Waiting
Processando Login

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biology
Click here for the English version

Biology

Langsgående intravital mikroskopi ved hjælp af et brystbilledvindue med udskifteligt låg

Published: January 20, 2022 doi: 10.3791/63326
Automatic Translation
1,2, 1,2, 3, 1,2
1Center for Cancer Biology, VIB (BE), 2Department of Oncology, KU Leuven (BE), 3Netherlands Cancer Institute, Department of Molecular Pathology, Oncode Institute (NL)

Summary

Denne protokol beskriver et nyt brystbilledvindue med et udskifteligt låg (R.MIW). Intravital mikroskopi efter implantation af R.MIW muliggør langsgående og flerdages billeddannelse af den sunde og syge brystkirtel med en cellulær opløsning i de forskellige udviklingsstadier.

Abstract

Brystkirtlens forgrenede struktur er meget dynamisk og gennemgår flere faser af vækst og ombygning efter fødslen. Intravital mikroskopi i kombination med hudklapkirurgi eller implantation af billeddannelsesvinduer er blevet brugt til at studere dynamikken i den sunde brystkirtel på forskellige udviklingsstadier. De fleste brystbilleddannelsesteknologier er begrænset til en tidsramme på timer til dage, mens størstedelen af brystkirtelombygningsprocesser forekommer i tidsrammer fra dage til uger. For at studere brystkirtel remodeling kræves metoder, der giver optisk adgang til vævet af interesse for længere tidsrammer. Her beskrives en forbedret version af titanium brystbilleddannelsesvinduet med et udskifteligt låg (R.MIW), der muliggør højopløsningsbilleddannelse af brystkirtlen med en cellulær opløsning i op til flere uger. Det er vigtigt, at R.MIW giver vævsadgang over hele varigheden af det intravitale billeddannelseseksperiment og derfor kan bruges til lokal vævsmanipulation, mærkning, lægemiddeladministration eller billedstyret mikrodissektion. Samlet set muliggør R.MIW karakterisering i høj opløsning af den cellulære dynamik under brystkirteludvikling, homeostase og sygdom.

Introduction

Brystepitelet er et unikt sekretorisk organ til stede hos pattedyr, som producerer og udskiller mælk for at nære afkom. Gennem hele livet gennemgår brystkirtlen flere udviklings- og vækstrunder, som ledsages af strukturelle og funktionelle ændringer i vævet1. Afhængigt af udviklingsstadiet er de celletyper, der bidrager til vævsombygning, forskellige såvel som placeringen i duktaltræet.

Multiphoton intravital mikroskopi (IVM) tillader undersøgelse af brystcelledynamik in vivo i den oprindelige og minimalt forstyrrede indstilling 2,3,4. For at opnå visuel adgang til brystkirtlen er der offentliggjort flere midlertidige ex vivo- eller hudklapbilleddannelsesteknikker i forskellige stadier af brystkirteludvikling, herunder pubertet 4,5,6,7, voksenalder 2,8, amning 9,10,11,12 og tumordynamik 13,14 ,15. Selvom disse teknikker resulterer i høj rumligt og tidsmæssigt opløst billeddannelse af brystcelledynamik, er tidsrammen begrænset til timer, mens de fleste brystkirtelombygningsprocesser tager dage til uger. Derfor kræves metoder, der giver optisk adgang til vævet af interesse i længere tidsrammer. I årenes løb er der udviklet flere permanente billeddannelsesvinduer til brysttumorbilleddannelse 15,16,17,18, herunder et titanium brystbilleddannelsesvindue (MIW)2,3,19. Selvom det var meget nyttigt at studere brysttumorvækst, forblev visualisering af den sunde brystkirtelstruktur begrænset til et par dage. For nylig blev der udviklet et fleksibelt siliciumbilleddannelsesvindue, som muliggør visualisering af pubertets brystkirtlen over flere uger20. Brystkirtlen er imidlertid indlejret i en adipocytrig fedtpude, hvilket fører til omfattende lysspredning og som følge heraf begrænset synlighed af brystkanalstrukturerne. Derfor kræves der til enhver tid overlegne billeddannelsesbetingelser for at visualisere vævsdynamik over længere perioder i brystkirtlen. Hverken den klassiske MIW eller det fleksible siliciumvindue giver mulighed for vævsmanipulation eller optimering af fysisk vævsplacering før billeddannelse, da vinduet danner et lukket system efter operation og implantation. Som følge heraf vil optimal optisk adgang til det underliggende brystvæv sandsynligvis blive udelukket over længere perioder. I modsætning hertil giver hudklapteknikken mulighed for optimering og omplacering af vævet under billeddannelsessessionen, og en hudklap kan gentages flere gange2. Gentagne billeddannelsessessioner gennem en hudklap er dog kun mulige, når der er afsat tilstrækkelig tid (mindst 7 dage) mellem operationer for at muliggøre genopretning af huden og derfor er mest velegnet til at studere processer på længere tidsskalaer. Desuden er det tilrådeligt ikke at udføre denne procedure mange gange på grund af dens invasive karakter og stor risiko for infektioner og ardannelse ved sårlukning.

For at overvinde disse begrænsninger, dvs. for at sikre optimale billeddannelsesforhold i en længere periode ved en høj frekvens og samtidig tillade vævsmanipulation, blev en forbedret titaniumversion af MIW med et udskifteligt låg (R.MIW) designet til at visualisere den sunde og syge brystkirtel over flere dage til uge2 (figur 1A, B). R.MIW blev specialdesignet til at give optimal vævsadgang, hvilket muliggør direkte vævsmanipulation over hele IVM-eksperimentets varighed og derved muliggør visualisering af brystkirtlen på det rigtige tidspunkt og sted over længere perioder. Når den er lukket, danner R.MIW et lufttæt system, der kan sammenlignes med den klassiske MIW (figur 1C). Når R.MIW åbnes under aseptiske forhold, tillader den lokal vævsmanipulation for at forbedre optisk adgang og muliggør også lokal administration af stoffer, såsom vejhæmmere eller agonister, injektion af forskellige celletyper af interesse, såsom kræftcelle- eller immuncellepopulationer eller tilsætning af vævsmærkningsfarvestoffer. Låget kan åbnes når som helst mellem billeddannelsessessioner uden at forårsage skade på det underliggende væv.

Figure 1
Figur 1: Design af brystfotovinduet med udskifteligt låg. (A) Set fra oven og til siden af det udskiftelige låg på brystkassen med et 10 mm dækglas limet på ringen. (B) Set fra oven og til siden af brystbilledet, som består af en ydre ring og en indre ring med en rille imellem for at sikre vinduet i musens hud ved hjælp af en pungstrengssutur. Den ydre ring har en lille rille, der passer til lågets fire fremspring (arme). (C) Tegneserie og billeder, der viser lågets åbnings- og lukkemekanismer. De skrå projektioner sørger for, at låget er fastgjort inde i vinduesrammen. Denne figur er blevet ændret fra Messal et al. 2. Klik her for at se en større version af denne figur.

