstrou uma desconexão entre persistência de parasitas e alterações metabólicas no tecido cardíaco de camundongos cronicamente infectados por Trypanosoma cruzi. O metabolismo foi mais perturbado em segmentos inferiores e apical do coração, combinando com locais de sintomas da doença de Chagas (aneurismas a apical cardíaco). As famílias metabólitos perturbadas pela infecção em locais cardíacos específicos e correlacionadas com a gravidade da doença incluem acircarnitinas e glicerofosforocolinas12,13,14. No trato gastrointestinal, alterações metabólicas persistentes concordaram com locais de sintomas da doença de Chagas: esôfago e cólon. Em contrapartida, o metabolismo é rees normalizado em locais não associados aos sintomas da doença de Chagas, como o intestino delgado. Metabólitos localmente perturbados pela infecção no trato gastrointestinal incluem acicicnitinas, glicerofosforos, kynurenine, triptofano e ácido cholico. Além disso, essas análises permitiram a identificação de um novo mecanismo metabólico de tolerância à doença de Chagas6. A aplicação desses métodos ao estudo da leishmaniose cutânea revelou perturbações metabólicas significativas no local da lesão, mas também alterações metabólicas específicas no tecido adjacente à lesão, macroscopicamente saudável. Por exemplo, a glutamina foi esgotada no local da lesão, enquanto as glicerofosforosforolinas no m/z (proporção massa para carga) 200-299, 400-499, 500-599 e 600-699 foram significativamente aumentadas no local da lesão. O PC (O-34:1) só foi aumentado em locais adjacentes à lesão15.

O objetivo deste manuscrito é demonstrar os passos necessários para gerar modelos 3D de distribuição metabólica ("cartografia química") aplicadas aos modelos de infecção por parasitas trypanosomatid (Figura 1). Essa abordagem baseia-se em vários avanços críticos no contexto do processamento de dados metabolômicos e metabolômicos, particularmente o desenvolvimento de software 'ili para traçar dados metabolômicos em modelos 3D facilmente16.

Protocolo

Todos os experimentos em animais descritos foram aprovados pela Universidade de Oklahoma ou pelo Comitê Institucional de Cuidados e Uso de Animais da Universidade da Califórnia em San Diego. Todas as etapas de manuseio de material infeccioso foram realizadas dentro de um armário de biossegurança (classe II, tipo A2) e de acordo com as normas locais.

1. Coleta de tecidos

  1. Infecte modelos animais de infecção por trippanosomatidos apropriados, geralmente ratos ou hamsters.
    NOTA: Há uma variedade considerável de modelos de camundongos para infecção por triplosomatida, dependendo dos sintomas desejados a serem produzidos, velocidade de progressão da doença, gravidade da doença, etc. Os usuários podem escolher à sua conveniência.
    1. Para modelos de infecção por leishmaniose cutânea, infecte subcutâneamente no footpad ou intradermally no ouvido15.
    2. Para modelos de infecção por leishmaniose visceral, infecte por via intravenosa1,17.
    3. Para modelos de infecção pela doença de Chagas e doença do sono, infectar intraperitoneally6,12,18,19. Determine a dose do parasita para usar com base na cepa do parasita e pontos de tempo planejados.
  2. Planeje posições de secção.
    1. Planeje gerar seções com um mínimo de 10 mg de tecido por seção. É melhor usar 30-50 mgs.
    2. Para modelos de infecção pela doença de Chagas, planeje coletar segmentos cardíacos e gastrointestinais sistematicamente.
    3. Para modelos de infecção por leishmaniose cutânea, coletar tecido lesão e amostras adjacentes à lesão.
    4. Para modelos de infecção por leishmaniose visceral, planeje coletar baço e lóbulos de fígado múltiplos. Outros locais de tecido, como tecido adiposo, também podem ser de interesse para coletar.
      ATENÇÃO: As amostras de animais infectados devem ser tratadas sob o protocolo de biossegurança aprovado institucionalmente. Isso geralmente envolverá requisitos de equipamentos de proteção individual (EPI) e apenas tubos de abertura e coleta de amostras dentro de um armário de biossegurança (classe II, tipo A2).
  3. Rotular e pesar tubos para homogeneização.
    1. Use o tipo de tubo apropriado para o sistema de homogeneização disponível. Para um TissueLyser, use tubos de microcentrifuus de 2 mL.
    2. Eutanize camundongos nos pontos de tempo de infecção desejados usando overdose de isoflurane, conforme aprovado pelo IACUC institucional ou de acordo com o protocolo aprovado pela IACUC.
    3. Tecido de seção sistematicamente como planejado, com uma seção por tubo.
    4. Lembre-se de lavar equipamentos de coleta de amostras entre amostras com solvente de extração (50% de metanol neste protocolo).
  4. Mantendo a tampa do tubo aberta, imediatamente encaixe amostras de congelamento em nitrogênio líquido.
    ATENÇÃO: Não feche os tubos até que qualquer nitrogênio líquido introduzido no tubo tenha evaporado totalmente para evitar que os tubos explodam à medida que o nitrogênio se expande. Tome as medidas adequadas para garantir que a pele não entre em contato com nitrogênio líquido (use luvas criogênicos e fórceps para segurar os tubos). Use um escudo de segurança.
  5. Armazene os tubos em gelo seco até que todas as amostras desejadas sejam coletadas.
  6. Ponto de pausa: armazene amostras a -80 °C até que estejam prontas para fazer extrações.
  7. Pesar tubos para determinar o peso da amostra de tecido. Grave em uma planilha.
    1. Mantenha as amostras congeladas durante o processo de pesagem: mantenha os tubos em gelo seco, pese rapidamente, coloque de volta no gelo seco imediatamente. Não permita que as amostras descongelem durante a pesagem.

