Protocolo Baseado em Microdissecção a Laser para a Análise LC-MS/MS do Perfil Proteômico de Grânulos de Neuromelanina

Summary

Um protocolo robusto é apresentado aqui para isolar grânulos de neuromelanina de tecido humano post-mortem substantia nigra pars compacta via microdissecção a laser. Este protocolo revisado e otimizado minimiza massivamente o tempo necessário para a coleta de amostras, reduz a quantidade de amostra necessária e melhora a identificação e quantificação de proteínas pela análise LC-MS/MS.

Abstract

A neuromelanina é um pigmento preto-acastanhado, presente nos chamados grânulos de neuromelanina (NMGs) em neurônios dopaminérgicos da substância negra pars compacta. Além da neuromelanina, os NMGs contêm uma variedade de proteínas, lipídios e metais. Embora os neurônios dopaminérgicos contendo NMGs sejam preferencialmente perdidos em doenças neurodegenerativas, como a doença de Parkinson e a demência com corpos de Lewy, pouco se sabe sobre o mecanismo de formação de NMG e o papel dos NMGs na saúde e na doença. Assim, mais pesquisas sobre a caracterização molecular de NMGs são essenciais. Infelizmente, os protocolos padrão para o isolamento de proteínas são baseados na ultracentrifugação do gradiente de densidade e, portanto, exigem grandes quantidades de tecido humano. Assim, um protocolo automatizado baseado em microdissecção a laser (LMD) é estabelecido aqui, que permite a coleta de NMGs e tecido de substância negra (SN) circundante usando quantidades mínimas de tecido de forma imparcial e automatizada. As amostras excisadas são posteriormente analisadas por espectrometria de massas para decifrar a sua composição proteómica. Com este fluxo de trabalho, foram identificadas 2.079 proteínas, das quais 514 proteínas foram identificadas exclusivamente em NMGs e 181 em SN. Os presentes resultados foram comparados com um estudo anterior utilizando uma abordagem semelhante baseada em LMD, alcançando uma sobreposição de 87,6% para ambos os proteomas, verificando a aplicabilidade do protocolo revisado e otimizado aqui apresentado. Para validar os achados atuais, as proteínas de interesse foram analisadas por espectrometria de massa direcionada, por exemplo, experimentos de monitoramento de reação paralela (PRM).

Introduction

Cada tecido consiste em uma mistura heterogênea de diferentes tipos de células, mas o isolamento específico de um tipo de célula muitas vezes é indispensável para uma caracterização mais precisa. A microdissecção a laser (LMD), acoplando um microscópio com uma aplicação a laser, é uma ferramenta poderosa para o isolamento específico de áreas de tecido, células individuais ou subestruturas celulares de um composto complexo. A aplicação de LMD em combinação com espectrometria de massas (LMD-MS) já foi implementada com sucesso para diversas questões de pesquisa, incluindo o isolamento de DNA¹, RNA² e proteínas

Protocol

O uso de tecido cerebral humano foi aprovado pelo comitê de ética da Ruhr-University Bochum, Alemanha (número de arquivo 4760-13), de acordo com os regulamentos e diretrizes alemãs. Este protocolo foi aplicado em fatias de tecido de substantia nigra pars compacta obtidas comercialmente. Uma visão geral gráfica do protocolo apresentado é mostrada na Figura 1.

1. Secção de tecidos

1. Pré-resfrie a câmara de criostato.
   NOTA: Cada tecido requer diferentes temperaturas de criostato, que podem ser encontradas no respectivo protocolo do fornecedor.
2. Limpe a faca de aço inox....

Results

O isolamento específico de NMGs e tecido SN é o passo mais importante para o sucesso da aplicação deste protocolo. Usando a função Análise de Campo de Visão no software fornecido pelo fornecedor do LMD, os NMGs podem ser selecionados automaticamente de maneira dependente da cor. Portanto, as áreas teciduais contendo NMGs (Figura 2A) devem ser identificadas e uma Análise de Campo de Visão com limiares de cor ajustados deve ser realizada, resultando na marcação dos NMGs (

Discussion

A LMD é uma técnica amplamente aplicável para o isolamento de áreas teciduais específicas, células únicas ou estruturas subcelulares. No protocolo revisado e automatizado aqui apresentado, esta técnica é aplicada para o isolamento específico de grânulos de neuromelanina (NMGs) e tecido circundante de NMG (SN). Até agora, duas abordagens diferentes para o isolamento de NMGs fora do tecido cerebral post-mortem humano foram publicadas e amplamente utilizadas:

a) Gradiente descontínuo de .......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
1,4-ditiotreitol	AppliChem	A1101
Acetonitrila	Merck	1.00029.2500
Bicarbonato de amônio	Sigma-Aldrich	A6141
Ácido fórmico	Sigma-Aldrich	56302
Iodoacetamida	AppliChem	A1666,0100
Micro Tube 500	Carl Zeiss	415190-9221-000
espectrômetro maciço Thermo	Fisher científico	IQLAAEGAAPFADBMBHQ
PALM MicroBeam	Zeiss	494800-0014-000
PEN Lâmina de membrana	Carl Zeiss	415190-9041-000
substantia nigra pars compacta fatias de tecido	Navarrabiomed Biobank (Pamplona, Espanha)
Ácido trifluoroacético	Merck	91707
Grau de sequenciamento de tripsina	Serva	37283.01
Ultimate 3000 RSLC nano LC system	Thermo Fisher Scientific	ULTIM3000RSLCNANO
Nome do Software	Weblink/Empresa	Versão
FreeStyle	Thermo Fisher Scientific	1.6
MaxQuant	https://www.maxquant.org/	1.6.17.0
PALMRobo	Zeiss	4.6 pro
Perseus	https://www.maxquant.org/perseus/	1.6.15.0
Skyline	https://skyline.ms/project/home/software/Skyline/begin.view	20.2.0.343
XCalibur	Thermo Fisher Scientific	4.3