Denne protokol beskriver design- og implantationsproceduren for R.MIW samt en langsgående IVM-strategi for at revidere de samme brystkanaler og deres visualisering ved en cellulær opløsning. R.MIW tillader følgende celledelinger og morfologiske ændringer under forskellige udviklingsfaser af brystkirtlen i forskellige fluorescerende reportermusmodeller. Samlet set letter R.MIW højopløsningskarakterisering af den cellulære dynamik under brystkirteludvikling, homeostase og sygdom.

Protocol

Alle procedurer beskrevet i dette papir blev udført i overensstemmelse med retningslinjerne fra IACUC og KU Leuven og blev udført i forbindelse med godkendt projektansøgning P160/2020. Før du udfører denne protokol, skal du gennemgå analgesistrategien med den institutionelle dyrlæge og administrere præ- og postoperativ analgesi i henhold til institutionelle retningslinjer.

1. Forberedelse af R.MIW (anslået timing: 2 timer)

BEMÆRK: Til konstruktion af R.MIW er det tilrådeligt at finde en lokal producent, der har specialiseret sig i at arbejde med hårde materialer som titanium, da dette kræver specialværktøjer og ekspertise. Værksteder med speciale i design og fremstilling af titaniumproteser har normalt maskiner og ekspertise til at producere R.MIW-delene.

  1. Anbring låget på R.MIW på en steril overflade med ydersiden af låget opad (og lågets arme skrånende nedad; Figur 1A).
  2. Påfør cyanoacrylatklæbende lim rundt om hele lågets kant, og læg forsigtigt en 10 mm rund glasdæksler oven på låget.
    BEMÆRK: Forbered altid et ekstra låg med et glasdæksel som backup under den kirurgiske procedure.
  3. Brug en steril træpind til at placere glasdækslet, og påfør en vis kraft for at skubbe den ned for at sikre en lufttæt tætning mellem glasdækslet og lågets ramme. Sørg for, at hullerne i lågets arme ikke er dækket af glasset.
  4. Desinficer lågene og R.MIW ved at nedsænke i 80% ethanol i mindst 30 minutter i en lukket petriskål.
    BEMÆRK: Efterlad ikke lågene længere end 1 time i 80% ethanol for at undgå opløsning af cyanoacrylatklæbelimen.
  5. Fjern den overskydende cyanoacrylatklæbende lim fra glasdækslet ved hjælp af en bomuldsspids gennemblødt i acetone.
  6. Opbevar lågene og R.MIW i et sterilt miljø indtil videre brug.
    BEMÆRK: R.MIW-rammen og lågene kan opbevares i et sterilt rør eller en pose i højst 1 uge. Når du genoptager eksperimentet, skal du altid undersøge, om glasdækslet stadig er korrekt fastgjort til låget, inden du fortsætter med protokollen.

2. Forberedelse til operation (estimeret tidspunkt: 15 min)

BEMÆRK: Til R.MIW-implantationsproceduren kan hunmus (>3,5 uger gamle) af enhver stamme anvendes.

  1. Oprethold sterilitet ved hjælp af sterile handsker, og steriliser alle genstande, der kommer i kontakt med musen. Vask kirurgisk værktøj med vand og mild sæbe, lufttørre, pakk ind i aluminiumsfolie uden udsatte hjørner eller kanter, og steriliser ved hjælp af en autoklave i en cyklus på 20 minutter ved 120 ° C før operationen.
  2. Forbered en steril kirurgisk platform og steriliser overfladerne med 80% ethanol.
    BEMÆRK: For at sikre sterilitet kan operationen udføres i et flowskab.
  3. Tænd for varmepuden og dæk måtten med en steril drapering. Sæt de sterile instrumenter på den sterile drapering, og anbring R.MIW og mindst to glasbeklædte låg i steril fosfatbufferet saltvand (PBS) i en petriskål (luk låget for at undgå ekstern forurening).
  4. Bedøv musen i et induktionskammer ved hjælp af en 3% isofluran / O2-blanding . Sørg for, at dyret er afslappet nok til let at blive manipuleret og overført til næsemasken uden kamp.
  5. Overfør musen fra induktionskammeret til en anæstesi næsemaske og reducer isofluranniveauet til 1,5% - 2% isofluran / O2-blanding . Bekræft fuld anæstesi ved at udføre en pote tilbagetrækningstest.
  6. For at udføre poteudtagningstesten skal du klemme dyrepoten fast ved hjælp af negle eller stump endetang. I mangel af muskelrefleks skal du betragte dyret som bevidstløst og fortsætte med kirurgisk forberedelse. Udfør denne test før dyremanipulation og gentag regelmæssigt under bedøvelses- og kirurgiske procedurer for at bekræfte anæstesi.
  7. Påfør øjensalve for at forhindre dehydrering af hornhinden.
  8. Barber området omkring den 4. brystkirtel ved hjælp af et barberblad (figur 2A). Brug den 4. brystvorte som et vartegn. Fjern løse hår ved hjælp af klæbebånd.
    BEMÆRK: Alternativt kan hårfjerningscreme bruges til at fjerne hårene.
  9. Desinficer den udsatte hud med 80% ethanol eller povidon-jod, og placer musen i det sterile kirurgiske område på ryggen med snuden i en anæstesinæsemaske ved hjælp af 1,5% isofluran / O2-blanding .
  10. Fastgør musens for- og bagben ved hjælp af papirtape.
    BEMÆRK: Lad den bedøvede og genoprettende mus på varmepuden så meget som muligt under og efter operationen.
  11. Brug en forskåret steril kirurgisk drapering eller gasbind til at dække musen, mens du forlader det kirurgiske område udsat.

