Summary
该协议描述了一种带有可更换盖子（R.MIW）的新型乳腺成像窗口。植入R.MIW后的活体显微镜检查允许在不同发育阶段以细胞分辨率对健康和患病的乳腺进行纵向和多日成像。
Abstract
乳腺的分支结构是高度动态的，出生后经历几个生长和重塑阶段。活体显微镜检查与皮瓣手术或成像窗口植入相结合，已被用于研究不同发育阶段健康乳腺的动力学。大多数乳腺成像技术仅限于数小时至数天的时间范围，而大多数乳腺重塑过程发生在数天至数周的时间范围内。为了研究乳腺重塑，需要允许在更长的时间范围内光学访问感兴趣组织的方法。在这里，描述了带有可更换盖子（R.MIW）的钛乳腺成像窗口的改进版本，该窗口允许以细胞分辨率对乳腺进行高分辨率成像长达数周。重要的是，R.MIW在活体成像实验的整个持续时间内提供组织通路，因此可用于局部组织操作，标记，药物管理或图像引导的显微切割。综上所述，R.MIW能够高分辨率表征乳腺发育，体内平衡和疾病期间的细胞动力学。
Introduction
乳腺上皮是哺乳动物中存在的独特分泌器官，它产生和分泌乳汁以滋养后代。在整个生命中，乳腺经历多轮的发育和生长，伴随着组织的结构和功能变化1。根据发育阶段，有助于组织重塑的细胞类型以及导管树内的位置是不同的。
多光子活体显微镜（IVM）允许在天然和最小扰动设置2，3，4中研究体内乳腺细胞动力学。为了获得对乳腺的视觉访问，在乳腺发育的不同阶段，已经发表了几种临时的离体或皮瓣成像技术，包括青春期4，5，6，7，成年期2，8，哺乳期9，10，11，12和肿瘤动力学13，14，15.虽然这些技术导致乳腺细胞动力学的高空间和时间分辨成像，但时间范围仅限于数小时，而大多数乳腺重塑过程需要数天至数周。因此，需要允许在更长的时间范围内光学访问感兴趣组织的方法。多年来，已经开发了几种永久性成像窗口用于乳腺肿瘤成像15，16，17，18，包括钛乳腺成像窗口（MIW）2，3，19。虽然对研究乳腺肿瘤生长非常有用，但健康乳腺结构的可视化仍然局限于几天。最近，开发了一种柔性硅成像窗口，可以在20周内可视化耻骨乳腺。然而，乳腺嵌入富含脂肪细胞的脂肪垫中，这导致广泛的光散射，从而导致乳腺导管结构的可见性有限。因此，始终需要更好的成像条件来可视化乳腺中长时间的组织动力学。无论是经典的MIW还是柔性硅窗口都不允许在成像之前进行组织操作或优化物理组织位置，因为窗口在手术和植入后形成一个封闭的系统。因此，在较长的时间内，对下层乳腺组织的最佳光学通路可能会被排除在外。相比之下，皮瓣技术确实允许在成像过程中优化和重新定位组织，并且皮瓣可以重复多次2。然而，只有在手术之间分配足够的时间（至少7天）以允许皮肤恢复时，才有可能通过皮瓣进行重复成像，因此最适合在更长的时间尺度上研究过程。此外，建议不要多次进行此程序，因为它具有侵入性，并且在伤口闭合时感染和疤痕的风险很大。
为了克服这些限制，即确保长时间以高频进行最佳成像条件，同时允许组织操作，设计了一种带有可更换盖子（R.MIW）的改进钛版本MIW，以可视化多天至第2 周的健康病变乳腺（图1A，R.MIW是定制的，以提供最佳的组织通路，在整个IVM实验期间实现直接的组织操作，从而允许在正确的时间和地点长时间内可视化乳腺。当闭合时，R.MIW形成一个与经典MIW相当的气密系统（图1C）。当在无菌条件下打开时，R.MIW允许局部组织操作以改善光学可及性，并且还能够局部施用物质，例如途径抑制剂或激动剂，注射不同感兴趣的细胞类型，例如癌细胞或免疫细胞群，或添加组织标记染料。在成像过程之间的任何时刻都可以打开盖子，而不会对下层组织造成损害。
图 1：带有可更换盖的乳腺成像窗口的设计。（A） 乳腺成像窗口可更换盖子的顶视图和侧视图，将 10 mm 盖玻片粘在环上。（B）乳腺成像窗口的顶视图和侧视图，由外环和内环组成，中间有一个凹槽，用于使用钱包串缝合线将窗口固定在小鼠的皮肤内。外圈有一个小凹槽，适合盖子的四个凸起（臂）。（三）展示盖子开启和关闭机制的卡通和图片。倾斜的投影确保盖子固定在窗框内。此图已从 Messal 等人那里修改而来。