2. Extração metabólito

NOTA: Apenas líquidos e reagentes de grau LC-MS devem ser usados durante todo o processo. Este método foi adaptado a partir de Reference20.

  1. Prepare todos os solventes de extração (LC-MS grau H2O, metanol grau LC-MS, cravado com 4 μM de sulfacloclopirpitria, LC-MS grau diclorometano: pico de metanol com 2 μM de sulfaclocloriridazina) em garrafas de vidro 1 L, usando vidro dedicado.
    NOTA: O volume a ser preparado deve ser calculado com base nos pesos amostrais, considerando 500 μL de água por 50 mg de amostra, 500 μL de metanol cravado com 4 μM de sulfacloclopirpyridazina por 50 mg de amostra e 1.000 μL de dcloroometano pré-moído: pico de metanol com 2 μM de sulfacloclopirpyridazina por 50 mg de amostra, aumentando o volume calculado em 10% para permitir a inaccumracy de tubulação. Armazene solvente de extração a 4 °C pelo menos durante a noite para pré-esfriar.
  2. Realizar a homogeneização à base de água das amostras de tecido conforme as etapas mencionadas abaixo.
    1. Adicione uma conta de aço inoxidável de 5 mm (ver Tabela de Materiais) a cada um dos tubos de microcentrifuuge de 2 mL contendo amostras de tecido, usando um distribuidor de contas. Mantenha os tubos no gelo.
    2. Faça um tubo em branco contendo H2O de grau LC-MS que passará por todas as etapas e sirva como um branco de extração. Use o volume médio de H2O das extrações amostrais. Adicione H2O de grau LC-MS refrigerado às amostras de tecido congelado.
      1. Normalize o volume de água ao peso do tecido adicionando 500 μL de água / 50 mg de amostra, utilizando os pesos amostrais calculados na etapa 1.7.
        ATENÇÃO: Se manusear amostras de risco biológico, continue seguindo o protocolo de biossegurança aprovado institucionalmente. Isso geralmente envolverá requisitos para equipamentos de proteção individual (EPI) e tubos de abertura apenas dentro do armário de biossegurança (classe II, tipo A2).
    3. Homogeneize amostras a velocidade de 25 Hz por 3 min utilizando um homogeneizador de tecido (ver Tabela de Materiais).
      1. Feche os tubos firmemente para evitar derramar os reagentes durante o processamento.
    4. Coletar cerca de 1/10 do volume de homogeneização para extração de DNA, qPCR, análises baseadas em proteínas ou outras análises (se desejar). Armazene em um tubo de microcentrifusagem ou placa de 96 poços (dependendo do volume coletado) por até 6 meses a -80 °C, se os experimentos de extração de DNA forem realizados em um dia diferente. Durações de armazenamento mais longas podem ser possíveis, mas não foram testadas.
      1. Realize extrações de DNA usando qualquer kit comercial padrão para extração de DNA de mamíferos (ver Tabela de Materiais) de tecidos descritos em Reference13. Quantifique o rendimento do DNA e armazene o DNA extraído a -20 °C. A quantidade e qualidade de DNA aceitáveis para qPCR tem sido observada até 3 anos depois.
        NOTA: Esta etapa pode ser realizada em homogenate congelado em um dia subsequente da extração metabólito.
      2. Realizar qPCR como descrito em Reference13, utilizando 180 ng de DNA extraído.
        NOTA: Isso pode ser realizado no DNA coletado em um dia anterior e congelado a -20 °C.
        1. No caso dos estudos sobre a infecção por T. cruzi, utilize os seguintes primers: ASTCGGCTGATCGTTTTCGA e AATTCCTCCAAGAGAGGGATA para quantificar os níveis de parasitas21 e os seguintes primers para normalizar para hospedar níveis de DNA: TCCCTCTCATCAGTTCTATGGCCCA e CAGCAAGCATCTATATGCACTTACCGA22 (ver Tabela de Materiais).
          NOTA: Os ciclos qPCR recomendados são os seguintes: desnaturação a 95 °C por 10 min; realizar 40 ciclos a 95 °C para 30 s, e depois 58 °C para 60 s, e finalmente 72 °C para 60 s. Realize a análise da curva de fusão conforme apropriado para o termociclador disponível. Processar dados usando o método ΔΔCt23 para obter carga relativa de parasitas entre os locais de amostragem. A quantificação absoluta pode ser obtida comparando os valores ΔΔCt derivados da amostra com uma curva padrão gerada a partir de quantidades conhecidas de parasitas, cravadas em amostras de tecido não infectadas e extraídas nas etapas 2.2 a 2.2.4.1.
      3. Realize a caracterização baseada em proteínas de respostas imunes usando kits de citocina multiplexado ou kits elisa comerciais padrão (ver Tabela de Materiais), conforme descrito na Referência13 no homogenate armazenado.
    5. Economize pelo menos metade dos 500 μL do volume de homogeneização para extração metabólito.
  3. Realize extração metabólito aquosa.
    NOTA: A seleção de solventes pode ser adaptada com base nas propriedades químicas dos metabólitos de interesse.
    1. Adicione o metanol de grau LC-MS gelado com 4 μM de sulfacloclopirpiridazina ao homogeneizar para alcançar uma concentração final de 50% de metanol com 2 μM de sulfaclocloriridazina na água.
      ATENÇÃO: O metanol é inflamável e perigoso. Use procedimentos de segurança adequados, incluindo manuseio dentro de um capô de fumaça ou armário de biossegurança.
    2. Homogeneize amostras em um homogeneizador de tecido a velocidade de 25 Hz por 3 min. Centrífuga amostras a 16.000 x g a 4 °C por 10 min.
    3. Colete um volume igual de supernante em uma placa de 96 poços. Selecione o volume para corresponder ao menor volume de metanol + água combinado em todas as amostras. Esta é a fração aquosa.
      1. Reserve qualquer supernanato homogêneo aquoso restante a -80 °C como backup.
    4. Mantenha o resíduo sólido no gelo enquanto coleta os supernaciantes.
    5. Seque a extração aquosa supernante até secar (~3 h ou durante a noite). Use velocidade máxima e sem aquecimento.
    6. Congele a placa seca de 96 poços a -80 °C.
  4. Realize extração de metabólito orgânico.
    NOTA: A seleção de solventes pode ser adaptada com base nas propriedades químicas dos metabólitos de interesse.
    1. Adicione 1.000 μL por 50 mg da amostra de dichlorometano pré-alímbo: metanol cravado com 2 μM de sulfacloclopirpirida ao resíduo sólido da etapa 2.3.4.
      ATENÇÃO: Use os procedimentos de segurança adequados ao manusear solventes, incluindo manuseio dentro de um capô de fumaça com uma boa vazão.
    2. Homogeneize amostras em um homogeneizador de tecido a velocidade de 25 Hz por 5 min. Centrifugar as amostras a 16.000 x g a 4 °C por 10 min.
    3. Colete um volume igual de supernante em uma placa de 96 poços. Selecione o volume para combinar com o menor volume de diclorometano: metanol, em todas as amostras. Esta é a fração orgânica.
    4. Armazene a pelota a -80 °C como backup. Armazene o extrato orgânico restante a -80 °C como backup. Seque o extrato orgânico em um capô de fumaça durante a noite.
    5. Congele a placa seca de 96 poços a -80 °C.