3. R.MIW implantation (anslået timing: 30 min)

  1. Kontroller, om dyret er tilstrækkeligt bedøvet ved at udføre en poteudtagningstest. Løft forsigtigt huden ved hjælp af en fin Graefe-tang og lav et 10-15 mm diagonalt snit ved hjælp af en lille fjedersaks i huden oven på den 4. brystfedtpude ved hjælp af 4. brystvorte som orienteringspunkt (figur 2A). Sørg for ikke at skære eller beskadige peritoneum eller brystkirtlen.
  2. Definer interesseområdet (ROI) baseret på makroskopiske træk ved brystvævet, herunder placeringen af lymfeknuden eller en tumorlæsion, og prøv at holde ROI central med hensyn til snittet.
  3. Adskil huden fra brystfedtpuden og de underliggende vævslag ved hjælp af stump dissektion på op til 5-8 mm hele vejen rundt om snitlinjen for at skabe en lomme, der passer til R.MIW-rammen (figur 2BI).
  4. Tag R.MIW op ved hjælp af sterile pincet, og test, om snittet er stort nok til at indsætte vinduet. Hvis det er nødvendigt, skal du forstørre snittet lidt, indtil R.MIW passer ind.
  5. Fjern R.MIW og placer en pungstrengssutur rundt om snittet ved hjælp af en 5-0 silkesutur (flettet, ikke-resorberbar). Placer suturen 1-2 mm fra kanten af snittet udefra til indersiden af huden, startende fra den kaudale ende af snittet.
  6. Bevæg dig ca. 5 mm op langs snittet, og før suturtråden gennem huden indefra og udefra. Gentag denne procedure langs kanten af snittet, hvorved der skabes en cirkulær sutur bestående af 5-6 sløjfer (figur 2BII). Suturtrådens endelige udgang skal placeres ca. 2-5 mm væk fra den første indgang.
    BEMÆRK: Pas på ikke at placere suturen for tæt på kanten af snittet, da dette øger risikoen for hudrivning. Placering af suturen for langt fra kanten af snittet øger risikoen for infektion mellem overskydende hud og rillen på R.MIW.
  7. Monter R.MIW inde i snittet, og brug Graefe-tangen til forsigtigt at placere huden i rillen på R.MIW. Sørg for at lade suturens løkker stå udenfor.
  8. Træk i løkkerne på pungstrengssuturen, og stram suturen i R.MIW's rille ved forsigtigt at trække i begge ender af suturen (figur 2BIII). Bind af med kirurgiske knuder og skær overskydende tråd væk.
  9. Påfør vaselin på den indre kant af R.MIW ved hjælp af et tandstikker, mens du sørger for at undgå det underliggende væv. Skub forsigtigt vinduesrammen nedad med sterile pincet eller to fingerspidser, og placer låget i R.MIW-rammen (figur 1B). Dette vil undgå et volumen luft mellem brystkirtelvævet og R.MIW-låget.
  10. Anbring spidserne af tynde tang gennem hullerne i lågets arme, og stram låget ved at dreje låget med uret (ca. 5°) (figur 1C og figur 2BIV).
  11. Hvis der er noget luft tilbage efter stramning af R.MIW-låget, skal du bruge en steril insulinnål til at fjerne overskydende luft. Før nålen gennem huden ind i hulrummet mellem brystvævet og låget, og træk langsomt stemplet ud og derved skaber et vakuum mellem brystkirtelvævet og R.MIW-låget.
  12. Administration, postkirurgi, analgesi såsom buprenorphin (0,1 mg/kg fortyndet i steril 0,9% NaCl) ved subkutan injektion. Gentag subkutan injektion med buprenorphin 8 timer og 16 timer efter operationen.
  13. Sæt musen tilbage i buret for at komme sig og overvåge nøje, indtil den er helt vågen, eller fortsæt med trin 4 for øjeblikkelig billeddannelse.
  14. På dette postkirurgiske stadium skal du overvåge musene nøje for tegn på ubehag eller komplikationer baseret på vitale parametre, såsom åndedræt, reaktivitet, adfærd, kropsholdning og kropsvægt. Overvåg huden omkring vinduet omhyggeligt for tegn på betændelse og nekrose. Hvis der ikke opstår komplikationer, vil R.MIW give mulighed for gentagne IVM-sessioner over flere uger efter implantation.

Figure 2
Figur 2: Oversigt over den kirurgiske procedure og vinduesimplantation. (A) Et diagonalt snit foretages nær den 4. brystvorte af en kvindelig mus, og huden og det underliggende væv afbrydes ved stump dissektion. (B) Fedtpudens inguinale lymfeknude og form kan bruges til den rigtige orientering af vævet (I). En pungstrengssutur placeres i huden omkring snittet (II), og efter montering i vinduesrammen strammes suturen i rillen for at sikre vinduesrammen og sikres ved kirurgiske knuder (III). Det sidste trin er indsættelse og låsning af låget i vinduesrammen (IV). Klik her for at se en større version af denne figur.

4. Gentagen intravital mikroskopi gennem R.MIW

BEMÆRK: Den gentagne IVM-strategi, der er beskrevet her, blev optimeret til et omvendt multifotonkonfokalsystem udstyret med et motoriseret trin og et mørkt klimakammer ved 35,8 ° C.

  1. Bedøv musen i et induktionskammer ved hjælp af en 3% isofluran / O2-blanding . Bevidsthedstab kontrolleres ved at udføre en poteudtagningstest (beskrevet i trin 2.6). Påfør øjensalve for at forhindre dehydrering af hornhinden under billeddannelsessessionen.
  2. Undersøg tilstanden af R.MIW-rammen og låget, herunder suturernes stabilitet eller enhver potentiel skade på låget. I tilfælde af beskadigelse af låget kan låget udskiftes som beskrevet i trin 5.
  3. Overfør musen til en forvarmet (37 °C), specialfremstillet billedkasse (figur 3A), og placer musen med hovedet i næsekeglen. Billeddannelsesboksen består af en ramme, der passer ind i mikroskopets automatiserede fase. Rammen er designet til at holde et specialfremstillet indlæg med et hul diameteren af R.MIW (figur 3A).
  4. Et indløb med en næsekegle er forbundet til forsiden af kassen og fastgjort til en isofluranfordamperstation ved hjælp af 2% -3% isofluran / O2-blanding. En stikkontakt er forbundet til en bedøvelsesenhed for at sikre cirkulation og for at forhindre ophobning af isofluran i kassen. Billedkassen kan lukkes ved hjælp af et gennemsigtigt låg.
  5. Placer musen på indlægget på en sådan måde, at R.MIW falder i hullet i billedboksindlægget (figur 3A). Påfør parafilm og papirtape over bagsiden af musen for at stabilisere musen og reducere vævsbevægelse på grund af åndedræt.
  6. Luk billeddannelsesboksen med låget, og indsæt billeddannelsesboksen i mikroskopets fase.
  7. Reducer isoflurandosis gradvist i løbet af billeddannelsessessionen for at opretholde en stabil, men overfladisk anæstesi (typisk mellem 1,5% -0,8% isofluran / O2-blanding ).
  8. Giv korrekt ernæring under billeddannelse som beskrevet nedenfor.
    1. Til billeddannelsessessioner <3 timer injiceres musen subkutant med 200-300 μL steril PBS til hydrering.
    2. For billedbehandlingssessioner >3 timer skal du følge nedenstående trin.
      1. Til langsigtet billeddannelse skal du infundere musen med næringsstoffer. Til dette skal du bruge en kommercielt tilgængelig steril infusionsblanding indeholdende aminosyrer og glucose. Placer en fleksibel nål subkutant i musens hals og fastgør den med papirtape.
      2. Fastgør en 10 ml sprøjte med den tilberedte næringsblanding til et fleksibelt siliciumrør, og skub næringsblandingen igennem, indtil den har nået enden af røret.
      3. Tilslut silikonerøret til den fleksible nål. Tag enden af slangen og placer den gennem et af hullerne i billedkassen (indefra og udefra, og lad nålens fastgørelsesside være i kassen).
      4. Injicer 50 μL infusionsopløsning hvert 30. minut.
  9. Fastgør billeddannelsesboksen i mikroskopets fase, og definer interesseområdet ved hjælp af mikroskopets epifluorescensmodus.
  10. Anvend de ønskede mikroskopindstillinger afhængigt af musemodellen (figur 3B). Karstrukturer, kollagenmønstre (visualiseret af anden harmonisk generation) og andre stabile anatomiske strukturer, herunder den inguinale lymfeknude, kan bruges som vartegn. Indskaf billeder ved hjælp af et omvendt multifoton konfokalt mikroskop på en 12-bit dybde og et 25x vandmål ved hjælp af en Z-trinstørrelse fra 1,0 til 4,0 μm (samlet z-stak spænder fra 150 til 800 μm). Anvend følgende standardindstillinger: 1024 x 1024 format, 600 Hz scanningshastighed, tovejstilstand.
  11. Visualiser kollagen I fibre ved at udføre anden harmonisk generation ved hjælp af en excitationsbølgelængde på 860 nm og detektion ved 425-435 nm. Excitations- og detektionsbølgelængder for de forskellige fluoroforer er angivet i tabel 1.