该协议描述了R.MIW的设计和植入程序，以及一种纵向IVM策略，用于以细胞分辨率重新审视相同的乳腺导管及其可视化。R.MIW允许在各种荧光报告小鼠模型中跟踪乳腺不同发育阶段的细胞分裂和形态变化。综上所述，R.MIW有助于在乳腺发育，体内平衡和疾病期间对细胞动力学进行高分辨率表征。
Protocol
本文中描述的所有程序均按照IACUC和KU Leuven的指南执行，并在批准的项目申请P160 / 2020的背景下进行。在执行本方案之前，请与机构兽医一起审查镇痛策略，并根据机构指南进行术前和术后镇痛。
1. R.MIW的准备（估计时间：2小时）
注意：对于R.MIW的构造，建议找到专门处理钛等硬质材料的本地制造商，因为这需要特殊的工具和专业知识。专门从事钛假肢设计和制造的车间通常具有生产R.MIW零件的机械和专业知识。
- 将R.MIW的盖子放在无菌表面上，盖子的外部朝上（盖子的臂向下倾斜; 图 1A）。
- 在盖子的整个边缘周围涂上氰基丙烯酸酯粘合剂胶水，并在盖子顶部小心地放置10毫米圆形玻璃盖玻片。
注意：在外科手术过程中，始终准备一个带有玻璃盖玻片的备用盖子作为备用。 - 使用无菌木棍定位玻璃盖夹，并施加一些力将其向下推，以确保玻璃盖玻片和盖子框架之间的气密密封。确保盖子臂上的孔没有被玻璃遮盖。
- 通过在封闭的培养皿中浸入80%乙醇中至少30分钟来消毒盖子和R.MIW。
注意：不要将盖子放在80%乙醇中超过1小时，以避免氰基丙烯酸酯粘合剂胶的溶解。 - 使用浸泡在丙酮中的棉头从玻璃盖玻片中除去多余的氰基丙烯酸酯粘合剂胶水。
- 将盖子和R.MIW存放在无菌环境中，直到进一步使用。
注意：R.MIW框架和盖子可以保存在无菌管或袋子中最多1周。恢复实验时，在继续实验方案之前，请始终检查玻璃盖玻片是否仍然正确连接到盖子上。
2. 手术准备（预计时间：15分钟）
注意：对于R.MIW植入程序，可以使用任何菌株的雌性小鼠（>3.5周龄）。
- 使用无菌手套保持无菌状态，并对所有将与鼠标接触的物品进行消毒。用水和温和的肥皂清洗手术工具，风干，用铝箔包裹，没有暴露的角落或边缘，并在手术前使用高压灭菌器在120°C下灭菌20分钟。
- 准备一个无菌手术平台，并用80%乙醇对表面进行灭菌。
注意：为确保无菌，手术可以在流动柜中进行。 - 打开加热垫，用无菌窗帘盖住垫子。将无菌器械布置在无菌悬垂物上，并将R.MIW和至少两个玻璃覆盖的盖子放在培养皿中的无菌磷酸盐缓冲盐水（PBS）中（关闭盖子以避免外部污染）。
- 使用3%异氟醚/ O2 混合物在诱导室中麻醉小鼠。确保动物足够放松，以便轻松操纵并转移到鼻罩上，而不会有任何挣扎。
- 将小鼠从诱导室转移到麻醉鼻罩中，并将异氟醚水平降低至1.5%-2%异氟醚/ O2 混合物。通过执行爪子戒断测试来验证全麻醉。
- 要进行爪子戒断测试，请用指甲或钝的末端镊子用力捏住动物爪子。在没有任何肌肉反射的情况下，将动物视为无意识并继续进行手术准备。在动物操作之前进行此测试，并在麻醉和外科手术过程中定期重复以确认麻醉。
- 涂抹眼药膏，防止角膜脱水。
- 使用剃须刀片剃除第 4个乳腺周围的区域（图2A）。使用第 4 个作为标志。使用胶带去除松散的毛发。
注意：或者，脱毛膏可用于去除毛发。 - 用80%乙醇或聚维酮碘消毒暴露的皮肤，并使用1.5%异氟醚/ O2 混合物将小鼠置于背部的无菌手术区域，将鼻子放入麻醉鼻罩中。
- 用纸胶带固定鼠标的前肢和后肢。
注意：在手术期间和手术后，尽可能将麻醉和恢复的鼠标放在加热垫上。 - 使用预切的无菌手术悬垂物或纱布覆盖鼠标，同时使手术区域暴露在外。
3. R.MIW植入（估计时间：30分钟）
- 通过进行爪子戒断测试来验证动物是否得到充分的麻醉。使用细小的Graefe镊子轻轻抬起皮肤，并使用第 4个乳腺脂肪垫顶部的小弹簧剪刀在皮肤上用10-15毫米的对角线切口，使用第 4个作为方向点（图2A）。确保不要割伤或损伤腹膜或乳腺。
- 根据乳腺组织的宏观特征（包括淋巴结或肿瘤病变的位置）定义感兴趣区域（ROI），并尝试将ROI保持在切口的中心位置。
- 使用切口线周围长达5-8 mm的钝解剖将皮肤与乳腺脂肪垫和下层组织层分开，以创建适合R.MIW框架的口袋（图2BI）。
- 使用无菌镊子拿起R.MIW，并测试切口是否足够大以插入窗口。如果需要，请稍微扩大切口，直到R.MIW适合。
