Microscopia intravital longitudinal usando uma janela de imagem mamária com tampa substituível

Resumo

Este protocolo descreve uma nova janela de imagem mamária com uma tampa substituível (R.MIW). A microscopia intravital após a implantação do R.MIW permite imagens longitudinais e de vários dias da glândula mamária saudável e doente com resolução celular durante os diferentes estágios de desenvolvimento.

Resumo

A estrutura ramificada da glândula mamária é altamente dinâmica e passa por várias fases de crescimento e remodelação após o nascimento. A microscopia intravital em combinação com a cirurgia de retalhos da pele ou implantação de janelas de imagem tem sido usada para estudar a dinâmica da glândula mamária saudável em diferentes estágios de desenvolvimento. A maioria das tecnologias de imagem mamária são limitadas a um período de horas a dias, enquanto a maioria dos processos de remodelação da glândula mamária ocorrem em períodos de dias a semanas. Para estudar a remodelagem da glândula mamária, são necessários métodos que permitam o acesso óptico ao tecido de interesse por prazos prolongados. Aqui, uma versão melhorada da janela de imagem mamária de titânio com uma tampa substituível (R.MIW) é descrita que permite imagens de alta resolução da glândula mamária com resolução celular por até várias semanas. É importante ressaltar que o R.MIW fornece acesso a tecidos durante toda a duração do experimento de imagem intravital e, portanto, pode ser usado para manipulação de tecidos locais, rotulagem, administração de medicamentos ou microdissecção guiada por imagem. Em conjunto, o R.MIW permite a caracterização de alta resolução da dinâmica celular durante o desenvolvimento da glândula mamária, homeostase e doenças.

Introdução

O epitélio mamário é um órgão secreto único presente nos mamíferos, que produz e secreta o leite para nutrir a prole. Ao longo da vida, a glândula mamária passa por múltiplas rodadas de desenvolvimento e crescimento, que são acompanhadas de alterações estruturais e funcionais do tecido¹. Dependendo do estágio de desenvolvimento, os tipos de células que contribuem para a remodelação do tecido são diferentes, assim como a localização dentro da árvore ductal.

A microscopia intravital multifotrina (IVM) permite o estudo da dinâmica celular mamária in vivo no cenário nativo e minimamente perturbado ^2,3,4. Para obter acesso visual à glândula mamária, várias técnicas temporárias de imagem ex vivo ou retalho de pele foram publicadas durante diferentes estágios de desenvolvimento da glândula mamária, incluindo puberdade 4,5,6,7, idade adulta ^2,8, lactação 9,10,11,12, e dinâmica tumoral ^{13,14 15}. Embora essas técnicas resultem em imagens altas e temporalmente resolvidas da dinâmica das células mamárias, o período de tempo é limitado a horas, enquanto a maioria dos processos de remodelação da glândula mamária leva dias a semanas. Portanto, são necessários métodos que permitam o acesso óptico ao tecido de interesse por prazos prolongados. Ao longo dos anos, várias janelas permanentes de imagem foram desenvolvidas para imagens de tumores mamários 15,16,17,18, incluindo uma janela de imagem mamária de titânio (MIW)^2,3,19. Embora muito útil para estudar o crescimento do tumor mamário, a visualização da estrutura saudável da glândula mamária permaneceu limitada a alguns dias. Recentemente, foi desenvolvida uma janela flexível de imagem de silício, que permite a visualização da glândula mamária pubertal ao longo de várias semanas²⁰. No entanto, a glândula mamária está embutida em uma almofada de gordura rica em adipócitos, o que leva a uma extensa dispersão de luz e, como resultado, visibilidade limitada das estruturas ductais mamárias. Portanto, condições de imagem superiores são necessárias em todos os momentos para visualizar a dinâmica tecidual durante períodos prolongados de tempo na glândula mamária. Nem o MIW clássico, nem a janela flexível de silício permitem a manipulação tecidual ou a otimização da localização do tecido físico antes da imagem, já que a janela forma um sistema fechado após a cirurgia e implantação. Como resultado, o acesso óptico ideal ao tecido mamário subjacente provavelmente ficará impedido por períodos de tempo mais longos. Em contraste, a técnica de retalho da pele permite a otimização e o reposicionamento do tecido durante a sessão de imagem e uma aba de pele pode ser repetida várias vezes². No entanto, sessões repetidas de imagem através de um retalho de pele só são possíveis quando tempo suficiente (pelo menos 7 dias) é alocado entre cirurgias para permitir a recuperação da pele e, portanto, é mais adequado para estudar processos em escalas de tempo mais longas. Além disso, é aconselhável não realizar esse procedimento muitas vezes devido à sua natureza invasiva e grande risco de infecções e cicatrizes após o fechamento da ferida.

Para superar essas limitações, ou seja, para garantir condições de imagem ideais por um período prolongado de tempo em alta frequência e, ao mesmo tempo, permitir a manipulação tecidual, uma versão melhorada de titânio do MIW com uma tampa substituível (R.MIW) foi projetada para visualizar a glândula mamária saudável e doente ao longo de vários dias até a semana² (Figura 1A, B) O R.MIW foi projetado para fornecer acesso ideal ao tecido, permitindo manipulação direta de tecidos durante toda a duração do experimento IVM, e assim permite a visualização da glândula mamária no momento e local certos durante períodos prolongados de tempo. Quando fechado, o R.MIW forma um sistema hermético comparável ao MIW clássico (Figura 1C). Quando aberto sob condições assépticas, o R.MIW permite que a manipulação de tecidos locais melhore o acesso óptico e também permite a administração local de substâncias, como inibidores de vias ou agonistas, injeção de diferentes tipos de interesse celular, como células cancerosas ou populações de células imunes, ou adição de corantes de rotulagem tecidual. A tampa pode ser aberta a qualquer momento entre as sessões de imagem sem causar danos ao tecido subjacente.