Tabel 1. Klik her for at downloade denne tabel.

  1. Brug spiralfunktionen i billedbehandlingssoftwarenavigatortilstand til at generere en stor oversigtsmosaik for at oprette et referencekort over vævet (figur 3B). Definer ROI'erne i spiraloversigten, definer de øvre og nedre Z-planer for at bestemme Z-stakken. Tryk på Start for at få detaljerede tredimensionelle (xyz) eller firedimensionelle Z-stakke (xyzt) af vævet.
    BEMÆRK: Under hele billeddannelsesforsøget skal musen overvåges nøje. Til lange billeddannelsessessioner anbefales et pulsoximeter og temperatursonde. Musens vejrtrækning skal være regelmæssig og i samme tempo. Hvis musen begynder at vise tegn på gisp, skal mængden af isofluran reduceres.
  2. Ved afslutningen af hver billedsession skal du holde musen på en varmepude, indtil den er helt vågen. Hvis musen viser tegn på ubehag eller nedsat mobilitet, skal du holde buret i længere tid på varmepuden og give næringsgeler i stedet for den almindelige chow.
    BEMÆRK: Mellem billeddannelsessessioner skal musen overvåges nøje for tegn på ubehag såsom nedsat mad- og vandforbrug, hurtig vejrtrækning, nedsat bevægelse, tremor, unormal kropsholdning eller ufærdig pels. I tilfælde af tydelige tegn på ubehag skal du følge institutionelle retningslinjer vedrørende dyrevelfærd og afslutte forsøget, når det humane endepunkt er nået.
  3. Gentag trin 4.1-4.12 for hver gentaget billedbehandling, og brug oversigtsmosaikken til at spore den eller de samme positioner over flere tidspunkter (Figur 3B). Billeddannelsesfrekvensen afhænger af forskningsspørgsmålet og tidspunktet for den studerede proces og varierer typisk fra billeddannelsessessioner to gange om dagen til en gang om ugen.
  4. Ved afslutningen af den ønskede forsøgsperiode aflives dyrene med en implanteret R.MIW ved hjælp af dyb anæstesi med isofluran efterfulgt af cervikal dislokation. Disseker om ønsket de organer, der er af interesse, med henblik på yderligere ex vivo-analyser .
  5. Alternativt kan du holde dyret i live til fremtidige in vivo-analyser . I så fald skal du fjerne posesuturen, der holder R.MIW, ved at klippe den med fjedersaks og forsigtigt løsne vinduesringen fra musehuden ved hjælp af stump tang. Ryd kanterne af huden, der tidligere holdt vinduet, og fortsæt med en simpel kontinuerlig sutur (absorberbart materiale, såsom polyglycolsyre).
  6. Når huden er lukket, skal du binde start- og slutsuturtrådene med to firkantede knuder (4 kast). For at minimere vævsiskæmi skal knuderne være løse nok til at tillade blodgennemstrømning ved hudkanten. Desinficere såret med povidon-jod for at forhindre betændelse og fremme heling af huden.

Figure 3
Figur 3: Langsgående IVM-arbejdsgang. (A) Skematisk skildring af et typisk flerdages IVM-eksperiment. (B) Billeddannelse af en tumorfremkaldende region i den voksne brystkirtel. Før hver billedbehandlingssession kan en oversigts-tilescan med lav opløsning (øverste panel) lette identifikationen af det eller de områder, der er af interesse i løbet af efterfølgende billedbehandlingsdage. Kollagen I-mønsteret (anden harmonisk generation, magenta), vævsstruktur og mønstre af differentielt mærkede celler med fluorescerende proteiner (afbildet i grønt, gult og rødt) kan bruges til at spore det samme vævsområde. Vægtstænger repræsenterer 1 mm (oversigt flisescan) og 100 μm (bundpaneler). (C) Skematisk gengivelse af R26-Confetti reporterkonstruktionen. Ved tamoxifen-induceret Cre-rekombination konstruerer Confetti stokastisk rekombiner, hvilket resulterer i ekspression af en af de fire fluoroforer (nGFP, YFP, RFP eller mCFP). Klik her for at se en større version af denne figur.

5. Åbning og lukning af låget på R.MIW mellem billedbehandlingssessioner

  1. Oprethold sterilitet ved hjælp af sterile handsker, og steriliser alle genstande, der kommer i kontakt med musen. Autoklave kirurgiske værktøjer før operationen (se trin 2 for detaljer).
  2. Tænd varmepuden og dæk måtten med en steril drapering, og bedøv musen i et induktionskammer ved hjælp af en 3% isofluran / O2-blanding . Kontroller tilstrækkelig anæstesi ved at udføre en pote tilbagetrækning refleks test.
  3. Overfør musen fra induktionskammeret til en anæstesi næsemaske og reducer isofluranniveauet til 1,5% -2% isofluran /O2-blanding .
  4. Placer spidserne af tynde tang gennem hullerne i lågets arme og løsn låget ved at dreje låget mod uret. Påfør om nødvendigt noget forvarmet steril PBS (37 °C) på vinduet for at lette løsningen af låget.
  5. Anbring låget på R.MIW i en steril skål med steril PBS indtil videre brug. Rengør lågets dækglas med demi-vand og efterfølgende 80% ethanol. Opbevar låget i steril PBS indtil videre brug.
  6. Undgå, at det eksponerede væv tørrer ud ved at tilsætte nogle dråber steril PBS til vævsoverfladen.
  7. Påfør eller injicer ethvert stof eller celler af interesse på det eksponerede væv, et maksimalt volumen på 50 μL kan anvendes. Vent et par minutter, indtil væsken absorberes af vævet. Alternativt kan vævet manipuleres eller omplaceres ved hjælp af sterile, stumpe tang for at optimere billeddannelsesbetingelserne for specifikke ROI'er.
  8. Påfør vaselin på den indre kant af R.MIW, og sørg for at undgå det underliggende væv. Låget anbringes i R.MIW-rammen som beskrevet i trin 3.9, spidserne af tynde tang anbringes gennem hullerne i lågets arme, og låget strammes ved at dreje låget med uret (ca. 5°).