- 取下R.MIW，并使用5-0丝缝线（编织，不可吸收）在切口周围放置一个钱包串缝合线。将缝合线从切口边缘从外部到皮肤内部1-2mm，从切口的尾端开始。
- 沿切口向上移动约5毫米，并将缝合线从内到外穿过皮肤。沿着切口的边缘重复此过程，从而创建由5-6个环组成的圆形缝合线（图2BII）。缝合线的最终出口应位于距离第一个入口约2-5毫米的位置。
注意：注意不要将缝合线太靠近切口边缘，因为这会增加皮肤撕裂的风险。将缝合线放置在离切口边缘太远会增加多余皮肤和R.MIW沟槽之间感染的风险。 - 将R.MIW安装在切口内，并使用Graefe镊子小心地将皮肤放在R.MIW的凹槽中。确保将缝合线的环留在外面。
- 拉动缝合线的环，然后通过轻轻拉动缝合线的两端来拧紧R.MIW凹槽中的缝合线（图2BIII）。用手术结绑住，切掉多余的线。
- 使用牙签将凡士林涂抹在R.MIW的内缘，同时确保避开下面的组织。用无菌镊子或两个指尖轻轻向下推窗框，然后将盖子放入R.MIW框架中（图1B）。这将避免乳腺组织和R.MIW盖之间的空气量。
- 将薄镊子的尖端穿过盖子扶手上的孔，然后顺时针旋转盖子（约5°）拧紧盖子（图1C 和 图2BIV）。
- 如果拧紧R.MIW盖子后仍有一些空气，请使用无菌胰岛素针头去除多余的空气。将针头通过皮肤引入乳腺组织和盖子之间的腔中，然后慢慢拉出柱塞，从而在乳腺组织和R.MIW盖子之间产生真空。
- 通过皮下注射，手术后，镇痛如丁丙诺啡（0.1mg / kg在无菌0.9%NaCl中稀释）。施用。在手术后8小时和16小时用丁丙诺啡重复皮下注射。
- 将鼠标放回笼中以恢复并密切监视，直到完全清醒，或继续执行步骤4以立即成像。
- 在这个术后阶段，根据重要参数（如呼吸，反应性，行为，姿势和体重）密切监测小鼠的不适或并发症迹象。仔细监测窗户周围的皮肤是否有炎症和坏死的迹象。如果没有发生并发症，R.MIW将允许在植入后几周内重复进行IVM治疗。
图2：外科手术和窗口植入概述。 （A）在雌性小鼠的第 4个附近做一个对角线切口，通过钝性解剖断开皮肤和下层组织。（B）腹股沟淋巴结和脂肪垫的形状可用于组织的正确方向（I）。将钱包串缝合线放置在切口（II）周围的皮肤中，并在安装到窗框后，将缝合线拧紧在凹槽中以固定窗框，并用手术结（III）固定。最后一步是将盖子插入并锁定到窗框（IV）中。 请点击此处查看此图的大图。
4. 通过R.MIW反复进行活体显微镜检查
注意：这里描述的重复IVM策略针对配备电动载物台和35.8°C暗气候室的倒置多光子共聚焦系统进行了优化。
- 使用3%异氟醚/ O2 混合物在诱导室中麻醉小鼠。通过执行爪子戒断测试（如步骤2.6中所述）来验证意识丧失。在成像过程中涂抹眼药膏以防止角膜脱水。
- 检查R.MIW框架和盖子的状况，包括缝合线的稳定性或盖子的任何潜在损坏。如果盖子损坏，可以按照步骤5中所述更换盖子。
- 将鼠标转移到预热（37°C），定制的成像盒（图3A）中，并将带有头部的鼠标放入鼻锥中。成像盒由一个框架组成，该框架适合显微镜的自动载物台。该框架设计用于固定一个定制的镶嵌物，该镶嵌物带有一个直径与R.MIW相当的孔（图3A）。
- 带有鼻锥的入口连接到箱子的前面，并使用2%-3%异氟醚/ O 2混合物连接到异氟醚汽化器站。出口连接到麻醉剂清除装置，以确保循环并防止异氟醚积聚在盒子中。成像盒可以使用透明盖子关闭。
- 将鼠标放置在嵌体上，使R.MIW落入成像盒嵌体的孔中（图3A）。在鼠标背面涂上parafilm和纸带，以稳定小鼠并减少由于呼吸引起的组织运动。
- 用盖子关闭成像盒，然后将成像盒插入显微镜的载物台。
- 在影像学检查过程中逐渐减少异氟醚剂量，以维持稳定但浅表麻醉（通常介于 1.5%-0.8% 异氟醚/O2 混合物之间）。
- 在成像过程中提供适当的营养，如下所述。
- 对于<3小时的成像过程，皮下注射小鼠200-300μL无菌PBS以进行水合作用。
- 对于>3小时的成像会话，请按照以下步骤操作。
- 对于长期成像，向小鼠注入营养物质。为此，使用含有氨基酸和葡萄糖的市售无菌浸泡混合物。将一根柔性针皮下注射到鼠标的颈部，并用纸带固定。