3. Aquisição de dados da LC-MS

  1. Resuspend extratos aquosos e orgânicos em 60 μL cada um de 50% de metanol + 2 μM de sulfadimetoxina, e combinar. Sonicato por 10 min; em seguida, centrífuga por 10 min e transfira o supernatante para uma placa limpa de 96 poços. Veda com vedação de placa livre de zona e coloque a placa em um autosampler LC.
    ATENÇÃO: Use os procedimentos de segurança adequados ao manusear solventes, incluindo manuseio dentro de um capô de fumaça com uma boa vazão.
  2. Conecte as fases móveis apropriadas ao sistema LC (ver Tabela de Materiais).
    NOTA: Para o modo positivo LC de fase invertida, os autores recomendam h2O LC-MS-grade + 0,1% ácido fórmico como fase móvel A e acetonitrilo de grau LC-MS + ácido fórmico de 0,1% como fase B móvel com uma taxa de fluxo de 0,5 mL/min e um gradiente de LC de 7,5 min. As etapas de gradiente recomendadas são publicadas em Reference6: 0-1 min, 2% B; 1-2,5 min, aumento linear para 98% B; 2,5-4,5 min, mantenha-se em 98% B; 4,5-5,5 min, redução linear para 2% B; 5,5-7,5 min, mantenha-se em 2% B.
  3. Certifique-se de que o instrumento está limpo. Calibrar a EM no modo positivo e negativo.
  4. Realize a avaliação de desempenho de MS conforme apropriado para o instrumento.
  5. Criar sequência de execução ms.
    1. Comece com 2 espaços em branco, 2 padrões (6-mixes) e 5 controles de qualidade agrupados (QC) em uma série de diluição, começando em 2 μL de volume de injeção e aumentando stepwise para 30 μL volume de injeção.
    2. Randomize a ordem da amostra.
    3. Depois de cada 12 amostras, execute um branco, e depois um QC agrupado.
  6. Conecte a coluna C8 LC (tamanho de partícula de 1,7 μm, tamanho de poros 100 Å, 50 x 2,1 mm de comprimento x diâmetro interno) e monitor para vazamentos e pressão excessiva. Corrigir problemas de acordo com o procedimento operacional padrão do instrumento.
  7. Inicie a sequência de execução do MS e colete dados LC-MS/MS dependentes de dados.
    NOTA: Para um instrumento Q-Exactive Plus MS, use Ionização de Eletrospray Aquecida e aquisição ms2 dependente de dados (top 5) no modo positivo, uma resolução de 70.000 para MS1 e 17.500 para MS2, AGC Target de 1E6 para MS1 e 2E5 para MS2, TI máxima de 100 ms para MS1 e MS2, intervalo de varredura de 100-1500 m/z para MS1, e janela de isolamento MS2 de 1 m/z. Coloque o gás de baia para 35, aux gás a 10 e vara o gás para 0, pulverize a tensão de 3,8 kV, temperatura capilar a 320 °C, nível RF de lente S até 50 e temperatura do gás aux a 350 °C.
    1. Verifique a qualidade dos dados: verifique os espaços em branco iniciais (confirme a falta de picos principais), padrões (confirme a presença de picos esperados e forma de pico simétrico) e QCs (confirme a presença de picos esperados, forma de pico e intensidade de pico esperada).
    2. Monitore periodicamente a execução de MS durante a sequência de execução.
  8. Uma vez terminado a execução, verifique os dados se há injeções perdidas ou outros erros.
  9. Armazene a coluna LC conforme recomendado pelo fabricante. Remova e armazene amostras a -80 °C.
  10. Carregue dados brutos no repositório de dados.
    NOTA: O MassIVE (massive.ucsd.edu) é recomendado para habilitar o link a jusante à rede molecular para anotações metabólitos24,25.