Representative Results

For at studere den proliferative dynamik af brystepitelceller under de forskellige udviklingsstadier i brystkirtlen blev den beskrevne protokol udført. Designet af R.MIW er afbildet i figur 1, og proceduren for implantering af en R.MIW er opsummeret i figur 2. R.MIW er kirurgisk implanteret mellem brystkirtlen og huden. En sutur bruges til at holde inde i vinduesringen og forhindre musene i at trække i suturerne (figur 2). Suturerne, der holder R.MIW, er lavet af ikke-absorberbar silke, som har allergivenlige egenskaber, en blød tekstur og er let at håndtere. R.MIW-ringen er lavet af titanium, et af de mest biokompatible materialer, der ikke fremmer betændelse eller nekrose efter implantation21. Hvis de aseptiske tilstande følges, og suturerne er godt udført, udgør R.MIW brystkirtelimplantationen en lav risiko for postoperative komplikationer. I modsætning til implantation af abdominalbilleddannelsesvindue 22 er R.MIW-implantation desuden ikke en begrænsende faktor for musens overlevelse, fordi brystkirtlen ikke er et vitalt organ og tillader daglig billeddannelse op til den grænse, der er angivet i den etiske protokol. Den eneste faktor, der begrænser varigheden af vinduesimplantation, er hudens homeostatiske omsætning, hvilket i sidste ende vil føre til, at suturerne falder ud efter 4 - 6 uger. Derfor er det vigtigt regelmæssigt at inspicere suturernes stabilitet. Suturerne kan om ønsket fjernes og erstattes af en ny pungstrengssutur under aseptiske forhold (som beskrevet i trin 3.5 - 3.8) for at sikre vinduesstabilitet.

En stor udfordring ved brug af multiday imaging-tilgangen er at spore et investeringsafkast på på hinanden følgende dage. Til dette formål kan en hurtig oversigtsscanning inkluderes, før du vælger ROI (er) (figur 3B). Flere vævsmærker kan bruges til at spore den samme region af vævet, herunder kollagennetværkssignalet (visualiseret af anden harmonisk generation), vævsstruktur samt lokale mønstre af celler differentielt eller stokastisk mærket med farvestoffer eller fluorescerende proteiner (figur 3B). I dette repræsentative eksempel blev en R.MIW implanteret på den 4. brystkirtel i en MMTV-PyMT; R26-CreERT2het; R26-Confettihet kvindelig mus ved begyndelsen af håndgribelig tumordannelse. Efterfølgende blev stokastisk rekombination induceret ved injektion af 1,5 mg tamoxifen, hvilket resulterede i rekombination af Konfettikonstruktionen i nogle celler (figur 3C). De rekombinerede tumorceller blev fulgt i en periode på 20 dage (figur 3B, C). Hvis billeddannelse af det samme område af brystkirtlen over på hinanden følgende dage er udelukket, kan vinduet åbnes i et aseptisk miljø (som beskrevet i trin 5.1) for yderligere at rydde op og omplacere vævet for at forbedre synligheden og billedoptagelsen (figur 3A).

Ved hjælp af denne metode blev den udviklende brystkirtel under puberteten fulgt på enkeltcelleniveau. Gentagen IVM gennem en R.MIW blev udført ved hjælp af R26-CreERT2het; R26-mTmGhet hunmus mellem 4-6 uger, hvor alle celler er mærket med membran tdTomato (figur 4A)23. Mus blev injiceret med en lav dosis tamoxifen (0,2 mg/ 25 g legemsvægt), hvilket resulterede i sporadisk rekombination af mTmG-konstruktionen, hvilket forårsagede en ændring fra rød til grøn i nogle celler i alle væv, herunder brystkirtlen (figur 4B). De samme RIE'er blev revideret over flere dage for at visualisere morfologiske ændringer i brystkirtlen, herunder duktal forlængelse og duktal forgrening (figur 4C) ved en cellulær opløsning. Det er vigtigt, at denne kombination af stokastisk cellemærkning og flerdages IVM også gør det muligt at visualisere de dynamiske ændringer i det duktale miljø, såsom dynamikken i enkeltceller i stromaet omkring de langstrakte og forgreningskanaler (figur 4D) samt den cellulære dynamik i den inguinale lymfeknude (figur 4E).

Figure 4
Figur 4: Flerdages IVM af pubertal forgreningsmorfogenese. (A) Pubertal R26-CreERT2; R26-mTmG-mus i alderen mellem 4-6 uger blev injiceret med en lav dosis tamoxifen, hvilket førte til cre-medieret rekombination af R26-mTmG-allelen og blev afbildet på dag 1, 3 og 5 for at følge de dynamiske ændringer i udviklingen af brystkirtlen. (B) Skematisk repræsentation af R26-mTmG-musekonstruktionen , som under ikke-rekombinerede forhold resulterer i allestedsnærværende ekspression af membran tdTomato (mT). Ved Cre-medieret rekombination skiftes mT til membran eGFP (mG) ekspression. (C) 3D-gengivelse af en langstrakt og forgrenet brystkanal over flere dage afbildet gennem en R.MIW i en R26-CreERT2; R26-mTmG hunmus ved 6 ugers alder. (D) Enkelt Z-plan billeder af forgreningsspidsen (toppaneler) og den aflange gren (bundpaneler). mT er afbildet i rødt, og mG i cyan, skalastænger repræsenterer 100 μm (A og B). Enkeltceller i stroma er fremhævet med hvide stjerner. Bemærk, at signalintensiteten blev manuelt øget for at fremhæve de enkelte celler i stroma, hvilket førte til et lidt overeksponeret udseende af brystepitelcellerne. (E) Repræsentative billeder af den inguinale lymfeknude i en R26-CreERT2; R26-mTmG hunmus afbildet gennem en R.MIW, der viser en oversigtsfeltscanning (venstre panel), zoombilleder (højre paneler) af et enkelt Z-plan (øverst) og en 3D-gengivelse (nederst). Anden harmoniske generation (kollagen I) er vist i grøn, mT i rød og mG i cyan. Skalabjælker repræsenterer 500 μm (oversigt til flisescanning) og 100 μm (zoombilleder). Figurpaneler C og D er modificeret fra Messal et al. 2. Klik her for at se en større version af denne figur.