- 将10 mL注射器与准备好的营养混合物连接到柔性硅管上，并将营养混合物推过，直到它到达管的末端。
- 将硅胶管连接到柔性针。取下管子的末端，将其穿过成像盒的一个孔（从内到外，将针连接侧留在盒子中）。
- 每30分钟注入50μL浸泡溶液。
- 将成像盒固定在显微镜的载物台上，并使用显微镜的落射荧光模式定义感兴趣的区域。
- 根据小鼠型号应用所需的显微镜设置（图3B）。血管结构、胶原模式（通过二次谐波产生可视化）和其他稳定的解剖结构（包括腹股沟淋巴结）可用作标志。使用12位深度的倒置多光子共聚焦显微镜采集图像，并使用1.0至4.0μm的Z步长（总z轴范围为150至800μm）采集25倍水物镜。应用以下标准设置：1024 x 1024 格式、600 Hz 扫描速度、双向模式。
- 通过使用860 nm的激发波长进行二次谐波生成并在425-435 nm处进行检测来可视化胶原I纤维。不同荧光基团的激发和检测波长如 表1所示。
表 1.请按此下载此表格。
- 在成像软件导航器模式下使用 螺旋 功能生成大型概览图块扫描，以创建组织的参考图（图3B）。定义螺旋概览中的 ROI，定义上部和下部 Z 平面以确定 Z 堆栈。按 “开始” 可获取组织的详细三维 （xyz） 或四维 Z 堆叠 （xyzt）。
注意：在整个成像实验过程中，应密切监测小鼠。对于长时间成像，建议使用脉搏血氧仪和温度探头。鼠标的呼吸应该是有规律的，并且速度相同。如果小鼠开始出现喘气迹象，应减少异氟醚的量。 - 在每个成像会话结束时，将鼠标放在加热垫上，直到完全清醒。如果小鼠表现出不适或活动能力下降的迹象，请将笼子放在加热垫上更长的时间，并提供营养凝胶而不是常规的chow。
注意：在成像过程之间，应密切监测小鼠是否有不适的迹象，例如食物和水消耗减少，呼吸急促，运动减少，震颤，身体姿势异常或皮毛未打理。如果出现明显的不适迹象，请遵循有关动物福利的机构指南，并在达到人道终点时终止实验。 - 对每个重复的成像会话重复步骤4.1-4.12，并使用概述平铺扫描在多个时间点上回溯相同的位置（图3B）。成像频率将取决于研究问题和研究过程的时间，并且通常从每天两次到每周一次的成像会议不等。
- 在所需的实验期结束时，使用植入的R.MIW对动物实施安乐死，使用异氟醚的深度麻醉，然后进行宫颈脱位。如果需要，解剖感兴趣的器官以进行进一步的 离体 分析。
- 或者，保持动物存活下来，以便将来 进行体内 分析。在这种情况下，通过用弹簧剪刀切割R.MIW来取下固定R.MIW的袋子缝合线，并使用钝镊子小心地将窗环从鼠标皮肤上拆下。清理以前固定窗户的皮肤边缘，然后进行简单的连续缝合（可吸收材料，如聚乙醇酸）。
- 一旦皮肤闭合，用两个方形结（4次投掷）将开始和结束的缝合线绑起来。为了尽量减少组织缺血，结应足够松弛，以使血液在皮肤边缘流动。用聚维酮碘消毒伤口，以防止炎症并促进皮肤愈合。
图 3：纵向 IVM 工作流程。 （A）典型多日病媒综合防治实验的示意图。（B）成年乳腺内肿瘤致瘤区域的成像。在每次成像会话之前，低分辨率的概述图块扫描（顶部面板）可以促进在随后的成像日内识别感兴趣的区域。胶原I模式（二次谐波产生，洋红色），组织结构和具有荧光蛋白的差异标记细胞的模式（以绿色，黄色和红色表示）可用于追溯相同的组织区域。比例尺表示 1 mm（概览平铺扫描）和 100 μm（底部面板）。（C） R26-五彩纸屑 报告器结构示意图。在他莫昔芬诱导的Cre-重组时，五彩纸屑构建随机重组，导致四种荧光团（nGFP，YFP，RFP或mCFP）之一的表达。 请点击此处查看此图的大图。
5. 在两次成像之间打开和关闭 R.MIW 的盖子
- 使用无菌手套保持无菌状态，并对所有将与鼠标接触的物品进行消毒。手术前高压灭菌手术工具（详见步骤2）。
- 打开加热垫，用无菌悬垂覆盖垫子，并使用3%异氟醚/ O2 混合物在诱导室中麻醉小鼠。通过进行爪子戒断反射试验来验证足够的麻醉。
- 将小鼠从诱导室转移到麻醉鼻罩中，并将异氟醚水平降低至1.5%-2%异氟醚/ O2 混合物。
- 将薄镊子的尖端穿过盖子臂上的孔，然后逆时针扭转盖子以拧松盖子。如果需要，在窗户上涂抹一些预热的无菌PBS（37°C），以促进盖子的松动。
- 将R.MIW的盖子放在装有无菌PBS的无菌培养皿中，直到进一步使用。用半水和80%乙醇清洁盖子的盖玻片。将盖子放在无菌PBS中，直到进一步使用。
- 通过在组织表面添加一些无菌PBS滴剂来防止暴露的组织变干。
- 在暴露的组织上施加或注射任何物质或感兴趣的细胞，可以使用最大体积为50μL。等待几分钟，直到液体被组织吸收。或者，可以使用无菌钝镊子操纵或重新定位组织，以优化特定ROI的成像条件。
- 将凡士林涂抹在R.MIW的内缘，确保避免下面的组织。按照步骤3.9中所述将盖子放入R.MIW框架中，将薄镊子的尖端穿过盖子臂上的孔，然后顺时针旋转盖子（约5°）来拧紧盖子。
Representative Results
为了研究乳腺不同发育阶段乳腺上皮细胞的增殖动力学，进行了所描述的方案。图 1描述了R.MIW的设计， 图2总结了植入R.MIW的过程。R.MIW通过手术植入乳腺和皮肤之间。缝合线用于固定在窗环内并防止小鼠拉动缝合线（图2）。固定R.MIW的缝合线由不可吸收的丝绸制成，具有低过敏性，质地柔软，易于处理。R.MIW环由钛制成，钛是最具生物相容性的材料之一，在植入后不会促进炎症或坏死21。如果遵循无菌条件并且缝合线执行良好，则R.MIW乳腺植入术后并发症的风险较低。此外，与腹部成像窗口植入22不同，R.MIW植入不是小鼠生存的限制因素，因为乳腺不是重要器官，并且允许每日成像达到伦理方案中规定的极限。限制窗口植入持续时间的唯一因素是皮肤的稳态周转，这最终将导致缝合线在4-6周后脱落。因此，定期检查缝合线的稳定性非常重要。如果需要，可以在无菌条件下（如步骤3.5 - 3.8所述）移除缝合线并用新的钱包线缝合线替换，以确保窗口稳定性。
使用多日成像方法时，一个主要挑战是连续几天的投资回报率。为此，在选择投资回报率之前，可以包括快速概览扫描（图3B）。多个组织特征可用于追溯组织的相同区域，包括胶原网络信号（通过二次谐波产生可视化），组织结构以及用染料或荧光蛋白差异或随机标记的细胞的局部模式（图3B）。在这个具有代表性的例子中，将R.MIW植入MMTV-PyMT的第4乳腺上;R26-CreERT2het;R26-五彩纸屑雌性小鼠在可触及的肿瘤形成开始时。随后，通过注射1.5mg他莫昔芬诱导随机重组，导致一些细胞中五彩纸屑构建体的重组（图3C）。对重组的肿瘤细胞进行20天的随访（图3B，C）。如果连续几天对乳腺的同一区域进行成像，则可以在无菌环境中打开窗口（如步骤5.1中所述）以进一步清除，并重新定位组织以改善可见性和图像采集（图3A）。
使用这种方法，在青春期发育的乳腺在单细胞水平上进行跟踪。通过R.MIW重复的IVM是使用 R26-CreERT2het进行的;R26-mTmG在4-6周龄之间的雌性小鼠，其中所有细胞都用膜tdTomato标记（图4A）23。向小鼠注射低剂量的他莫昔芬（0.2mg / 25g体重），导致mTmG构建体的零星重组，导致所有组织中某些细胞（包括乳腺）从红色变为绿色（图4B）。在多天内重新访问相同的ROI，以可视化乳腺内的形态变化，包括细胞分辨率下的导管伸长和导管分支（图4C）。重要的是，随机细胞标记和多日IVM的这种组合还允许可视化导管环境的动态变化，例如细长和分支导管周围基质中单个细胞的动力学（图4D）以及腹股沟淋巴结内的细胞动力学（图4E）。
图4：青春期分支形态发生的多日间IVM。在4-6周龄的R26-mTmG小鼠中注射低剂量的他莫昔芬，导致R26-mTmG等位基因的Cre介导重组，并在第1，3和第5天成像以跟踪发育中的乳腺的动态变化。（B）R26-mTmG小鼠结构的示意图，其在非重组条件下导致膜tdTomato（mT）的普遍表达。在Cre介导的重组时，mT切换为膜eGFP（mG）表达。（C） 在 R26-CreERT2 中通过 R.MIW 成像的多日内伸长和分支乳腺导管的 3D 渲染;R26-mTmG雌性小鼠在6周龄。（D） 分支尖端（顶部面板）和伸长分支（底部面板）的单个 Z 平面图像。mT用红色表示，mG用青色表示，比例尺表示100μm（A和B）。基质中的单个细胞由白色星号突出显示。请注意，手动增加信号强度以突出显示基质中的单个细胞，导致乳腺上皮细胞略微过度暴露。（E）R26-CreERT2腹股沟淋巴结的代表性图像;通过 R.MIW 成像的 R26-mTmG 母鼠标，显示概述磁贴扫描（左面板）、单个 Z 平面的缩放图像（右面板）（顶部）和 3D 渲染（底部）。二次谐波生成（胶原 I）以绿色显示，mT 以红色显示，mG 以青色显示。比例尺表示 500 μm（概览切片扫描）和 100 μm（缩放图像）。图面板C和D是从Messal等人2修改而来的。请点击此处查看此图的大图。