4. Processamento de dados LC-MS

  1. Converta arquivos brutos em formato aberto (.mzXML ou .mzML) usando MSConvert26.
    1. Envie dados brutos e dados mzXML ou mzML para o repositório de dados.
  2. Gerar tabela de recursos. Existem várias ferramentas para fazê-lo (MZmine, MS-DIAL, openMS, XCMS, etc.27,28,29,30).
    NOTA: O MZmine é recomendado porque é gratuito, de código aberto, e pode importar diretamente arquivos mzXML após o MSconvert, tem opções gráficas de interface de usuário para processar dados e monitorar o impacto da seleção de parâmetros e pode exportar diretamente para GNPS para rede molecular24.
    NOTA: Siga a documentação da ferramenta e use os parâmetros apropriados para o instrumento disponível. Detalhes adicionais também podem ser encontrados no Reference31.
    1. Tabela de recurso de exportação em formato .csv.

Geração de modelos 5.3D

  1. Desenhe manualmente o modelo 3D de novo para dimensionar conforme as etapas mencionadas abaixo.
    1. Tire uma foto do órgão de interesse.
    2. Execute o seguinte no software SketchUp (ver Tabela de Materiais) como mencionado abaixo.
      1. Exclua a imagem padrão de um homem que aparece quando o software é aberto.
      2. Clique no Arquivo > Importar para importar uma imagem dos órgãos de interesse.
      3. Clique na ferramenta Linhas e selecione a opção Mão Livre . Use a ferramenta lápis para traçar e desenhar os contornos dos órgãos de interesse. Certifique-se de fechar a linha desenhando todo o caminho de volta para o ponto de partida. Uma vez que a linha tenha sido fechada com sucesso, a área desenhada aparecerá automaticamente sombreada.
      4. Selecione a ferramenta Empurrar/Puxar e puxe para cima na área sombreada para converter o desenho de 2D para 3D.
      5. Exclua a imagem do órgão: selecione o botão Borracha e clique com o botão direito do mouse na imagem e selecione Apagar.
      6. Exporte o arquivo em formato .dae: Arquivo > exportar > modelo 3D.
    3. Melhore o realismo do modelo conforme os passos mencionados abaixo.
      1. Importe o modelo para o software MeshLab (ver Tabela de Materiais): abra o MeshLab e selecione File > Import Mesh. Selecione o modelo .dae gerado na etapa anterior. Um menu de Opções Pré-Abertas aparecerá. Selecione OK.
      2. Selecione Wireframe no menu superior. Em seguida, selecione: Filtros > superfícies de remeshing, simplificação e reconstrução > subdivisão: Ponto médio. Deixe todos os valores como padrão e selecione Aplicar duas vezes. Inspecione visualmente a visão do wireframe do modelo para garantir que ele esteja finamente gridded. Feche o menu pop-up.
      3. Exporte o modelo em formato .stl: Arquivo > tela de exportação As e, em seguida, selecione O formato de arquivo STL (*.stl) no menu de retirada de arquivos do tipo . Clique em Salvar. Selecione OK no próximo menu pop-up.
      4. Abra o software Meshmixer (ver Tabela de Materiais). Clique no botão Importar (+). Selecione o arquivo .stl gerado na etapa anterior. Use os Pincéis de > Esculpir > arrastar e esculpir > escovas > ferramentas inflar para retirar as superfícies do modelo que precisam ser arredondadas.
      5. Uma vez que o modelo tenha a aparência desejada, salve-o em formato .stl: Arquivo > Exportação. Nomeie o arquivo conforme desejado e selecione STL Binary Format (*.stl) no menu Salvar como tipo de dropdown. Clique em Salvar. Se um menu pop-up aparecer, clique em Continuar.

6. 'ili geração de enredo

  1. Obtenha coordenadas para as posições no modelo 3D que correspondam aos locais de amostragem.
    1. Abra o modelo 3D a partir da etapa 5.1.3.5 no software MeshLab : Arquivo > Malha de Importação. Selecione o modelo gerado na etapa 5.1.3.5. Clique em OK na janela pop-up de processamento pós-aberto .
    2. Para obter coordenadas x, y e z para cada ponto de amostragem: selecione a ferramenta PickPoints e, em seguida, clique com o botão direito do mouse em intervalos regularmente espaçados em toda a superfície do modelo 3D. Uma vez selecionadas todas as coordenadas desejadas, clique no botão 'Salvar ', na janela pop-up Form .
      NOTA: Isso exportará as coordenadas em formato de arquivo .pp. Este arquivo pode ser aberto em software de planilha.
    3. Em software de planilha: Abra o arquivo .pp gerado na etapa 6.1.2. Ajuste o display de dados usando Texto > de dados para colunas > Delimitado. Clique em Próximo e selecione Espaço e clique em Concluir.
    4. Reformat de modo que apenas valores numéricos permaneçam nas células de planilha selecionando Home > Find & Select > Replace. Na caixa Encontrar qual caixa, digite: y=". Deixe o Substituir com a caixa vazia. Clique em Substituir tudo e, em seguida, em OK. Repita para x=" e para z=" e para " />. Os valores estão agora prontos para a etapa 6.2.
  2. Faça a tabela de recursos 'ili. Este método foi adaptado do Reference16.
    1. Em um software de planilha, construa a tabela de recursos. As linhas correspondem a cada posição e colunas aos dados.
      NOTA: As primeiras colunas devem ser o nome da posição (nome da amostra), seguido pelas coordenadas x, y e z das manchas amostrais obtidas na etapa 6.1.2 (com cabeçalhos de coluna x, y, z). A quinta coluna deve ser intitulada "raio".
    2. Cole a abundância de metadados e metabólitos apropriados nas colunas de planilha subsequentes.
    3. Na coluna "raio", digite o tamanho desejado das manchas de amostragem a serem visualizadas no modelo. Determine os valores para o raio empiricamente: digite 1 como padrão e, em seguida, avalie se o raio ou as coordenadas precisam ser ajustados na etapa 6.3. Salve o arquivo no formato .csv (Arquivo > Salvar As) e, em seguida, selecione CSV (Vírgula delimitada) (*.csv) no menu suspenso. Nomeie o arquivo como desejado. Clique em Salvar.
  3. Abra os dados em 'ili (software desenvolvido por 16).
    1. Abra o site 'ili (ili.embl.de). Selecione Superfície. Arraste e solte o modelo 3D criado na janela do navegador. Arraste e solte a tabela de recursos criada na mesma janela do navegador.
    2. Use a legenda no canto inferior direito para projetar a coluna de dados desejada no modelo 3D. Certifique-se de que as manchas e raios selecionados na etapa 6.2.1 correspondam aos locais de amostragem. Se necessário, ajuste os valores na tabela de recursos ou escolha coordenadas adicionais no MeshLab (ver etapa 6.1.2).
      NOTA: A visualização também pode ser melhorada selecionando as manchas > opacidade de borda e definindo o controle deslizante ao seu valor máximo.
    3. Selecione consecutivamente cada coluna de dados para avaliar a distribuição deste recurso metabólito no modelo 3D.
      NOTA: Esta abordagem também pode ser usada para visualizar apenas características específicas de metabólito de interesse, por exemplo, aquelas com p < 0,05 ou uma certa variação de dobra entre amostras infectadas e não infectadas, conforme determinado em ferramentas de análise estatística externa. Recursos para visualizar também podem ser selecionados fora do ili através de abordagens de aprendizado de máquina, como uma floresta aleatória.
  4. Realize a visualização de dados lineares/log de acordo com as etapas mencionadas abaixo.
    1. Usando a guia Mapeamento no canto superior direito da página, selecione Linear ou Logaritítmico no menu suspenso escala .
    2. Defina a mesma escala para todas as parcelas se visualizar vários recursos.
      NOTA: O site escolhe automaticamente o mínimo e o máximo para cada coluna de dados a ser exibida.
    3. Para definir a escala manualmente, desmarque a opção Auto Min/Max e digite a escala desejada. Todos os dados serão exibidos agora na mesma escala.
  5. Alterar a escala de cores dos dados (escala de cinza, azul-branco-vermelho, etc.).
    1. Altere a escala de cores para o esquema de cores desejado no menu Mapping usando o menu suspenso do Mapa de cores . Certifique-se de que o esquema de cores selecionado seja amigável às cores.
  6. Para alterar a cor do modelo 3D ou a cor de fundo, use opções de Cor e Fundo no menu 3D.
  7. Esconda os eixos 3D sem selecionar a caixa Mostrar a Origem sob o menu 3D.
  8. Salve a imagem através de screenshoting, usando a ferramenta de snipping, ou a tecla de atalho Crtl + S para Windows ou Linux e figure-protocol-1+ S no OS X.

Resultados

O número de características metabólicas obtidas depende do tipo de tecido analisado e dos parâmetros de processamento de dados. Por exemplo, este protocolo tem sido usado para analisar o impacto espacial da infecção por T. cruzi no metabolome do trato gastrointestinal em um modelo de camundongos da infecção por T. cruzi. Em trabalhos anteriores, c3H/HeJ masculino foram injetados intraperitonealmente com 1.000 CL + luc T. cruzi parasitas32,6. Os animais foram eutanizados 12 ou 89 dias após a infecção, e foi realizada uma análise de cartografia química de 13 segmentos contíguos do trato gastrointestinal, conforme descrito neste protocolo. Esta análise levou a uma tabela de recursos de 5.502 recursos, que foram então visualizados em 3D usando as etapas descritas neste protocolo. Esta abordagem permite a visualização de características metabólicas em animais individuais que são elevados no local de alta carga de parasitas (kynurenine, Figura 2B vs. carga de parasita, Figura 2A), de metabólitos com distribuição diferencial entre regiões teciduais (glutamina, Figura 2C) e características metabólicas que são encontradas em níveis comparáveis em intestinos pequenos e grandes (LPE 16:0 Figura 2D ). A kynurenine foi selecionada para visualização devido à sua relação conhecida com inflamação e publicações anteriores sobre a capacidade de metabólitos derivados de kynurenine para regular a carga T. cruzi33. Modelos aleatórios de aprendizado de máquina baseados em florestas já haviam revelado anteriormente uma associação entre os níveis de kynurenina e o status de infecção6. A glutamina foi selecionada para uma visualização com base em publicações anteriores demonstrando uma relação entre a disponibilidade in vitro de glutamina e a sensibilidade da droga T. cruzi34. A distribuição diferencial foi confirmada por meio de regressão logística, p < 0,05. O LPE 16:0 foi selecionado após inspeção visual dos dados para descobrir características metabólicas encontradas em níveis comparáveis em locais de tecido.

figure-results-1
Figura 1: Visão geral do protocolo. A ilustração foi criada com BioRender.com. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

figure-results-2
Figura 2: Análise de cartografia química. Os camundongos C3H/HeJ machos foram injetados intraperitonealmente com 1.000 parasitas CL+luc T. cruzi32. Os animais foram eutanizados 12 ou 89 dias após a infecção, e o trato gastrointestinal foi coletado e seccionado sistematicamente (etapa 1)6. Os metabólitos foram extraídos como na etapa 2 e analisados pela LC-MS/MS.3D geração de modelos foi realizada utilizando o software SketchUp (etapa 5), e os dados foram plotados em 3D como na etapa 6. (A) Distribuição de parasitas em um camundongo específico, 12 dias após a infecção. (B) Distribuição de metabólito de kynurenina no mesmo rato, 12 dias após a infecção. (C) Distribuição média de glutamina entre camundongos infectados, 89 dias após a infecção. (D) Níveis comparáveis de m/z 454.292 tempo de retenção 2.929 min, anotado como 2-hexadecanoyl-sn-glicerio-3-fosfoetanolamina (LPE 16:0), no mesmo rato como em A e B no intestino delgado e cólon. Amostras e dados foram gerados em6. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Discussão

Entender infecções por tripanosomatidas é essencial para orientar novas abordagens de desenvolvimento e tratamento de medicamentos. Este método de cartografia química está exclusivamente preparado para fornecer insights acionáveis sobre a relação entre o metabolismo e a patogênese da doença trypanosomatida, abordando assim essa necessidade translacional.

Apenas solventes de grau LC-MS são recomendados durante a extração metabólito e análises de MS, para diminuir a contaminação de fundo. A contaminação polimérica35, comumente derivada de filme de parafina e/ou outros plásticos36,37,38, deve ser evitada sempre que possível. O parafilme, em particular, nunca deve ser usado. Esses aspectos são cruciais, uma vez que a qualidade dos dados da LC-MS depende dos materiais utilizados durante a preparação da amostra e a extração metabólica. A qualidade dos dados deve ser garantida antes de gerar 'ili parcelas. Além disso, a geração desses mapas abrangentes de metabolômica espacial requer a coleta de todas as amostras de tecido adjacentes e extração metabólica de todas as amostras coletadas para evitar lacunas nesses mapas. Os procedimentos de coleta, a logística de extração metabólica e a análise da LC-MS, e os custos devem, portanto, ser considerados e planejados em conformidade.

Este protocolo pode ser modificado para atender às necessidades do usuário de várias maneiras. Por exemplo, a polaridade e solubilidade dos solventes usados durante a extração metabólito influenciará o que os metabólitos são detectados39. Para maximizar a diversidade de características metabólicas detectadas para análises de cartografia química não-diretas, recomenda-se a combinação de múltiplas etapas de extração e solventes. Por exemplo, este método utiliza diclorometano, metanol e água como solventes de extração porque permitem a detecção precisa de moléculas não polares20,40. No entanto, esses solventes não são universalmente adequados para cada experimento de ESM, e os pesquisadores devem selecionar solventes de extração com base nos objetivos de seu projeto. Da mesma forma, podem ser utilizadas diferentes condições de LC-MS/MS, como a substituição da cromatografia de fase inversa por cromatografia de fase normal. Colunas alternativas também podem ser usadas para coleta de dados em fase inversa em vez de cromatografia C8, embora empiricamente, a cromatografia C8 é mais robusta aos lipídios teciduais e tem menor frequência de entupimento. Conceitualmente, esses protocolos também podem ser aplicados a outros métodos de espectrometria de massa, como espectrometria de massa cromatografia gasosa, etc.

Uma abordagem alternativa é a imagem de espectrometria em massa. De fato, ao contrário das abordagens de imagem de espectrometria de massa de massa, a espectrometria de massa cromatografia líquida não preserva inerentemente informações espaciais10. A cartografia química aborda a ponte, incluindo a localização amostral no momento da conceituação do projeto, nos metadados amostrais e nas etapas de processamento de dados. Uma força dessa abordagem de cartografia química, ao contrário da imagem de espectrometria de massa, é a capacidade de fornecer anotações confiantes (Metabolomics Standards Initiative nível 1 ou nível 2 de anotação de confiança41), ao contrário da imagem de espectrometria de massa onde a maior parte das aplicações depende de massa precisa apenas para anotação. A imagem da espectrometria de massa permitirá o mapeamento espacial de grãos finos, às vezes até o nível de célula única, por exemplo, 42,43. Em contraste, as abordagens de cartografia química permitem o mapeamento em larga escala de distribuição de metabólitos sem exigir habilidades altamente especializadas de crioseção animal inteiro. A cartografia química fornece evidências complementares às muitas abordagens transcriômicas espaciais que estão sendo desenvolvidas, por exemplo, 44, com a vantagem de se concentrar na camada 'omics mais próxima do fenótipo'45. Métodos alternativos para quantificação da carga de parasitas incluem medir a bioluminescência no momento da coleta da amostra6. Segmentos finos também podem ser coletados para permitir microscopia confocal ou eletrônica para avaliar a carga de parasitas localizadas e danos teciduais. A homogeneização da água, que é usada para quantificação de citocinas neste protocolo e publicações anteriores13, também poderia ser usada para quantificar marcadores à base de proteínas de danos teciduais.

Há também várias maneiras de obter modelos 3D adequados para traçar os dados LC-MS resultantes. Além do método sugerido aqui, os modelos podem ser adquiridos pré-fabricados de vários fornecedores online. Certifique-se de que os termos de uso correspondem ao uso pretendido, especialmente no que diz respeito à publicação. Modelos para órgãos grandes podem ser gerados de novo usando scanners 3D de acordo com as instruções do scanner. Alternativas como o MATLAB existem para gerar e visualizar modelos 3D para cartografia química46, mas foram implementadas principalmente antes do desenvolvimento do ili16. O MATLAB é um conjunto de ferramentas de análise e programação de dados que oferece uma grande variedade de aplicações em muitos campos. No entanto, o MATLAB não é gratuito nem de código aberto, e requer familiaridade com as interfaces MATLAB, especialmente considerando que o MATLAB não foi desenvolvido para o processamento de dados de espectrometria em massa. As alternativas deste método proposto, ou seja, SketchUp, Meshlab e 'ili, são livremente acessíveis, fáceis de usar e oferecem funções semelhantes como MATLAB para fins de cartografia química.

Este método é robusto no que diz respeito à preparação da amostra e à extração metabólica. A solução de problemas é mais frequentemente necessária na etapa de aquisição de dados LC-MS. Isso está além do escopo deste artigo. Os leitores são direcionados para excelentes publicações sobre a solução de problemas de aquisição de dados LC-MS, incluindo 20,47. Da mesma forma, as complexidades da anotação metabólito estão além do escopo do foco deste método na geração de modelos 3D. Referências úteis sobre este tema incluem24,25,48,49.

Embora este método explore efetivamente a patogênese da doença, há limitações para essa abordagem, algumas das quais são comuns em qualquer experimento metabolômico. Uma dessas limitações é a baixa taxa de anotação dos recursos do LC-MS50, que depende da disponibilidade e qualidade das bibliotecas espectrais de referência. Outra limitação é que este protocolo não preserva o mRNA devido à incompatibilidade de reagentes de preservação de RNA, como o RNAlater com a análise LC-MS/MS. No entanto, a qualidade da proteína é adequada para análises a jusante e, portanto, pode substituir análises baseadas em mRNA.

Uma abordagem de cartografia química para a patogênese da infecção reflete diretamente como infecções bacterianas, virais ou parasitárias se desenvolvem em sistemas de órgãos e causam doenças localizadas. Analisar essas subsampleções regionais e gerar modelos 3D finalmente transmite como os metabólitos funcionam através do espaço tridimensional, lançando luz sobre essas dimensões espaciais não reconhecidas anteriormente da biologia molecular. Usando este protocolo, por exemplo, a localização metabólica foi comparada com a carga de parasitas Trypanosoma cruzi. Os resultados esclareceram a relação entre o patógeno e o tecido hospedeiro e também demonstraram a dinâmica metabólica da progressão dos sintomas da doença de Chagas6. Métodos de cartografia química também têm sido aplicados a diversos temas, como a interação ambiente construída pelo homem51,52,53, a composição química de sistemas de órgãos como pele humana46 e pulmões54, e interações de metabolismo e ambiente vegetal55. Aplicações futuras podem envolver a avaliação da tolerância e resiliência localizadas da doença, ou a relação entre os níveis de metabólito local, tropismo patógeno e tropismo de doenças em modelos além da infecção por tripanosomatidas. Esta abordagem também deve ter ampla aplicabilidade para expandir os protocolos atuais de farmacocinética, para avaliar a relação entre os níveis de drogas de tecido local e o metabolismo de drogas versus contexto metabólico geral, danos teciduais e liberação de patógenos. No geral, a cartografia química permite explorações únicas de distribuições metabólitos em vários tipos de amostras, com aplicações incluindo patogênese de doenças, saúde humana, interações ambiente humano e dinâmica microbiana.

Divulgações

Não há conflitos de interesse para relatar.

Agradecimentos

Laura-Isobel McCall, PhD, é investigadora do Prêmio Patogênese de Doenças Infecciosas do Burroughs Wellcome Fund. Os autores ainda desejam reconhecer o apoio do número de prêmio NIH R21AI148886, uma bolsa piloto do Oklahoma Center for Respiratory and Infectious Diseases (OCRID) sob o número do prêmio NIH P20GM103648, e fundos de start-up da Universidade de Oklahoma (para LIM). O conteúdo é de responsabilidade exclusiva dos autores e não representa necessariamente as opiniões oficiais dos financiadores. Os autores também desejam agradecer aos desenvolvedores das ferramentas utilizadas neste protocolo. Todas as publicações relevantes foram citadas, quando aplicável.

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo
NomeEmpresaNúmero de catálogoComentários
Tubos Eppendorf de 1,5 mLNANAqualquer marca, conforme disponível
Frasco de 1 L, pirexNANAqualquer marca, conforme disponível
Cilindro graduado de 1 L, pirexNANAqualquer marca, conforme disponível
Tubos Eppendorf SafeLock de 2 mLVWR20901-540Use o modelo de tubo apropriado para o homogeneizador
de tecido disponívelModelo 3D (de-novo gerado de acordo com as etapas do protocolo, ou adquirido)NANAconforme apropriado para o sistema sob investigação
Conta de aço inoxidável de 5 mmQiagen69989
Placa de 96 poçosFisher3252449
AATTCCTCCAAGCAGCGGATA primerNANAqualquer marca, conforme disponível; publicado em Piron, M. et al. Desenvolvimento de um ensaio de PCR em tempo real para detecção de Trypanosoma cruzi em amostras de sangue. Acta tropica. 103 (3), 195– 200 (2007).
balança analíticaNA NAqualquer marca, conforme disponível
ASTCGGCTGATCGTTTTCGA primerNA NAqualquer marca, conforme disponível; publicado em Piron, M. et al. Desenvolvimento de um ensaio de PCR em tempo real para detecção de Trypanosoma cruzi em amostras de sangue. Acta tropica. 103 (3), 195– 200 (2007).
centrífuga de bancada com microcentrífuga, tubo falcon e capacidade de placa de 96 poçosNANAqualquer marca, conforme disponível
cabine de biossegurançaNANAclasse II, tipo A2; qualquer marca, conforme disponível
CAGCAAGCATCTATGCACTTAG
ACCCC primer		NANAqualquer marca, conforme disponível; publicado em Cummings, K.L., Tarleton, R.L. Quantificação rápida de Trypanosoma cruzi em tecido hospedeiro por PCR em tempo real. Parasitologia molecular e bioquímica. 129 (1), 53– 59 (2003).
câmeraNANAqualquer marca, conforme disponível. Uma câmera de celular é adequada para este protocolo
sistema de imagem com capacidade quimioluminescenteNANAqualquer sistema, como disponíveis
bolas de algodãoNANAqualquer marca, como disponíveis
criogloveVWR97008-208substituir por qualquer marca, como disponível
tesoura de dissecçãoNA NAqualquer marca, conforme disponível
gelo secoNANAqualquer marca, conforme disponível
pinça extra-comprimentoNANAqualquer marca, conforme disponível
refrigerador de grau inflamávelNANAqualquer marca, conforme disponível
caixas de armazenamento de freezer para tubos de microcentrífugaNANAqualquer marca, conforme disponível
capela de exaustãoNANAqualquer marca, conforme disponível
massa de alta resolução espectrômetroNANAqualquer marca, conforme disponível, como ThermoFisher Q-Exactive Plus (número de catálogo 0726030)
balde de geloNANAqualquer marca, conforme disponível
ili softwareili.embl.deNA
isofluranoCovetrus29405
grande tupperwareNA NAqualquer marca, conforme disponível; grande o suficiente para conter confortavelmente mouse, bola
de algodão LC-MS grau acetonitrilaFisher OptimaA955-4
LC-MS grau dicholorometanoFisher OptimaD151-4
LC-MS grau ácido fórmicoFisher OptimaA11750
LC-MS grau metanolFisher OptimaA456-4
LC-MS grau águaFisher OptimaW64
coluna de cromatografia líquidaPhenomenex00B-4499-ANpode ser alterada para outras marcas e modelos, conforme apropriado para os metabólitos de interesse cartucho de
proteção de coluna de cromatografia líquidaPhenomenexAJ0-8784pode ser alterado para outras marcas e modelos, conforme apropriado para os metabólitos de interesse suporte de cartucho de
proteção de coluna de cromatografia líquidaPhenomenexAJ0-9000pode ser alterado para outras marcas e modelos, conforme apropriado para os metabólitos de interesse
nitrogênio líquidoNANAqualquer marca, conforme disponível
luciferinaGoldbioLUCK-1G
Software MeshLabhttps://www.meshlab.net/NA
Software Meshmixerhttps://www.meshmixer.com/NA
MS calibranteNANAapropriado para o instrumento disponível
de processamento de dados MSNANAvárias opções disponíveis; os autores recomendam o software MZmine
MSConverthttp://proteowizard.sourceforge.net/NA
NanodropThermoFisherND-ONE-Woutros modelos nanodrop também são adequados
p1000 pontas de pipetaNANAuse a marca apropriada para caber nos pipetadores disponíveis
p1000 pipetadorNANA qualquermarca, conforme disponível
p20 ponteiras de pipetaNANAuse a marca apropriada para caber nos pipetadores
p20NANAqualquer marca, conforme disponível
p200 ponteiras de pipetaNANAuse a marca apropriada para caber nos pipetadores
p200 disponíveis pipetadorNANAqualquer marca, conforme disponível
equipamento de proteção individual (luvas, jaleco, óculos/óculos de proteção; protetor facial)NANAqualquer marca, conforme disponível
Q-Plex Mouse Cytokine - Screen (16-Plex)Quansys biosciences110949MSpode substituir por outros ensaios de citocinas à base de proteínas, como outros kits comerciais de citocinas Kit ELISA
Quick-DNA Miniprep Plus (200 preparações)ZymoD4069substituir por qualquer marca de kit de extração de DNA de mamíferos, como disponível
termociclador em tempo realNANA qualquermarca, como disponível
saleiro ou infusor de cháNA NAqualquer marca; para conter bola de algodão embebido em isoflurano e evitar o contato com a pele do rato
Software SketchUphttps://www.sketchup.com/
espécime fórcepsNANAqualquer marca, conforme disponível
speedvac com tubo de microcentrífuga e capacidade de placa de 96 poçosNANAqualquer marca, conforme o software de
planilhahttps://www.microsoft.com/en-us/microsoft-365/excelNApode substituir por outro software de gerenciamento de planilhas, conforme aplicável
sulfacloropiridazinaSigmaS9882-100G
sulfadimetoxinaSigmaS7007-10G
Sybr green qPCR reaction mixFisherA25780pode substituir por outras misturas de reação Sybr green qPCR, conforme desejado
TCCCTCTCATCAGTTCTAT
GGCCCA primer		NA NAqualquer marca, conforme disponível; publicado em Cummings, K.L., Tarleton, R.L. Quantificação rápida de Trypanosoma cruzi no tecido hospedeiro por PCR em tempo real. Parasitologia molecular e bioquímica. 129 (1), 53– 59 (2003).
homogeneizador de tecidosNANAqualquer marca, conforme disponível; por exemplo, Qiagen TissueLyser II, número de catálogo 85300, com conjunto de adaptadores TissueLyser (2 x 24), número de catálogo 69982
amostras de tecidoNANAdo modelo de infecção apropriado
Dispensador de esferas únicas TissueLyserQiagen69965
UHPLCNANAqualquer marca, conforme disponível, como ThermoFisher Vanquish (número de catálogo IQLAAAGABHFAPUMBHV)
freezer de temperatura ultrabaixa (-80)NANAqualquer marca, conforme disponível
banho ultrassônicoNANAqualquer sistema, conforme disponível
gelo úmidoNANAqualquer marca, conforme disponível
filme de vedação sem zonaVWR  Rolamento 490007-390
Software disponíveis NA disponível

Referências

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