På samme måde tillader den foreslåede R.MIW-tilgang i den voksne brystkirtel visualisering af de samme duktale strukturer over flere dage med kompromisløs synlighed. Selv brugen af mindre lys fluorescerende reportermodeller24, såsom Cdh1-mCFP (Ecadherin-mCFP) musemodellen, tillader visualisering af duktal stabilitet og subtile morfologiske ændringer ved en cellulær opløsning (figur 5). Bemærk, at sigtbarheden mellem dag 3 og dag 5 forbedredes betydeligt efter vævsomplacering (figur 5).

Figure 5
Figur 5: Flerdages billeddannelse af den voksne brystkirtel. 3D-gengivne billeder af en brystkanalstruktur af en voksen kvindelig Cdh1-mCFP (cyan, der markerer ecadherin-positive luminale cellers ekspression) mus over flere på hinanden følgende dage. Kollagen I-mønsteret (anden harmonisk generation, magenta) blev brugt til at spore den samme ROI, og Cdh1-mCFP-signalet blev brugt til at markere de duktale (luminale) celler. Bemærk, at synligheden efter dag 3 blev forbedret ved åbning af R.MIW-låget og omplacering af vævet. Skalabjælker repræsenterer 100 μm. Klik her for at se en større version af denne figur.

For at vurdere proliferativ heterogenitet af brystepitelcellerne under hormoncyklussen på enkeltcelleniveau blev den fotokonvertible Kikume Green-Red (KikGR) reportermus model25,26 anvendt, som har allestedsnærværende ekspression af KikGR-proteinet. KikGR er en lys fluorofor, der gennemgår grøn-til-rød konvertering ved udsættelse for violet lys, og det rød / grønne forhold kan bruges som en proxy for den proliferative aktivitet af en celle2 (figur 6A, B). Ved hjælp af R.MIW-tilgangen fulgte vi de samme celler i det duktale træ i den voksne brystkirtel over flere dage og fandt tidligere uventet proliferativ heterogenitet i hele duktaltræet (figur 6C). Høje og lave proliferative celler var ligeligt fordelt over de forskellige konverterede områder (figur 6C,D). Påfaldende nok viste naboceller på lokalt plan store forskelle i deres rød /grønne forhold (figur 6C, D). Kvantificering af det rød/grønne forhold mellem forskellige celler (som en proxy for deres proliferative aktivitet) 10 dage efter fotokonvertering afslørede meget variable fortyndingshastigheder for nogle celler inden for det samme duktale mikromiljø (figur 6E). Tilsammen afslører disse data en bemærkelsesværdig lokal proliferativ heterogenitet inden for den voksne brystkirtel og samtidig en global ensartet omsætningshastighed.

Figure 6
Figur 6: Langsgående IVM af proliferativ heterogenitet i den voksne brystkirtel ved hjælp af KikGR-musemodellen. (A) KikGR-mus blev afbildet på dag 0 før og efter udsættelse for violet lys. Billedbehandlingssessionerne blev gentaget på dag 2, 6 og 10 efter konvertering. (B) Skematisk skildring af de hypotetiske resultater ved fotokonvertering af KikGR-brystepitelceller efter proliferation (venstre panel) og ingen spredning (højre panel) som en funktion af tiden. (C) Det samme område af brystkirtlen blev afbildet gennem en R.MIW over en periode på 10 dage. Mindre regioner blev fotokonverteret på dag 0 og viser en lignende fortyndingshastighed af Kikume røde signal over tid, hvilket indikerer en lige omsætningshastighed i hele epitelet. (D) Zoombilleder (enkelte Z-planer) af de angivne regioner i panel C viser proliferativ heterogenitet på celleniveau 6 og 10 dage efter fotokonvertering. Skalabjælker repræsenterer 100 μm (panel C) og 10 μm (panel D). (E) Kvantificering af det rød/grønne forhold mellem tilfældigt udvalgte celler (n = 48 celler) i tre fotokonverterede områder. Et højt rød/grønt-forhold er tegn på en lav fortyndingshastighed og lav proliferativ aktivitet, mens et lavt rød/grønt-forhold er tegn på en høj fortyndingshastighed og spredning. Figurpaneler C-E er blevet ændret fra Messal et al. 2. Klik her for at se en større version af denne figur.

Discussion

R.MIW tillader langsgående billeddannelse af den sunde og syge brystkirtel i sit oprindelige og minimalt forstyrrede miljø og tillader gentagen visualisering af brystkirtlen på forskellige udviklingsstadier. R.MIW-designet gør det muligt at åbne vinduet når som helst under eksperimentet. Langsigtet visuel adgang til væv af interesse kan hindres, for eksempel ved ophobning af celleaffald på dækslippen. I sådanne tilfælde kan R.MIW åbnes før eller umiddelbart efter en billeddannelsessession for at muliggøre rengøring af hele det synlige vævsområde og låg. Det aftagelige låg tillader også manipulationer af vævet samt lokal anvendelse af stoffer, såsom specifikke hæmmere og terapier, mærkning af farvestoffer eller specifikke celletyper af interesse.

Denne metode overvinder begrænsningen af de tidligere beskrevne brysthudklapprocedurer 4,7,8,13, som er begrænset til en billeddannelsessession, og kan visualisere processer såsom forgreningsmorfogenese (figur 5), homeostatisk vævsomsætning (figur 6) eller tumorvækst på celleniveau (figur 3B ). Men samtidig tillader R.MIW lokal manipulation af vævet mellem billeddannelsessessioner, hvilket udgør et stort aktiv for R.MIW sammenlignet med den tidligere offentliggjorte MIW 3,18 og alle andre billeddannelsesvinduer 20,22. Når du åbner R.MIW, er det vigtigt at opretholde aseptiske forhold til enhver tid for at forhindre enhver infektionskilde. Evnen til at åbne R.MIW i et aseptisk miljø gør det muligt at optimere billeddannelsesbetingelserne forud for hver billeddannelsessession, hvilket i høj grad forbedrer den langsigtede visuelle adgang til vævet af interesse. Specifikt i brystkirtlen, som er indlejret i en adipocytrig stroma, er dette af stor værdi. Desuden kunne det udskiftelige låg unikt muliggøre lokal administration af terapi, forskellige celletyper, mærkningsfarvestoffer, billedstyret mikrodissering eller enhver anden lokal manipulation af vævet uden behov for at afslutte IVM-eksperimentet. For eksempel for at studere tumorinitiering kan specifikke kræftcellepopulationer injiceres direkte i det duktale træ eller stroma på et bestemt IVM-tidspunkt og præcis brystkirtelplacering, så længe denne ROI er tilgængelig via R.MIW-ringen. For at studere tumorprogression kan specifikke kræftcellepopulationer (på et bestemt sted, i et specifikt mikromiljø eller med en bestemt adfærd) fotomærkes under IVM-sessionen og derefter mikrodisseres ved hjælp af et fluorescerende dissektionsmikroskop efter åbningen af R.MIW. Isolerede celler kan behandles yderligere til downstream-analyser, såsom (enkeltcelle) mRNA-sekventering. Ved at bruge denne tilgang kunne man koble in vivo-celleadfærd til molekylære ekspressionsprofiler. Fordelen ved lokal lægemiddeladministration aktiveret af R.MIW gør det muligt at afbilde vævet før og direkte efter behandlingen. Det interval, der er nødvendigt for at fjerne musen fra billeddannelsesboksen og efterfølgende udføre lokal lægemiddeladministration efter åbning af R.MIW-låget, kan udføres på få minutter, hvilket muliggør øjeblikkelig faseindfangning af hurtigtvirkende lægemidler.