同样，在成年乳腺中，所提出的R.MIW方法允许在多天内以不折不扣的可见性可视化相同的导管结构。即使使用亮度较低的荧光报告基因模型24，例如 Cdh1-mCFP （Ecadherin-mCFP）小鼠模型，也允许在细胞分辨率下可视化导管稳定性和细微的形态变化（图5）。请注意，组织重新定位后，第3天和第5天之间的能见度显着提高（图5）。
图5：成年乳腺的多日成像。 成年雌性 Cdh1-mCFP （青色，标记Ecadherin阳性腔细胞表达）小鼠连续多天的乳腺导管结构的3D渲染图像。胶原I模式（二次谐波产生，洋红色）用于追溯相同的ROI，并使用 Cdh1-mCFP 信号来标记导管（腔）细胞。请注意，通过打开R.MIW盖子和重新定位组织，第3天后的能见度得到了改善。比例尺代表 100 μm。 请点击此处查看此图的放大版本。
为了在单细胞水平上评估乳腺上皮细胞在激素周期中的增殖异质性，使用了光转换Kikume Green-Red（KikGR）报告小鼠模型25，26 ，其具有无处不在的KikGR蛋白表达。KikGR是一种明亮的荧光基团，在暴露于紫光时会发生绿到红的转化，红/绿比可以用作细胞2 增殖活性的代理（图6A，B）。使用R.MIW方法，我们在几天内跟踪成年乳腺导管树内的相同细胞，并在整个导管树中发现以前未预料到的增殖异质性（图6C）。高和低增殖细胞均匀分布在不同的转化区域（图6C，D）。引人注目的是，在局部水平上，相邻细胞的红/绿比例显示出很大的差异（图6C，D）。在光转换后10天定量不同细胞的红/绿比例（作为其增殖活性的代理），揭示了同一导管微环境中某些细胞的高度可变稀释率（图6E）。总之，这些数据揭示了成年乳腺内显着的局部增殖异质性，同时揭示了全球统一的周转率。
图6：使用KikGR小鼠模型在成年乳腺中增殖异质性的纵向IVM。 （A）在暴露于紫光之前和之后的第0天对KikGR小鼠进行成像。在转换后的第2，6和10天重复成像会话。（B）KikGR乳腺上皮细胞增殖（左图）和无增殖（右图）作为时间函数的假想结果的示意图。（C）在10天内通过R.MIW对乳腺的同一区域进行成像。较小的区域在第0天进行光转换，并且随着时间的推移显示出相似的Kikume红色信号的稀释率，表明整个上皮的周转率相等。（D）图C中指示区域的缩放图像（单个Z平面）在光转换后6天和10天在细胞水平上显示出增殖异质性。比例尺表示 100 μm（面板 C）和 10 μm（面板 D）。（E）量化三个光转换区域中随机选择的细胞（n = 48个细胞）的红/绿比例。高红/绿比表示低稀释率和低增殖活性，而低红/绿比表示高稀释率和增殖。图面板C-E已从Messal等人2中修改而 来。 请点击此处查看此图的大图。
Discussion
R.MIW允许在其天然和最小破坏环境中对健康和患病的乳腺进行纵向成像，并允许在不同发育阶段重复观察乳腺。R.MIW设计允许在实验过程中的任何时间点打开窗口。对目标组织的长期视觉访问可能受到阻碍，例如，由于盖玻片上细胞碎片的积累。在这种情况下，可以在成像之前或之后立即打开R.MIW，以清洁整个可见组织区域和盖子。可拆卸的盖子还允许操作组织以及物质的局部应用，例如特定的抑制剂和疗法，标记染料或感兴趣的特定细胞类型。
该方法克服了前面描述的乳腺皮瓣程序4，7，8，13的局限性，这些程序仅限于一个成像过程，并且可以可视化诸如分支形态发生（图5），稳态组织更新（图6）或细胞水平上的肿瘤生长等过程（图3B).然而，与此同时，R.MIW允许在成像会话之间对组织进行局部操作，与先前发布的MIW3，18和所有其他成像窗口20，22相比，R.MIW是R.MIW的重要资产。打开R.MIW时，重要的是要始终保持无菌状态，以防止任何感染源。在无菌环境中打开R.MIW的能力允许在每次成像之前优化成像条件，从而大大改善了对感兴趣组织的长期视觉访问。具体而言，在嵌入富含脂肪细胞的基质中的乳腺中，这具有很大的价值。此外，可更换的盖子可以独特地实现治疗剂，不同细胞类型，标记染料，图像引导的显微切割或组织的任何其他局部操作的局部施用，而无需终止IVM实验。例如，为了研究肿瘤的发生，只要可以通过R.MIW环获得该ROI，就可以在确定的IVM时间点和精确的乳腺位置将特定的癌细胞群直接注射到导管树或基质中。为了研究肿瘤进展，可以在IVM会话期间对特定的癌细胞群（在特定位置，特定微环境中或具有特定行为）进行光标记，然后在打开R.MIW后使用荧光解剖显微镜进行微解剖。分离的细胞可以进一步处理用于下游分析，例如（单细胞）mRNA测序。通过使用这种方法，可以将体内细胞行为与分子表达谱相结合。R.MIW实现的局部药物给药的优势允许在治疗前和治疗后直接对组织进行成像。从成像盒中取出小鼠并随后在打开R.MIW盖子后进行局部药物给药所需的间隔可以在几分钟内完成，这允许立即相位捕获速效药物。
我们表明，通过R.MIW的乳腺IVM与许多不同的荧光报告小鼠模型兼容。富含脂肪的环境很难成像，因此建议使用明亮的荧光基团。然而，如图所示，在最佳成像条件下，即使是不太亮的荧光团（如mCFP）也可以通过R.MIW可视化。不可避免地，脂肪垫将排除更深的导管结构的成像，并将成像限制在更浅的导管。在每个IVM实验开始时的低分辨率概述图像将有助于识别感兴趣的导管结构，这些结构对于高分辨率成像来说足够浅。局部组织操作、结缔组织切除或打开 R.MIW 后重新定位脂肪组织可以针对被脂肪组织覆盖的特定 ROI 优化 IVM。与之前的所有窗口设计相比，这是一个重要的优势，以前的窗口设计不允许执行这些操作，并且需要完全删除窗口本身。具体而言，对于腹股沟淋巴结的可视化，建议轻轻地去除上覆的脂肪组织，这减少了光散射并实现了高分辨率成像。在操作组织时，始终保持无菌状态并防止出血或对组织的严重损伤，因为它们可能会影响IVM实验期间正在研究的过程。
R.MIW由钛制成，钛是一种在临床实践中通常用于替代硬组织（如关节或骨板）的材料。钛与钢窗相比有几个优点，包括其轻质和惰性特性21。最近，其他几种材料被用于生成新的成像窗口类型，包括柔性硅窗口20。与R.MIW相比，柔性窗口不需要任何缝合线即可植入，几乎适用于任何解剖位置，特别是在柔软和脆弱组织的情况下。硅窗口对动物运动的影响最小，因为它们具有轻质和可变形的性质，可能更适合研究快速组织扩张和生长的实验20。与钛版本相比的另一个优点是硅窗口与其他成像方式兼容，包括磁共振成像20，27。但是，重要的是要记住，物镜针对0.17毫米玻璃盖玻片进行了优化。此外，乳腺组织容易受到呼吸运动的影响，使用柔性窗口很难限制呼吸运动，尤其是在使用倒置显微镜时。通过R.MIW设计和R.MIW在成像盒嵌体中的固定，可以最大限度地减少呼吸伪影。因此，使用建议的R.MIW设置获取的图像不会因呼吸伪影而失真。然而，可以发生组织定位的轻微漂移，这通常是渐进的，并且可以通过使用采集后运动校正软件28来校正。随着IVM技术2，20的工具箱的增加，每个实验的具体要求最终将确定感兴趣的组织的 体内 可视化的最佳方式。不同的窗口设计具有不同的优缺点，并且根据研究问题，可用的显微镜设置，所需的空间和时间分辨率以及研究过程的总时间跨度，需要确定最佳方法。
总之，R.MIW有助于在多天至几周内对乳腺发育，体内平衡和疾病期间的细胞动力学进行高分辨率表征。
Disclosures
作者无事可披露
Acknowledgments
这项工作得到了法兰德斯研究基金会（博士资助基础研究11L7222N给M.C.），勃林格殷格翰基金会（博士奖学金给C.L.G.J.S），EMBO博士后奖学金（授予ALTF 1035-2020给C.L.G.J.S.）和约瑟夫·施泰纳博士奖（授予J.v.R）。支持。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.9% NaCl | BD | 306573 | Other brands available |
| 10 mm round coverglass | Fisher scientific | 10696365 | Other brands available |
| 5-0 braided silk suturs | Ethicon | W580 | |
| 80% Ethanol | homemade | NA | |
| Anesthesia induction box | Kentscientific | VetFlo-MSEKIT | |
| Buprenorphine (Vetergesic®) | Ecuphar | NA | |
| Cotton tips (sterile) | Fisher scientific | 13113743 | Other brands available |
| Cyanoacrylate adhesive | Loctite | NA | Other brands available |
| Eye ointment | Duratears | NA | |
| Flexible butterfly needle | Greiner Bio-One | 450120 | Other brands available |
| Graefe forceps (blunt) | Fine Science Tools | 11051-10 | |
| Heating pad | Kentscientific | RightTemp Jr. | Other brands available |
| Imaging box | Custom made | NA | |
| Infuse nutrient mixture | Braun | Nutriflex special 70/240 | |
| Insulin syringes | BD | 324911 | Other brands available |
| Inverted multi-photon microscope with automated stage | Leica Microsystems | NA | |
| Isoflurane vaporizer | Kentscientific | VetFlo-1231K | |
| Needle holder | Fine Science Tools | 12510-14 | |
| Parafilm | Sigma-Aldrich | P7793 | semi-transparent tape |
| Paper tape tesa | Tesa | NA | |
| Petroleum Jelly | Vaseline | NA | |
| Razor blades | Fisher scientific | 11904325 | Other brands available |
| Silicon tubing | Solutions Elastomeres | NA | Any houseware |
| Spring scissors (small) | Fine Science Tools | 15018-10 | |
| Sterile PBS | ThermoFisher Scientific | 10010023 | |
| Syringe (10 ml) | BD | 305482 | Other brands available |
| Thin forceps | Fine Science Tools | 11413-11 | |
| Titanium lid for mammary imaging window | Custom made | NA | |
| Titanium mammary imaging window | Custom made | NA | |
| Wooden sticks toothpicks | Fisher scientific | NC1678836 | Other brands available |
References
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