Figura 1: Design da janela de imagem mamária com uma tampa substituível. (A) Vista superior e lateral da tampa substituível da janela de imagem mamária com um vidro de cobertura de 10 mm colado ao anel. (B) Vista superior e lateral da janela de imagem mamária, que consiste em um anel externo e anel interno com uma ranhura no meio para fixar a janela dentro da pele do mouse usando uma sutura de corda de bolsa. O anel externo tem uma pequena ranhura que se encaixa nas quatro projeções (braços) da tampa. (C) Desenho animado e imagens demonstrando os mecanismos de abertura e fechamento da tampa. As projeções inclinadas garantem que a tampa esteja fixa dentro da moldura da janela. Esta figura foi modificada a partir de Messal et al. ². Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Este protocolo descreve o procedimento de design e implantação do R.MIW, bem como uma estratégia longitudinal de IVM para revisitar os mesmos dutos mamários e sua visualização em uma resolução celular. O R.MIW permite seguir divisões celulares e alterações morfológicas durante diferentes fases de desenvolvimento da glândula mamária em diversos modelos de ratos repórteres fluorescentes. Em conjunto, o R.MIW facilita a caracterização de alta resolução da dinâmica celular durante o desenvolvimento da glândula mamária, homeostase e doenças.

Protocolo

Todos os procedimentos descritos neste artigo foram realizados de acordo com as diretrizes do IACUC e ku leuven e foram realizados no contexto do requerimento aprovado P160/2020. Antes de executar este protocolo, revise a estratégia de analgesia com o veterinário institucional e administre a analgesia pré e pós-operatória conforme as diretrizes institucionais.

1. Preparação do R.MIW (tempo estimado: 2 h)

NOTA: Para a construção do R.MIW, é aconselhável encontrar um fabricante local especializado em trabalhar com materiais duros como titânio, pois isso requer ferramentas especiais e expertise. Oficinas especializadas no design e fabricação de próteses de titânio geralmente possuem máquinas e expertise para produzir as peças R.MIW.

1. Coloque a tampa do R.MIW em uma superfície estéril com o exterior da tampa voltado para cima (e os braços da tampa inclinando para baixo; Figura 1A).
2. Aplique cola adesiva cianoacrilato ao redor de toda a borda da tampa e coloque cuidadosamente uma mancha de vidro redonda de 10 mm em cima da tampa.
   NOTA: Prepare sempre uma tampa sobressalente com um deslizamento de vidro como backup durante o procedimento cirúrgico.
3. Use uma vara de madeira estéril para posicionar a mancha de vidro e aplique alguma força para empurrá-lo para baixo para garantir um selo de ar apertado entre a mancha de vidro e a moldura da tampa. Certifique-se de que os orifícios nos braços da tampa não estão cobertos pelo vidro.
4. Desinfete as tampas e o R.MIW submergindo em 80% de etanol por pelo menos 30 min em uma placa de Petri fechada.
   NOTA: Não deixe as tampas com mais de 1h em 80% de etanol para evitar a dissolução da cola adesiva cianoacrilato.
5. Remova o excesso de cola adesiva cianoacrila do deslizamento de vidro usando uma ponta de algodão encharcada em acetona.
6. Armazene as tampas e o R.MIW em um ambiente estéril até que use mais.
   NOTA: A estrutura e as tampas R.MIW podem ser mantidas em um tubo ou saco estéril por um período máximo de 1 semana. Ao retomar o experimento, examine sempre se a tampa de vidro ainda está devidamente presa à tampa antes de prosseguir com o protocolo.

2. Preparação para cirurgia (tempo estimado: 15 min)

NOTA: Para o procedimento de implantação de R.MIW, podem ser utilizados camundongos fêmeas (> 3,5 semanas) de qualquer cepa.

1. Mantenha a esterilidade usando luvas estéreis e esterilize todos os itens que entrarão em contato com o mouse. Lave ferramentas cirúrgicas com água e sabão suave, ar seco, enrole em papel alumínio sem cantos ou bordas expostas e esterilize usando uma autoclave para um ciclo de 20 min a 120 °C antes da cirurgia.
2. Prepare uma plataforma cirúrgica estéril e esterilize as superfícies com 80% de etanol.
   NOTA: Para garantir a esterilidade, a cirurgia pode ser realizada em um armário de fluxo.
3. Ligue a almofada de aquecimento e cubra o tapete com uma cortina estéril. Despeça os instrumentos estéreis na cortina estéril e coloque o R.MIW e um mínimo de duas tampas cobertas de vidro em soro fisiológico estéril tamponado (PBS) em uma placa de Petri (feche a tampa para evitar contaminação externa).
4. Anestesiar o rato em uma câmara de indução usando uma mistura de isoflurane/O_{2 de} 3%. Certifique-se de que o animal está relaxado o suficiente para ser facilmente manipulado e transferido para a máscara do nariz sem qualquer luta.
5. Transfira o rato da câmara de indução para uma máscara de nariz de anestesia e reduza o nível de isoflurane para 1,5% - 2% de mistura de isoflurane/O₂ . Verifique a anestesia completa realizando um teste de retirada da pata.
6. Para realizar o teste de retirada da pata, belisque firmemente a pata animal usando unhas ou fórceps finais sem cortes. Na ausência de qualquer reflexo muscular, considere o animal inconsciente e prossiga para a preparação cirúrgica. Realize este teste antes da manipulação animal e repita regularmente durante os procedimentos anestésicos e cirúrgicos para confirmar a anestesia.
7. Aplique pomada ocular para evitar a desidratação da córnea.
8. Raspe a área ao redor da^4ª glândula mamária usando uma lâmina de barbear (Figura 2A). Use o^4º mamilo como um marco. Remova os cabelos soltos usando fita adesiva.
   NOTA: Alternativamente, o creme depilatório pode ser usado para remover os cabelos.
9. Desinfete a pele exposta com 80% de etanol ou povidone-iodo e posicione o rato na área cirúrgica estéril na parte de trás com o focinho em uma máscara de nariz de anestesia usando 1,5% de mistura de isoflurano/O₂ .
10. Fixar os membros dianteiro e traseiro do mouse usando fita de papel.
    NOTA: Deixe o camundongo anestesiado e em recuperação na almofada de aquecimento o máximo possível, durante e após a cirurgia.
11. Use uma cortina cirúrgica pré-cortada ou gaze para cobrir o mouse enquanto deixa a área cirúrgica exposta.

Implantação de R.MIW 3. (tempo estimado: 30 min)

1. Verifique se o animal está adequadamente anestesiado realizando um teste de retirada da pata. Levante suavemente a pele usando um fórceps graefe fino e faça uma incisão diagonal de 10-15 mm usando uma pequena tesoura de mola na pele em cima da almofada de^{gordura mamária} 4 usando o^4º mamilo como ponto de orientação (Figura 2A). Certifique-se de não cortar ou danificar o peritônio ou a glândula mamária.
2. Defina a região de interesse (ROI) com base em características macroscópicas do tecido mamário, incluindo a localização do linfonodo ou uma lesão tumoral, e tente manter o ROI central no que diz respeito à incisão.
3. Separe a pele da almofada de gordura mamária e camadas de tecido subjacente usando dissecção contundente de até 5-8 mm em toda a linha de incisão para criar um bolso para caber no quadro R.MIW (Figura 2BI).
4. Pegue o R.MIW usando fórceps estéreis e teste se a incisão é grande o suficiente para inserir a janela. Se necessário, amplie ligeiramente a incisão até que o R.MIW se encaixe.
5. Remova o R.MIW e coloque uma sutura de corda de bolsa em torno da incisão usando uma sutura de seda 5-0 (trançada, não resorbável). Coloque a sutura de 1-2 mm da borda da incisão do lado de fora para o interior da pele, a partir da extremidade caudal da incisão.
6. Mova aproximadamente 5 mm para cima ao longo da incisão e passe o fio de sutura através da pele de dentro para fora. Repita este procedimento ao longo da borda da incisão, criando assim uma sutura circular composta por 5-6 loops (Figura 2BII). A saída final da linha de sutura deve estar localizada a aproximadamente 2-5 mm de distância da primeira entrada.
   NOTA: Tenha cuidado para não colocar a sutura muito perto da borda da incisão, pois isso aumenta o risco de rasgo da pele. Colocar a sutura muito longe da borda da incisão aumenta o risco de infecção entre o excesso de pele e o sulco do R.MIW.
7. Coloque o R.MIW dentro da incisão e use os fórceps Graefe para colocar cuidadosamente a pele no sulco do R.MIW. Certifique-se de deixar os laços da sutura lá fora.
8. Puxe os laços da sutura da corda da bolsa e aperte a sutura no sulco do R.MIW puxando suavemente as duas extremidades da sutura (Figura 2BIII). Amarre com nós cirúrgicos e corte o excesso de rosca.
9. Aplique geleia de petróleo na borda interna do R.MIW usando um palito de dente, ao mesmo tempo em que certifique-se de evitar o tecido subjacente. Empurre suavemente a estrutura da janela para baixo com fórceps estéreis ou duas pontas dos dedos, e posicione a tampa no quadro R.MIW (Figura 1B). Isso evitará um volume de ar entre o tecido da glândula mamária e a tampa R.MIW.
10. Coloque as pontas de fórceps finos através dos orifícios nos braços da tampa e aperte a tampa torcendo a tampa no sentido horário (aproximadamente 5°) (Figura 1C e Figura 2BIV).
11. Se algum ar permanecer depois de apertar a tampa R.MIW, use uma agulha de insulina estéril para remover o excesso de ar. Introduza a agulha através da pele na cavidade entre o tecido mamário e a tampa e puxe lentamente o êmbolo, criando assim um vácuo entre o tecido da glândula mamária e a tampa R.MIW.
12. Administrar, pós-cirurgia, analgesia como buprenorfina (0,1 mg/kg diluído em NaCl estéril 0,9%) por injeção subcutânea. Repita a injeção subcutânea com buprenorfina às 8h e 16h após a cirurgia.
13. Coloque o mouse de volta na gaiola para se recuperar e monitorar de perto até que esteja totalmente acordado, ou proceda com a etapa 4 para imagens imediatas.
14. Nesta fase pós-cirúrgica, monitore os camundongos de perto em busca de sinais de desconforto ou complicações com base em parâmetros vitais, como respiração, reatividade, comportamento, postura e peso corporal. Monitore a pele ao redor da janela cuidadosamente para sinais de inflamação e necrose. Se não ocorrerem complicações, o R.MIW permitirá repetidas sessões de IVM ao longo de várias semanas após a implantação.

Figura 2: Visão geral do procedimento cirúrgico e implantação da janela. (A) Uma incisão diagonal é feita perto do^4º mamilo de um camundongo fêmea e a pele e o tecido subjacente são desconectados por dissecção contundente. (B) O linfonodo inguinal e a forma da almofada de gordura podem ser usados para a orientação correta do tecido (I). Uma sutura de corda de bolsa é colocada na pele ao redor da incisão (II), e após o encaixe na moldura da janela, a sutura é apertada no sulco para fixar a estrutura da janela, e fixada por nós cirúrgicos (III). O último passo é a inserção e bloqueio da tampa na moldura da janela (IV). Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

4. Microscopia intravital repetida através do R.MIW

NOTA: A estratégia repetida de IVM descrita aqui foi otimizada para um sistema confocal multifotônio invertido equipado com um estágio motorizado e uma câmara de clima escuro a 35,8 °C.

1. Anestesiar o rato em uma câmara de indução usando uma mistura de isoflurane/O_{2 de} 3%. Verifique a perda de consciência realizando um teste de retirada da pata (descrito na etapa 2.6). Aplique pomada ocular para evitar a desidratação da córnea durante a sessão de imagem.
2. Inspecione a condição da estrutura e da tampa R.MIW, incluindo a estabilidade das suturas ou qualquer dano potencial à tampa. Em caso de dano à tampa, a tampa pode ser substituída conforme descrito na etapa 5.
3. Transfira o mouse para uma caixa de imagem pré-aquecida (37 °C), feita sob medida (Figura 3A) e coloque o mouse com a cabeça no cone do nariz. A caixa de imagem consiste em um quadro que se encaixa dentro do estágio automatizado do microscópio. O quadro foi projetado para manter uma inlay personalizada com um orifício do diâmetro do R.MIW (Figura 3A) .
4. Uma entrada com um cone de nariz é conectada à frente da caixa e anexada a uma estação vaporizadora isoflurane usando 2%-3% de mistura de isoflurane/O₂. Uma tomada é conectada a uma unidade de limpeza anestésico para garantir a circulação e evitar o acúmulo de isoflurane na caixa. A caixa de imagem pode ser fechada usando uma tampa transparente.
5. Posicione o mouse na entrada de tal forma que o R.MIW caia no orifício da caixa de imagem inlay (Figura 3A). Aplique parafilm e fita de papel na parte de trás do mouse para estabilizar o mouse e reduzir o movimento do tecido devido à respiração.
6. Feche a caixa de imagem com a tampa e insira a caixa de imagem no estágio do microscópio.
7. Reduza gradualmente a dose de isoflurane ao longo da sessão de imagem para sustentar uma anestesia estável, mas superficial (tipicamente entre 1,5%-0,8% de isoflurano/O₂ ).
8. Forneça nutrição adequada durante a imagem, conforme descrito abaixo.
   1. Para sessões de imagem <3 h, injete o mouse subcutâneamente com 200-300 μL de PBS estéril para hidratação.
   2. Para sessões de imagem >3h, siga os passos descritos abaixo.
      1. Para imagens de longo prazo, infunda o rato com nutrientes. Para isso, use uma mistura de infusão estéril comercialmente disponível contendo aminoácidos e glicose. Coloque uma agulha flexível subcutânea no pescoço do mouse e fixe-a com fita de papel.
      2. Conecte uma seringa de 10 mL com a mistura de nutrientes preparada a um tubo de silício flexível e empurre a mistura de nutrientes até chegar ao fim do tubo.
      3. Conecte o tubo de silicone à agulha flexível. Pegue a extremidade da tubulação e coloque-a através de um dos orifícios da caixa de imagem (de dentro para fora, deixando o lado de fixação da agulha na caixa).
      4. Injete 50 μL de solução infundida a cada 30 minutos.
9. Fixar a caixa de imagem no estágio do microscópio e definir a área de interesse usando o modo de epifluorescência do microscópio.
10. Aplique as configurações desejadas do microscópio dependendo do modelo do mouse (Figura 3B). Estruturas de vasos, padrões de colágeno (visualizados pela segunda geração harmônica) e outras estruturas anatômicas estáveis, incluindo o linfonodo inguinal, podem ser usadas como marcos. Adquira imagens usando um microscópio confocal multifotol invertido a uma profundidade de 12 bits, e um objetivo de água de 25x usando um tamanho de passo Z que varia de 1,0 a 4,0 μm (pilha total de z variando de 150 a 800 μm). Aplique as seguintes configurações padrão: formato 1024 x 1024, velocidade de varredura de 600 Hz, modo bidirecional.
11. Visualize as fibras de colágeno I realizando a segunda geração harmônica usando um comprimento de onda de excitação de 860 nm e detecção a 425-435 nm. Comprimentos de onda de excitação e detecção para os diferentes fluoroforos são indicados na Tabela 1.

Mesa 1. Clique aqui para baixar esta Tabela.

12. Use a função Espiral no modo navegador de software de imagem para gerar uma grande visão geral de telhas para criar um mapa de referência do tecido (Figura 3B). Defina os ROIs na visão geral da espiral, defina os planos Z superior e inferior para determinar a pilha Z. Pressione Comece a obter pilhas tridimensionais detalhadas (xyz) ou z-stacks multidimensionais (xizt) do tecido.
    NOTA: Durante todo o experimento de imagem, o mouse deve ser monitorado de perto. Para longas sessões de imagem, recomenda-se um oxímetro de pulso e uma sonda de temperatura. A respiração do rato deve ser regular e no mesmo ritmo. Se o rato começar a mostrar sinais de ofegante, a quantidade de isoflurane deve ser reduzida.
13. No final de cada sessão de imagem, mantenha o mouse em uma almofada de aquecimento até ficar totalmente acordado. Se o mouse apresentar sinais de desconforto ou mobilidade reduzida, mantenha a gaiola por mais tempo na almofada de aquecimento e forneça géis nutrientes em vez da comida normal.
    NOTA: Entre as sessões de imagem, o camundongo deve ser monitorado de perto por sinais de desconforto, como diminuição do consumo de alimentos e água, respiração rápida, diminuição do movimento, tremor, postura corporal anormal ou peles despenteadas. Em caso de sinais claros de desconforto, siga as diretrizes institucionais sobre o bem-estar animal e encerre o experimento quando o ponto final humano for alcançado.
14. Repita as etapas 4.1-4.12 para cada sessão de imagem repetida e use o equipamento de visão geral para refazer a mesma posição(s) em vários pontos de tempo (Figura 3B). A frequência de imagem dependerá da questão da pesquisa e do tempo do processo estudado, e normalmente varia de sessões de imagem duas vezes por dia a uma vez por semana.
15. Ao final do período experimental desejado, eutanize os animais com um R.MIW implantado usando anestesia profunda com isoflurane seguido de deslocamento cervical. Se desejar, dissecar os órgãos de interesse para novas análises ex vivo .
16. Alternativamente, mantenha o animal vivo para futuras análises in vivo . Nesse caso, remova a sutura da bolsa segurando o R.MIW cortando-o com uma tesoura de mola e cuidadosamente desprezando o anel da janela da pele do rato usando fórceps sem cortes. Limpe as bordas da pele que anteriormente segurava a janela e proceda com uma sutura contínua simples (material absorvível, como o ácido poliglicólico).
17. Uma vez que a pele esteja fechada, amarre os fios de sutura de início e término com dois nós quadrados (4 arremessos). Para minimizar a isquemia tecidual, os nós devem ser soltos o suficiente para permitir o fluxo sanguíneo na borda da pele. Desinfete a ferida com povidone-iodo para prevenir inflamações e promover a cicatrização da pele.

Figura 3: Fluxo de trabalho IVM longitudinal. (A) Representação esquemática de um típico experimento de vários dias de IVM. (B) Imagem de uma região tumorigênica dentro da glândula mamária adulta. Antes de cada sessão de imagem, uma visão geral de baixa resolução pode facilitar a identificação da região de interesse durante os dias subsequentes de imagem. O padrão de colágeno I (segunda geração harmônica, magenta), estrutura tecidual e padrões de células rotuladas diferencialmente com proteínas fluorescentes (retratadas em verde, amarelo e vermelho) podem ser usados para refazer a mesma área tecidual. As barras de escala representam 1 mm (chave de visão geral) e 100 μm (painéis inferiores). (C) Representação esquemática da construção do repórter R26-Confetti . Após a recombinação de Cre induzida por tamoxifen, o Confete constrói recombinas estochasticamente, resultando na expressão de um dos quatro fluoroforos (nGFP, YFP, RFP ou mCFP). Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

5. Abrir e fechar a tampa do R.MIW entre as sessões de imagem

1. Mantenha a esterilidade usando luvas estéreis e esterilize todos os itens que entrarão em contato com o mouse. Ferramentas cirúrgicas autoclave antes da cirurgia (veja o passo 2 para obter detalhes).
2. Ligue a almofada de aquecimento e cubra o tapete com uma cortina estéril e anestesia o mouse em uma câmara de indução usando uma mistura de 3% de isoflurane/O₂ . Verifique a anestesia adequada realizando um teste de reflexo de retirada da pata.
3. Transfira o rato da câmara de indução para uma máscara de nariz de anestesia e reduza o nível de isoflurane para 1,5%-2% de mistura de isoflurano/O₂ .
4. Coloque as pontas de fórceps finos através dos orifícios nos braços da tampa e solte a tampa torcendo a tampa no sentido anti-horário. Se necessário, aplique um PBS pré-aquecido (37 °C) na janela para facilitar o afrouxamento da tampa.
5. Coloque a tampa do R.MIW em um prato estéril com PBS estéril até usar ainda mais. Limpe a tampa da tampa com demi-água e, posteriormente, 80% de etanol. Mantenha a tampa em PBS estéril até que use mais.
6. Evite que o tecido exposto seque, adicionando algumas gotas de PBS estéreis à superfície do tecido.
7. Aplique ou injete qualquer substância ou célula de interesse no tecido exposto, pode-se utilizar um volume máximo de 50 μL. Espere alguns minutos até que o líquido seja absorvido pelo tecido. Alternativamente, o tecido pode ser manipulado ou reposicionado usando fórceps estéreis e contundentes para otimizar as condições de imagem para ROIs específicos.
8. Aplique geleia de petróleo na borda interna do R.MIW, certificando-se de evitar o tecido subjacente. Posicione a tampa no quadro R.MIW conforme descrito na etapa 3.9, coloque as pontas de fórceps finos através dos orifícios nos braços da tampa e aperte a tampa torcendo a tampa no sentido horário (aproximadamente 5°).

Resultados

Para estudar a dinâmica proliferativa das células epiteliais mamárias durante os diferentes estágios de desenvolvimento da glândula mamária foi realizado o protocolo descrito. O design do R.MIW é retratado na Figura 1, e o procedimento para implantar um R.MIW é resumido na Figura 2. O R.MIW é implantado cirurgicamente entre a glândula mamária e a pele. Uma sutura é usada para segurar dentro do anel da janela e evitar que os ratos puxem as suturas (Figura 2). As suturas que seguram o R.MIW são feitas de seda não absorvível, que tem propriedades hipoalergênicas, uma textura macia, e é fácil de manusear. O anel R.MIW é feito de titânio, um dos materiais mais biocompatíveis que não promovem inflamação ou necrose após a implantação²¹. Se as condições assépticas forem seguidas e as suturas forem bem executadas, a implantação da glândula mamária R.MIW representa um baixo risco de complicações pós-operatórias. Além disso, ao contrário da implantação da janela de imagem abdominal²², a implantação de R.MIW não é um fator limitante para a sobrevivência do camundongo, pois a glândula mamária não é um órgão vital e permite imagens diárias até o limite especificado no protocolo ético. O único fator que limita a duração da implantação da janela é o giro homeostático da pele, o que eventualmente levará as suturas a cair após 4 - 6 semanas. Por isso, é importante inspecionar regularmente a estabilidade das suturas. Se desejar, as suturas podem ser removidas e substituídas por uma nova sutura de corda de bolsa em condições assépticas (conforme descrito nas etapas 3.5 - 3.8) para tranquilizar a estabilidade da janela.

Um grande desafio ao usar a abordagem de imagem de vários dias é refazer um ROI em dias consecutivos. Para isso, uma varredura rápida de visão geral pode ser incluída antes de selecionar o ROI(s) (Figura 3B). Múltiplos marcos teciduais podem ser usados para refazer a mesma região do tecido, incluindo o sinal de rede de colágeno (visualizado pela segunda geração harmônica), estrutura tecidual, bem como padrões locais de células de forma diferencial ou estochasticamente rotulada com corantes ou proteínas fluorescentes (Figura 3B). Neste exemplo representativo, um R.MIW foi implantado na 4ª glândula mamária de um MMTV-PyMT; R26-CreERT2^het; R26-Confetti^het camundongo fêmea no início da formação de tumor palpável. Posteriormente, a recombinação estocástica foi induzida pela injeção de 1,5 mg de tamoxifeno, resultando em recombinação da construção de Confete em algumas células (Figura 3C). As células tumorais recombinadas foram acompanhadas por um período de 20 dias (Figura 3B,C). Se a imagem da mesma região da glândula mamária durante dias consecutivos for impedida, a janela pode ser aberta em um ambiente asséptico (como descrito na etapa 5.1) para clarear ainda mais, e reposicionar o tecido para melhorar a visibilidade e a aquisição de imagens (Figura 3A).

Utilizando este método, a glândula mamária em desenvolvimento durante a puberdade foi seguida no nível de célula única. O IVM repetido através de um R.MIW foi realizado usando ^het R26-CreERT2; Camundongos fêmeas de^{het 100} r26-mTmG entre 4 e 6 semanas de idade, em que todas as células são rotuladas com tdTomato de membrana (Figura 4A)²³. Os camundongos foram injetados com uma baixa dose de tamoxifen (0,2 mg/25 g de peso corporal), resultando em recombinação esporádica da construção mTmG, causando uma mudança de vermelho para verde em algumas células em todos os tecidos, incluindo a glândula mamária (Figura 4B). Os mesmos ROIs foram revisitados ao longo de vários dias para visualizar alterações morfológicas dentro da glândula mamária, incluindo alongamento ductal e ramificação ductal (Figura 4C) em resolução celular. É importante ressaltar que essa combinação de rotulagem celular estocástica e IVM de vários dias também permite visualizar as mudanças dinâmicas do ambiente ductal, como a dinâmica das células únicas no estroma ao redor dos dutos de alongamento e ramificação (Figura 4D), bem como a dinâmica celular dentro do linfonodo inguinal (Figura 4E).

Figura 4: IVM de vários dias de morfogênese de ramificação pubertal. (A) Pubertal R26-CreERT2; Camundongos R26-mTmG com idade entre 4-6 semanas foram injetados com uma baixa dose de tamoxifeno levando à recombinação mediada por Cre do alelo R26-mTmG e foram imagens nos dias 1, 3 e 5 para acompanhar as mudanças dinâmicas no desenvolvimento da glândula mamária. (B) Representação esquemática da construção do mouse R26-mTmG , que em condições não recombinadas resulta em expressão onipresente de membrana tdTomato (mT). Após a recombinação mediada por Cre, mT é alternada para expressão de membrana eGFP (mG). (C) renderização 3D de um duto mamário alongado e ramificado ao longo de vários dias, imagens através de um R.MIW em um R26-CreERT2; R26-mTmG rato fêmea com 6 semanas de idade. (D) Imagens de plano Z único da ponta de ramificação (painéis superiores) e do ramo alongamento (painéis inferiores). mT é retratado em vermelho, e mG em ciano, barras de escala representam 100 μm (A e B). Células únicas no estroma são destacadas por asteriscos brancos. Note que a intensidade do sinal foi aumentada manualmente para destacar as células únicas no estroma, levando a uma aparência ligeiramente superexposta das células epiteliais mamárias. (E) Imagens representativas do linfonodo inguinal de um R26-CreERT2; O mouse feminino R26-mTmG é imageado através de um R.MIW, mostrando uma varredura de ladrilhos (painel esquerdo), imagens de zoom (painéis direito) de um único plano Z (superior) e uma renderização 3D (inferior). A segunda geração harmônica (colágeno I) é mostrada em verde, mT em vermelho e mG em ciano. As barras de escala representam 500 μm (inclinação geral) e 100 μm (imagens de zoom). Os painéis de figura C e D são modificados a partir de Messal et al. ². Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Da mesma forma, na glândula mamária adulta, a abordagem R.MIW proposta permite a visualização das mesmas estruturas ductais ao longo de vários dias com visibilidade descomprometida. Mesmo o uso de modelos de repórter fluorescentes menos brilhantes²⁴, como o modelo de mouse Cdh1-mCFP (Ecadherin-mCFP), permite a visualização da estabilidade ductal e alterações morfológicas sutis em uma resolução celular (Figura 5). Note que a visibilidade entre o dia 3 e o dia 5 melhorou significativamente após o reposicionamento tecidual (Figura 5).

Figura 5: Imagens de vários dias da glândula mamária adulta. 3D renderizadas imagens de uma estrutura ductal mamária de uma fêmea adulta Cdh1-mCFP (ciano, marcando a expressão de células luminais positivas de Ecadherin) durante vários dias consecutivos. O padrão de colágeno I (segunda geração harmônica, magenta) foi usado para refazer o mesmo ROI, e o sinal Cdh1-mCFP foi usado para marcar as células ductais (luminais). Note que a visibilidade após o terceiro dia foi melhorada pela abertura da tampa R.MIW e reposicionamento do tecido. As barras de escala representam 100 μm. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Para avaliar a heterogeneidade proliferativa das células epiteliais mamárias durante o ciclo hormonal no nível unicelular^{, utilizou-se} o modelo de rato kikume green-vermelho (KikGR)^{foto-conversível} (KikGR), que tem expressão onipresente da proteína KikGR. KikGR é um fluoróforo brilhante que sofre conversão verde-vermelho após exposição à luz violeta e a razão vermelho/verde pode ser usada como proxy para a atividade proliferativa de uma célula² (Figura 6A,B). Usando a abordagem R.MIW, seguimos as mesmas células dentro da árvore ductal da glândula mamária adulta ao longo de vários dias e encontramos heterogeneidade proliferativa anteriormente inesperada em toda a árvore ductal (Figura 6C). Células proliferativas altas e baixas foram igualmente distribuídas sobre as diferentes áreas convertidas (Figura 6C,D). Surpreendentemente, no nível local, as células vizinhas apresentaram grandes diferenças em sua relação vermelho/verde (Figura 6C,D). Quantificação da razão vermelho/verde de diferentes células (como proxy para sua atividade proliferativa) 10 dias após a foto-conversão, revelou taxas de diluição altamente variáveis de algumas células dentro do mesmo microambixe ductal (Figura 6E). Juntos, esses dados revelam uma notável heterogeneidade local proliferativa dentro da glândula mamária adulta e, ao mesmo tempo, uma taxa de rotatividade uniforme global.

Figura 6: IVM longitudinal de heterogeneidade proliferativa na glândula mamária adulta usando o modelo de rato KikGR. (A) Os camundongos KikGR foram imageados no dia 0 antes e depois da exposição à luz violeta. As sessões de imagem foram repetidas nos dias 2, 6 e 10 após a conversão. (B) Representação esquemática dos desfechos hipotéticos após a foto-conversão de células epiteliais mamárias KikGR após a proliferação (painel esquerdo) e nenhuma proliferação (painel direito) em função do tempo. (C) A mesma área da glândula mamária foi imagens através de um R.MIW durante um período de 10 dias. Regiões menores foram foto-convertidas no dia 0 e mostram uma taxa de diluição semelhante do sinal vermelho Kikume ao longo do tempo, indicando uma taxa de rotatividade igual em todo o epitélio. (D) Imagens de zoom (monomotores únicos) das regiões indicadas no painel C mostram heterogeneidade proliferativa no nível celular 6 e 10 dias após a conversão de fotos. As barras de escala representam 100 μm (painel C) e 10 μm (painel D). (E) Quantificação da razão vermelho/verde de células selecionadas aleatoriamente (n = 48 células) em três áreas foto-convertidas. Uma alta relação vermelho/verde é indicativa de baixa taxa de diluição e atividade de baixa proliferação, enquanto uma baixa relação vermelho/verde é indicativo de uma alta taxa de diluição e proliferação. Os painéis de figuras C-E foram modificados de Messal et al. ². Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Discussão

O R.MIW permite imagens longitudinais da glândula mamária saudável e doente em seu ambiente nativo e minimamente interrompido e permite a visualização repetida da glândula mamária em diversos estágios de desenvolvimento. O design R.MIW permite que a janela seja aberta a qualquer momento durante o experimento. O acesso visual a longo prazo ao tecido de interesse pode ser dificultado, por exemplo, pelo acúmulo de detritos celulares na mancha de cobertura. Nesses casos, o R.MIW pode ser aberto antes ou imediatamente após uma sessão de imagem para permitir a limpeza de toda a área e tampa do tecido visível. A tampa removível também permite manipulações do tecido, bem como a aplicação local de substâncias, como inibidores e terapias específicas, corantes de rotulagem ou tipos de interesse celular específicos.

Este método supera a limitação dos procedimentos de inflamação mamária descritos anteriormente 4,7,8,13, que estão limitados a uma sessão de imagem, e podem visualizar processos como morfognese ramificada (Figura 5), rotatividade de tecido homeostático (Figura 6) ou crescimento tumoral a nível celular (Figura 3B ). No entanto, ao mesmo tempo, o R.MIW permite a manipulação local do tecido entre as sessões de imagem, que compreende um grande ativo do R.MIW em comparação com o MIW ^3,18 publicado anteriormente e todas as outras janelas^{de imagem 20,22}. Ao abrir o R.MIW, é importante manter as condições assépticas o tempo todo para evitar qualquer fonte de infecção. A capacidade de abrir o R.MIW em um ambiente asséptico permite otimizar as condições de imagem antes de cada sessão de imagem, o que melhora muito o acesso visual a longo prazo ao tecido de interesse. Especificamente, na glândula mamária, que está embutida em um estroma rico em adipócito, isso é de grande valor. Além disso, a tampa substituível poderia permitir exclusivamente a administração local de terapêutica, diferentes tipos de células, corantes de rotulagem, microdissecção guiada por imagem ou qualquer outra manipulação local do tecido sem a necessidade de encerrar o experimento IVM. Por exemplo, para estudar a iniciação tumoral, populações específicas de células cancerígenas poderiam ser injetadas diretamente na árvore ductal ou estroma em um determinado ponto de tempo ivm e localização precisa da glândula mamária, desde que este ROI seja acessível através do anel R.MIW. Para estudar a progressão do tumor, populações específicas de células cancerígenas (em um local específico, em um microambiente específico ou com um comportamento específico) poderiam ser foto-marcadas durante a sessão de IVM e, posteriormente, microdissectadas usando um microscópio de dissecção fluorescente após a abertura do R.MIW. Células isoladas podem ser processadas para análises a jusante, como o sequenciamento mRNA (unicelular). Usando essa abordagem, pode-se acoplar o comportamento celular in vivo a perfis de expressão molecular. A vantagem da administração de medicamentos local habilitada pelo R.MIW permite que o tecido seja imageado antes e diretamente após o tratamento. O intervalo necessário para remover o mouse da caixa de imagem e para posteriormente realizar a administração local de medicamentos após a abertura da tampa R.MIW pode ser realizado em minutos, o que permite a captura de fase imediata de drogas de ação rápida.

Mostramos que o IVM da glândula mamária através do R.MIW é compatível com muitos modelos diferentes de mouse de repórter fluorescente. O ambiente rico em adiposos é desafiador para a imagem e, portanto, recomenda-se o uso de fluoroforos brilhantes. No entanto, como mostrado aqui, fluoroforos ainda menos brilhantes como o mCFP podem ser visualizados através do R.MIW em condições ideais de imagem. Inevitavelmente, a almofada de gordura impedirá a imagem das estruturas ductais mais profundas, e limitará a imagem aos dutos mais superficiais. Uma imagem de visão geral de baixa resolução no início de cada experimento IVM ajudará a identificar as estruturas ductais de interesse que são suficientemente superficiais para imagens de alta resolução. Manipulação de tecido local, remoção de tecido conjuntivo ou reposicionamento do tecido adiposo após a abertura do R.MIW podem otimizar o IVM para ROIs específicos que são sobrepostos por tecido adiposo. Esta é uma vantagem importante sobre todos os projetos de janelas anteriores, que não permitem realizar essas manipulações e exigiriam a remoção completa da própria janela. Especificamente, para visualização do linfonodo inguinal, recomenda-se remover suavemente o tecido gorduroso sobredisco, o que reduz a dispersão da luz e permite imagens de alta resolução. Ao manipular o tecido, mantenha sempre as condições assépticas e evite sangramentos ou danos graves ao tecido, pois podem afetar os processos que estão sendo estudados durante o experimento IVM.

O R.MIW é feito de titânio, um material que é comumente usado na prática clínica para substituir tecidos duros, como articulações ou placas ósseas. O titânio tem várias vantagens sobre janelas de aço, incluindo seu personagem leve e inerte²¹. Recentemente, vários outros materiais foram usados para gerar novos tipos de janelas de imagem, incluindo a janela de silício flexível²⁰. Em contraste com o R.MIW, a janela flexível não requer suturas para implantação e é adequada para quase qualquer posição anatômica, especificamente no caso de tecidos moles e frágeis. As janelas de silício têm um impacto mínimo na motilidade animal devido à sua natureza leve e deformável e talvez mais adequada em experimentos que estudam a rápida expansão e crescimento^{de tecidos 20}. Outra vantagem sobre a versão de titânio é que as janelas de silício são compatíveis com outras modalidades de imagem, incluindo ressonância magnética^20,27. No entanto, será importante ter em mente que os objetivos são otimizados para tampas de vidro de 0,17 mm. Além disso, o tecido mamário é suscetível a movimentos respiratórios, que são difíceis de restringir usando a janela flexível, especialmente quando se usa um microscópio invertido. Os artefatos respiratórios são minimizados pelo design R.MIW e pela fixação do R.MIW na entrada da caixa de imagem. Como resultado, as imagens adquiridas usando a configuração R.MIW proposta não são distorcidas devido a artefatos respiratórios. No entanto, podem ocorrer pequenas derivas na localização tecidual, que geralmente são graduais e podem ser corrigidas usando o software de correção de movimento pós-aquisição²⁸. Com o aumento da caixa de ferramentas das tecnologias IVM ^2,20, os requisitos específicos para cada experimento eventualmente determinarão a melhor forma de visualização in vivo do tecido de interesse. Diferentes projetos de janelas têm diferentes vantagens e desvantagens e, dependendo da questão da pesquisa, da configuração disponível de microscopia, da resolução espacial e temporal necessária, e do tempo total do processo estudado, a abordagem ideal precisa ser determinada.

Em resumo, o R.MIW facilita a caracterização de alta resolução da dinâmica celular durante o desenvolvimento da glândula mamária, homeostase e doenças durante vários dias a semanas.

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
0,9% NaCl	BD	306573	Outras marcas disponíveis
Tampa de vidro redonda de 10 mm	Fisher scientific	10696365	Outras marcas disponíveis
5-0 suturas de seda trançada	Ethicon	W580
80% Etanol	caseiro	NA
Caixa de indução de anestesia	Kentscientific	VetFlo-MSEKIT
Buprenorfina (veterinária)	Ecuphar	NA
Pontas de algodão (estéreis)	Fisher scientific	13113743	Outras marcas disponíveis
Adesivo de cianoacrilato	Loctite	NA	Outras marcas disponíveis
Pomada para os olhos	Duratears	NA
Agulha borboleta flexível	Greiner Bio-One	450120	Outras marcas disponíveis
Pinça Graefe (romba)	Ferramentas de Aquecimento Fine Science	Tools 11051-10
	Kentscientific	RightTemp Jr.	Outras marcas disponíveis
Caixa de imagem	NA		feita à medida
	Braun	Nutriflex special 70/240
Seringas de insulina	BD	324911	Outras marcas disponíveis
Microscópio multi-fotónico invertido com platina automatizada	Leica Microsystems	NA
Vaporizador de isoflurano	Kentscientific	VetFlo-1231K
Porta-agulhas	Fine Science Tools	12510-14
Parafilm	Sigma-Aldrich	P7793	fita semitransparente
Fita de papel tesa	Tesa	NA
Vaselina	Vaselina	NA
Lâminas de barbear	Fisher scientific	11904325	Outras marcas disponíveis
Tubos de silicone	Soluções Elastomeres	NA	Qualquer utilidades domésticas
Tesoura de mola (pequena)	Fine Science Tools	15018-10
Estéril PBS	ThermoFisher Scientific	10010023
Seringa (10 ml)	BD	305482	Outras marcas disponíveis
Pinça fina	Fine Science Tools	11413-11
Tampa de titânio para janela	de imagem mamáriaCustom	made NA
Titanium janela de imagem mamária		made NA
Varas de madeira palitos de dente	Fisher científico	NC1678836	Outras marcas disponíveis