Vi viser, at IVM af brystkirtlen gennem R.MIW er kompatibel med mange forskellige fluorescerende reportermusmodeller. Det fedtrige miljø er udfordrende at image, og derfor anbefales brugen af lyse fluorophorer. Men som vist her kan endnu mindre lyse fluorophorer såsom mCFP visualiseres gennem R.MIW under optimale billeddannelsesforhold. Fedtpuden vil uundgåeligt udelukke billeddannelsen af de dybere duktale strukturer og begrænse billeddannelsen til de mere overfladiske kanaler. Et oversigtsbillede med lav opløsning i starten af hvert IVM-eksperiment hjælper med at identificere de duktale strukturer af interesse, der er tilstrækkeligt overfladiske til billeddannelse i høj opløsning. Lokal vævsmanipulation, fjernelse af bindevæv eller omplacering af fedtvævet efter åbning af R.MIW kan optimere IVM til specifikke RIE'er, der er overlejret af fedtvæv. Dette er en vigtig fordel i forhold til alle tidligere vinduesdesign, som ikke tillader at udføre disse manipulationer og ville kræve fuldstændig fjernelse af selve vinduet. Specifikt til visualisering af den inguinale lymfeknude anbefales det forsigtigt at fjerne det overliggende fedtvæv, hvilket reducerer lysspredning og muliggør billeddannelse i høj opløsning. Når du manipulerer vævet, skal du altid holde aseptiske tilstande og forhindre blødning eller alvorlig skade på vævet, da de kan påvirke de processer, der undersøges under IVM-eksperimentet.

R.MIW er lavet af titanium, et materiale, der almindeligvis anvendes i klinisk praksis til at erstatte hårdt væv såsom led eller knogleplader. Titanium har flere fordele i forhold til stålvinduer, herunder dets lette og inerte karakter21. For nylig blev flere andre materialer brugt til at generere nye billedvinduestyper, herunder det fleksible siliciumvindue20. I modsætning til R.MIW kræver det fleksible vindue ingen suturer til implantation og er velegnet til næsten enhver anatomisk position, specifikt i tilfælde af blødt og skrøbeligt væv. Siliciumvinduer har en minimal indvirkning på dyrs bevægelighed på grund af deres lette og deformerbare natur og måske mere velegnet til eksperimenter, der studerer hurtig vævsudvidelse og vækst20. En anden fordel i forhold til titaniumversionen er, at siliciumvinduer er kompatible med andre billedbehandlingsmetoder, herunder magnetisk resonansbilleddannelse20,27. Det vil dog være vigtigt at huske på, at målene er optimeret til 0,17 mm glasovertræk. Desuden er brystvæv modtageligt for vejrtrækningsbevægelser, som er svære at begrænse ved hjælp af det fleksible vindue, især når man bruger et omvendt mikroskop. Åndedrætsartefakter minimeres af R.MIW-designet og fikseringen af R.MIW i indlægget på billeddannelsesboksen. Som følge heraf forvrænges billeder, der er erhvervet ved hjælp af den foreslåede R.MIW-opsætning, ikke på grund af vejrtrækningsartefakter. Imidlertid kan der forekomme mindre drifter i vævslokalisering, som normalt er gradvise og kan korrigeres ved hjælp af bevægelseskorrektionssoftwareefter erhvervelse 28. Med den stigende værktøjskasse af IVM-teknologier 2,20 vil de specifikke krav til hvert eksperiment i sidste ende bestemme den bedste måde at in vivo-visualisering af vævet af interesse. Forskellige vinduesdesign har forskellige fordele og ulemper, og afhængigt af forskningsspørgsmålet, den tilgængelige mikroskopiopsætning, den krævede rumlige og tidsmæssige opløsning og det samlede tidsrum for den studerede proces skal den optimale tilgang bestemmes.

Sammenfattende letter R.MIW højopløsningskarakterisering af den cellulære dynamik under brystkirteludvikling, homeostase og sygdom over flere dage til uger.

Disclosures

Forfatterne har intet at afsløre

Acknowledgments

Dette arbejde blev støttet af Research Foundation Flanders (ph.d.-stipendium grundforskning 11L7222N til M.C.), Boehringer Ingelheim Foundation (ph.d.-stipendium til C.L.G.J.S), et EMBO postdoc-stipendium (bevilling ALTF 1035-2020 til C.L.G.J.S.) og Doctor Josef Steiner Award (til J.v.R).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
0.9% NaCl BD 306573 Other brands available
10 mm round coverglass Fisher scientific 10696365 Other brands available
5-0 braided silk suturs Ethicon W580
80% Ethanol homemade NA
Anesthesia induction box Kentscientific VetFlo-MSEKIT
Buprenorphine (Vetergesic®) Ecuphar NA
Cotton tips (sterile) Fisher scientific 13113743 Other brands available
Cyanoacrylate adhesive Loctite NA Other brands available
Eye ointment Duratears NA
Flexible butterfly needle Greiner Bio-One 450120 Other brands available
Graefe forceps (blunt) Fine Science Tools 11051-10
Heating pad Kentscientific RightTemp Jr. Other brands available
Imaging box Custom made NA
Infuse nutrient mixture Braun Nutriflex special 70/240
Insulin syringes BD 324911 Other brands available
Inverted multi-photon microscope with automated stage Leica Microsystems NA
Isoflurane vaporizer Kentscientific VetFlo-1231K
Needle holder Fine Science Tools 12510-14
Parafilm Sigma-Aldrich P7793 semi-transparent tape
Paper tape tesa Tesa NA
Petroleum Jelly Vaseline NA
Razor blades Fisher scientific 11904325 Other brands available
Silicon tubing Solutions Elastomeres NA Any houseware
Spring scissors (small) Fine Science Tools 15018-10
Sterile PBS ThermoFisher Scientific 10010023
Syringe (10 ml) BD 305482 Other brands available
Thin forceps Fine Science Tools 11413-11
Titanium lid for mammary imaging window Custom made NA
Titanium mammary imaging window Custom made NA
Wooden sticks toothpicks Fisher scientific NC1678836 Other brands available

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Watson, C. J., Khaled, W. T. Mammary development in the embryo and adult: new insights into the journey of morphogenesis and commitment. Development. 147 (22), Cambridge, England. (2020).
  2. Messal, H. A., van Rheenen, J., Scheele, C. L. G. J. An Intravital Microscopy Toolbox to Study Mammary Gland Dynamics from Cellular Level to Organ Scale. Journal of Mammary Gland Biology and Neoplasia. 26 (1), 9-27 (2021).
  3. Kedrin, D., et al. Intravital imaging of metastatic behavior through a mammary imaging window. Nature Methods. 5 (12), 1019-1021 (2008).
  4. Dawson, C. A., Mueller, S. N., Lindeman, G. J., Rios, A. C., Visvader, J. E. Intravital microscopy of dynamic single-cell behavior in mouse mammary tissue. Nature Protocols. 16 (4), 1907-1935 (2021).
  5. Scheele, C. L., et al. Identity and dynamics of mammary stem cells during branching morphogenesis. Nature. 542 (7641), 313-317 (2017).
  6. Kotsuma, M., et al. Nondestructive, serial in vivo imaging of a tissue-flap using a tissue adhesion barrier. IntraVital. 1 (1), 69-76 (2012).
  7. Ingman, W. V., Wyckoff, J., Gouon-Evans, V., Condeelis, J., Pollard, J. W. Macrophages promote collagen fibrillogenesis around terminal end buds of the developing mammary gland. Developmental Dynamics: an official publication of the American Association of Anatomists. 235 (12), 3222-3229 (2006).
  8. Entenberg, D., et al. large-volume, high-resolution intravital imaging for tissue-wide analysis of single cell dynamics. Methods (San Diego, Calif). 128, 65-77 (2017).
  9. Masedunskas, A., Weigert, R., Mather, I. H. Intravital Imaging of the Lactating Mammary Gland in Transgenic Mice Expressing Fluorescent Proteins. Advances in Intravital Microscopy. , Springer. Netherlands. 187-204 (2014).
  10. Masedunskas, A., Chen, Y., Stussman, R., Weigert, R., Mather, I. H. Kinetics of milk lipid droplet transport, growth, and secretion revealed by intravital imaging: lipid droplet release is intermittently stimulated by oxytocin. Molecular Biology of the Cell. 28 (7), 935-946 (2017).
  11. Mather, I. H., Masedunskas, A., Chen, Y., Weigert, R. Symposium review: Intravital imaging of the lactating mammary gland in live mice reveals novel aspects of milk-lipid secretion. Journal of Dairy Science. 102 (3), 2760-2782 (2019).
  12. Stevenson, A. J., et al. Multiscale imaging of basal cell dynamics in the functionally mature mammary gland. Proceedings of the National Academy of Sciences. 117 (43), 26822-26832 (2020).
  13. Ewald, A. J., Werb, Z., Egeblad, M. Preparation of Mice for Long-Term Intravital Imaging of the Mammary Gland. Cold Spring Harbor Protocols. 2011 (2), 5562 (2011).
  14. Ewald, A. J., Werb, Z., Egeblad, M. Monitoring of Vital Signs for Long-Term Survival of Mice under Anesthesia. Cold Spring Harbor Protocols. 2011 (2), 5563 (2011).
  15. Harney, A. S., Wang, Y., Condeelis, J. S., Entenberg, D. Extended Time-lapse Intravital Imaging of Real-time Multicellular Dynamics in the Tumor Microenvironment. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (112), e54042 (2016).
  16. Harper, K. L., et al. Mechanism of early dissemination and metastasis in Her2+ mammary cancer. Nature. 540 (7634), 588-592 (2016).
  17. Sobolik, T., et al. Development of novel murine mammary imaging windows to examine wound healing effects on leukocyte trafficking in mammary tumors with intravital imaging. IntraVital. 5 (1), 1125562 (2016).
  18. Shan, S., Sorg, B., Dewhirst, M. W. A novel rodent mammary window of orthotopic breast cancer for intravital microscopy. Microvascular Research. 65 (2), 109-117 (2003).
  19. Zomer, A., et al. Intravital imaging of cancer stem cell plasticity in mammary tumors. Stem Cells. 31 (3), 602-606 (2013).
  20. Jacquemin, G., et al. Longitudinal high-resolution imaging through a flexible intravital imaging window. Science Advances. 7 (25), (2021).
  21. Niinomi, M. Recent research and development in titanium alloys for biomedical applications and healthcare goods. Science and Technology of Advanced Materials. 4 (5), 445-454 (2003).
  22. Ritsma, L., et al. Surgical implantation of an abdominal imaging window for intravital microscopy. Nature Protocols. 8 (3), 583-594 (2013).
  23. Muzumdar, M. D., Tasic, B., Miyamichi, K., Li, N., Luo, L. A global double-fluorescent cre reporter mouse. Genesis. 45 (9), New York, N.Y. 593-605 (2007).
  24. Snippert, H. J., et al. Intestinal Crypt Homeostasis Results from Neutral Competition between Symmetrically Dividing Lgr5 Stem Cells. Cell. 143 (1), 134-144 (2010).
  25. Nowotschin, S., Hadjantonakis, A. K. Use of KikGR a photoconvertible green-to-red fluorescent protein for cell labeling and lineage analysis in ES cells and mouse embryos. BMC Developmental Biology. 9, 49 (2009).
  26. Kurotaki, Y., Hatta, K., Nakao, K., Nabeshima, Y. I., Fujimori, T. Blastocyst Axis Is Specified Independently of Early Cell Lineage But Aligns with the ZP Shape. Science. 316 (5825), New York, N.Y. 719-723 (2007).
  27. Heo, C., et al. A soft, transparent, freely accessible cranial window for chronic imaging and electrophysiology. Scientific Reports. 6, 27818 (2016).
  28. Warren, S. C., et al. Removing physiological motion from Intravital and clinical functional imaging data. eLife. 7, 35800 (2018).

Tags

Biologi udgave 179
Langsgående intravital mikroskopi ved hjælp af et brystbilledvindue med udskifteligt låg
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Mourao, L., Ciwinska, M., van… More

Mourao, L., Ciwinska, M., van Rheenen, J., Scheele, C. L. G. J. Longitudinal Intravital Microscopy Using a Mammary Imaging Window with Replaceable Lid. J. Vis. Exp. (179), e63326, doi:10.3791/63326 (2022).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter