Artigo de método

Quantificação da Distribuição de Glicogênio Subcelular em Fibras Musculares Esqueléticas usando Microscopia eletrônica de transmissão

DOI:

10.3791/63347

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7 de fevereiro de 2022

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1Research center for applied health science, University College South Denmark, 2Department of Sports Science and Clinical Biomechanics, University of Southern Denmark, 3Department of Biomedical Sciences, Core Facility for Integrated Microscopy, University of Copenhagen

Neste artigo

Resumo

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Um procedimento pós-fixação modificado aumenta o contraste das partículas de glicogênio no tecido. Este artigo fornece um protocolo passo-a-passo descrevendo como lidar com o tecido, conduzir a imagem e usar métodos esterológicos para obter dados imparciales e quantitativos sobre a distribuição de glicogênio subcelular específico do tipo de fibra no músculo esquelético.

Resumo

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Com o uso de microscopia eletrônica de transmissão, podem ser obtidas imagens de alta resolução de amostras fixas contendo fibras musculares individuais. Isso permite quantificações de aspectos ultraestruturais, como frações de volume, proporções de superfície/volume, morfometria e locais de contato físico de diferentes estruturas subcelulares. Na década de 1970, um protocolo para melhor coloração de glicogênio nas células foi desenvolvido e abriu caminho para uma série de estudos sobre a localização subcelular do tamanho de partículas glicogênio e glicogênio usando microscopia eletrônica de transmissão. Enquanto a maioria das análises interpreta o glicogênio como se fosse distribuído homogêneo dentro das fibras musculares, fornecendo apenas um único valor (por exemplo, uma concentração média), a microscopia eletrônica de transmissão revelou que o glicogênio é armazenado como partículas de glicogênio discretas localizadas em compartimentos subcelulares distintos. Aqui, descreve-se o protocolo passo-a-passo da coleta de tecidos para a determinação quantitativa da fração de volume e diâmetro de partículas do glicogênio nos distintos compartimentos subcelulares das fibras musculares esqueléticas individuais. Considerações sobre como 1) coletar e manchar amostras de tecidos, 2) realizar análises de imagem e manuseio de dados, 3) avaliar a precisão das estimativas, 4) discriminar entre tipos de fibras musculares e 5) armadilhas e limitações metodológicas.

Introdução

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

As partículas glicogênio são compostas de polímeros ramificados de glicose e várias proteínas associadas1 e constituem um combustível importante durante altas demandas metabólicas2. Embora não amplamente reconhecidas, as partículas de glicogênio também constituem um combustível local, onde alguns processos subcelulares utilizam preferencialmente o glicogênio, apesar da disponibilidade de outros combustíveis mais duradouros como glicose plasmática e ácidos graxos3,4.

A importância de armazenar glicogênio como combustível localizado específico subcelular tem sido discutida em várias revisões5,6 principalmente com base em algumas das documentações mais antigas da distribuição subcelular de glicogênio por microscopia eletrônica de transmissão (TEM)7,8. Os primeiros estudos utilizaram diferentes protocolos para aumentar o contraste do glicogênio das técnicas histoquímicas de coloração para manchas negativas e positivas9,10. Um importante desenvolvimento metodológico foi o refinado protocolo pós-fixação com o osmium reduzido por ferrociancida de potássio111,12,13,14, o que melhorou significativamente o contraste das partículas de glicogênio. Este protocolo refinado não foi usado em alguns dos trabalhos pioneiros sobre o esgotamento do glicogênio induzido pelo exercício15, mas foi reintroduzido por Graham e seus colegas16,17.

Com base nas imagens bidimensionais, a distribuição subcelular do glicogênio é mais frequentemente descrita como partículas de glicogênio localizadas em três piscinas: subsarcolemmal (logo abaixo da membrana superficial), intermyofibrilar (entre os miofibrils) ou intramyofibrilar (dentro dos miofibrils). No entanto, partículas de glicogênio também podem ser descritas como associadas, por exemplo, a reguloso sarcoplasmático7 ou núcleos18. Além da distribuição subcelular, a vantagem do teor de glicogênio estimado pelo TEM também é que a quantificação pode ser realizada no nível único de fibra. Isso permite a investigação da variabilidade de fibra para fibra e análises correlativas com tipos de fibras e componentes celulares como mitocôndrias e gotículas lipídicas.

Aqui, descreve-se o protocolo para o teor volutrico específico do tipo de fibra tem das três piscinas subcelulares comuns de glicogênio (subsarcolemmal, intermyofibrilar e intramyofibrilar) em fibras musculares esqueléticas. O método foi aplicado aos músculos esqueléticos de humanos19, ratos20 e camundongos21; assim como aves e peixes22; e cardiomiócitos de ratos23.

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Protocolo

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O presente protocolo utilizando amostras de músculo esquelético biopsied humano foi aprovado pelos Comitês Regionais de Ética em Pesquisa em Saúde para a Dinamarca do Sul (S-20170198). Biópsias musculares foram obtidas através de uma incisão na pele do músculo vasto lateralis usando uma agulha bergström com sucção após a anestesia local ter sido dada subcutânea (1-3 mL de Lidocaína 2% por incisão). Se utilizados músculos inteiros de ratos isolados, os animais foram sacrificados por luxação cervical antes da obtenção das biópsias musculares, de acordo com as diretrizes do comitê de ética animal do Hospital Universitário Odense, na Dinamarca.

1. Fixação primária, pós-fixação, incorporação, secção e contraste

  1. Prepare 1,6 mL de solução fixação primária (2,5% glutaraldeído em 0,1 M tampão de cacodilato de sódio (pH 7,3)) em um tubo de micro centrifugação de 2 mL. Armazene a 5 °C durante a máxima de 14 dias.
  2. Da biópsia muscular ou músculo inteiro, isole uma pequena amostra, que tem um diâmetro máximo de 1 mm em qualquer direção e é um pouco mais longa na direção de fibra longitudinal do que transversalmente (para fins de orientação).
  3. Coloque a amostra no tubo contendo a solução de fixação primária fria. Armazene a 5 °C por 24 h.
  4. Lave a amostra quatro vezes (15 minutos entre cada lavagem) em tampão de cacodilato de sódio de 0,1 M (pH 7.3). Usando pipetas de transferência, remova o tampão usado do tubo deixando a amostra intocada e, posteriormente, adicione o tampão fresco.
    NOTA: Após a lavagem final, a amostra pode ser armazenada no tampão de cacodilato de sódio de 0,1 M a 5 °C por vários meses11. O protocolo pode ser pausado aqui.
  5. Pós-fixado com 1% de tetroxida de ósmio (OsO4) e ferrocianida de potássio de 1,5% (K4Fe(CN)6) em tampão de cacodilato de sódio de 0,1 M (pH 7.3) por 120 min a 4 °C.
    NOTA: O uso de ferrocianida de potássio de 1,5% (K4Fe(CN)6) é essencial para um contraste ideal de partículas glicogênio11,12,13.
  6. Enxágüe duas vezes em água duplamente destilada à temperatura ambiente (RT).
  7. Desidratar submergir em uma série de álcool (etanol) em RT utilizando as seguintes concentrações: 70% (10 min), 70% (10 min), 95% (10 min), 100% (10 min) e 100% (10 min).
    NOTA: Em cada etapa, a amostra fica submersa no etanol, que é posteriormente apenas parcialmente removido para evitar a secagem da amostra. Finalmente, o etanol que sobra é descartado.
  8. Infiltrar-se com misturas classificadas de óxido de propileno e resina epossídica na RT utilizando as seguintes razões de volume (óxido de propileno/resina epossídica): 1/0 (10 min), 1/0 (10 min), 3/1 (45 min), 1/1 (45 min), 1/3 (45 min), 0/1 (pernoite). No dia seguinte, incorpore amostras em resina esídica 100% fresca em moldes e polimerize a 60 °C por 48 h.
    NOTA: Este método classificado é de acordo com os protocolos anteriores11,12. O protocolo pode ser pausado aqui.
  9. Corte seções ultrafinas (60-70 nm) de fibras longitudinalmente orientadas e colete-as em grades de cobre de um orifício da seguinte forma.
    1. Monte o bloco de um espécime no suporte ultramicroome.
    2. Corte o bloco na superfície com uma lâmina de barbear para atingir o nível do tecido.
    3. Monte uma faca de diamante (ultracut 45) na frente da amostra e alinhe a superfície da amostra paralela à faca.
    4. Produza uma seção semifina (1 μm) com a faca de diamante para verificar a orientação da amostra. Colora a seção semifina com azul toluidina para observação com microscopia leve.
    5. Corte ainda mais o bloco para reduzir a área de interesse, a fim de obter seções ultrathin adequadas.
    6. Corte ultrathin (60-70 nm) seções com uma segunda faca de diamante (ultracut 45).
    7. Colete 1-2 seções em grades de cobre de um orifício usando um Loop Perfeito.
      NOTA: A grade de cobre de um orifício tem um único orifício no meio com membrana de suporte Formvar.
  10. Seções de contraste com acetato deuranyl e citrato de chumbo, imergindo as grades acima em solução de acetato deuranyl (0,5% em água dupla destilada) por 20 minutos, e depois em solução de citrato de chumbo (1% em água dupla destilada) por 15 min. Lave as grades em água duplamente destilada entre e depois das duas manchas.
    NOTA: O protocolo pode ser pausado aqui.

2. Imagem

  1. Ligue o microscópio eletrônico de transmissão (operado a uma tensão acelerada de 80 kV), computador e software de gravação de imagens. Grave imagens digitais com uma câmera CCD digital de varredura lenta de 2 k x 2 k e o software de imagem associado.
  2. Insira a grade com várias seções no estágio do microscópio.
  3. Trie a grade inicialmente em baixa ampliação (por exemplo, x100) para determinar a qualidade das seções (ou seja, furos na membrana de suporte, detritos, etc.) e escolha as seções de melhor qualidade. Em baixa ampliação, determine a direção das fibras musculares.
  4. Em seguida, aumente a ampliação com o feixe centrado em uma fibra periférica na seção. Concentre a imagem na ampliação acima de 30 mil para garantir detalhes finos suficientes na imagem, guiada por uma Transformação Quatro mais rápida em tempo real, se disponível. Por fim, registos com 1 s tempo de exposição na ampliação desejada.
  5. Adquira um total de 24 imagens de uma fibra selecionada aleatoriamente, ou seja, 12 imagens do espaço miofibrilar e 12 imagens do espaço subsarcolemmal, em uma ampliação entre 10 k e 40 k. Certifique-se de que as imagens estão distribuídas através do comprimento e largura da fibra em uma ordem aleatória, mas sistemática, para obter resultados imparcial (Figura 1A).
    NOTA: A ampliação ideal depende da resolução da câmera disponível e do tamanho dos micrografos. O objetivo é alcançar uma resolução final, onde os diâmetros de partículas de glicogênio podem ser medidos dentro de etapas de 1 nm, e incluir uma área total da região miofibrilar de pelo menos 70 μm2 e um comprimento total da fibra de pelo menos 25 μm distribuídos em 12 imagens do espaço miofibrilar e 12 imagens do espaço subsarcolêmal por fibra, respectivamente. As 24 imagens por fibra provavelmente darão uma precisão (coeficiente de erro) do conteúdo volumoso das diferentes piscinas de glicogênio entre 0,1 e 0,2 em fibras individuais dos músculos esqueléticos humanos, ratos e camundongos 20,21,24 (Figura 2E).
  6. Repetir as etapas 2.4 e 2.5 até que um total de 6-10 fibras sejam imagens. Se necessário, corte seções adicionais (separadas por pelo menos 150 μm para evitar a sobreposição de fibras já imagens) e repita as etapas 1.9-2.5.

3. Análises de imagem

  1. Importe imagens para ImageJ clicando em Arquivo > Aberto.
  2. Defina escala global para corresponder ao tamanho original da imagem clicando em Analisar > Escala definida.
  3. Zoom em 100% clicando em Imagem > Zoom > In.
  4. Meça a espessura de um disco Z por imagem do espaço miofibrilar (12 por fibra) utilizando a ferramenta Linha Reta do menu Ferramentas (Figura 1D). Calcule a espessura média do disco Z de cada uma das 6-10 fibras.
  5. Defina 2-3 fibras com o disco Z médio mais grosso como fibras tipo 1 e fibras 2-3 com o disco Z médio mais fino como fibras tipo 2. Desconsidere as fibras intermediárias 2-4 para análises posteriores (Figura 1E).
    NOTA: As seguintes etapas são repetidas para cada uma das 4-6 fibras da amostra. As frações de volume de glicogênio são estimadas por contagem de pontos, conforme descrito em outros lugares25,26. O tamanho das grades é escolhido para obter uma precisão satisfatória de alta precisão das estimativas. Isso é muitas vezes obtido por alcançar 250 acertos, o que dita o número total de pontos necessários e, por sua vez, a área por ponto.
  6. Use a ferramenta Linha Segmentada para medir o comprimento do myofibril mais externo visível logo abaixo da região subsarcolemmal (Figura 2A).
    NOTA: Este comprimento é usado para expressar glicogênio subsarcolemmal por área de superfície (ou seja, comprimento do myofibril mais externo multiplicado pela espessura da seção (60 nm); ver passo 4.5). Portanto, apenas a região subsarcolemmal, representada por esse comprimento, está incluída na análise.
  7. Insira uma grade clicando em Analisar > Ferramentas > Grade e definir Área por Ponto em 32.400 nm2. Conte o número de acessos dentro do comprimento disponível nas 12 imagens subsarcolemmal, onde uma cruz atinge o glicogênio subsarcolemmal (Figura 2A). Um hit é definido como uma partícula glicogênio presente no canto superior direito de um cruzamento.
  8. Insira uma grade clicando em Analisar > Ferramentas > Grade e definir Área por Ponto em 160.000 nm2. Conte o número de acessos nas 12 imagens miofibrilares, onde um cruzamento atinge o espaço intramyofibrilar (Figura 2B).
  9. Insira uma grade clicando em Analisar > Ferramentas > Grade e definir Área por Ponto em 3.600 nm2. Conte o número de acessos nas 12 imagens miofibrilar, onde um cruzamento atinge o glicogênio intramyofibrilar (Figura 2C).
  10. Insira uma grade clicando em Analisar > Ferramentas > Grade e definir Área por Ponto em 32.400 nm2. Conte o número de acertos nas 12 imagens miofibrilares, onde um cruzamento atinge o glicogênio intermyofibrilar (Figura 2D).
  11. Utilizando a ferramenta Linha Reta , meça o diâmetro de cinco partículas de glicogênio escolhidas aleatoriamente de cada piscina para cada uma das 12 imagens para obter uma média de 60 partículas por piscina por fibra.
    NOTA: A média de 60 partículas cobre em grande parte a variação dentro da fibra (Figura 2F).

4. Cálculos

  1. Calcule a fração de área aparente (AA) do espaço intramyofibrilar por espaço miofibrilar como a soma de todos os hits divididos pela soma de todos os pontos das 12 imagens (da etapa 3.8).
  2. Calcule a fração de área aparente de glicogênio intramyofibrilar por área miofibrilar, glicogênio intermyofibrilar por área de miofibrilar e glicogênio subsarcolêmal por área de imagem como a soma de todos os hits divididos pela soma de todos os pontos das 12 imagens (das etapas 3,7, 3,9 e 3,10).
  3. Calcule a fração de volume (VV) de glicogênio intramiofibrilar, intermiofibrilar e subsarcolêmal, respectivamente, como a fração de área aparente (AA) menos o produto da densidade superficial (SV) com espessura de seção (t), onde a densidade da superfície é a densidade numérica de partículas multiplicadas pela superfície média da partícula:
    Vv = AA - (1 / 4) · Sv · t
    onde
    Sv (μm-1) = AA / ( (π · (((1 / 2) · H)2)) · (t + H))
    t = 0,06 μm
    H = diâmetro médio das partículas (μm)
    NOTA: A fração de volume é menor do que a fração de área aparente devido à contribuição de tampas de partículas com seu centro fora da fatia25.
  4. Para expressar glicogênio intramyofibrilar por espaço intramyofibrilar, divida a fração de área do glicogênio intramyofibrilar (etapa 4.2) pela fração de área do espaço intramyofibrilar (etapa 4.1). O glicogênio intermyofibrilar é expresso por espaço miofibrilar calculado na etapa anterior (etapa 4.3).
  5. Para expressar glicogênio subsarcolemmal por superfície da fibra (VS) (mais externamente mofibril), converta a fração de volume do glicogênio em uma quantidade absoluta multiplicando-se com o volume da imagem (produto de espessura de área e seção) e dividindo-se pelo produto de comprimento médio disponível (a partir da etapa 3.6) com espessura de seção (t).
  6. Estime o teor total de glicogênio volumoso utilizando os valores das etapas 4.1, 4.4 e 4.5, da seguinte forma:
    Glicogênio miofibrilar = Glicogênio intermyofibrilar + (glicogênio intramyofibrilar · fração de área do espaço intramyofibrilar)
    Assumindo um raio médio de fibra de 40 μm27, a relação volume/superfície é de 20:1, então o glicogênio total é:
    Glicogênio total (VV) = Glicogênio miofibrilar + (glicogênio subsarcolemmal (VS) / 20)
    NOTA: A relação volume/superfície de 20:1 pode variar de fibra para fibra, dependendo do tamanho real da fibra e do tamanho da região subsarcolemmal. Isso não é levado em conta com o presente protocolo.
  7. A partir disso, a contribuição relativa de cada pool é calculada como frações do glicogênio total:
    Glicogênio intermyofibrilar / Glicogênio total = Glicogênio intermyofibrilar / Glicogênio total
    Glicogênio intramyofibrilar / Glicogênio total = (Glicogênio intramyofibrilar · fração de área de espaço intramyofibrilar) / Glicogênio total
    Glicogênio subsarcolemmal / Glicogênio total = Glicogênio subsarcolêmico / 20 / Glicogênio total
  8. Para cada pool de glicogênio, calcule o coeficiente de erro (CE), que expressa a incerteza da estimativa de glicogênio em um nível de fibra, com base no número de imagens (n), no número total de cruzes em cada imagem (x), e no número de cruzes que atingem o glicogênio na piscina relevante em cada imagem (y) conforme segue28:
    CE = n-1 · ∑x2 · (∑x) -2 + ∑y2 · (∑) -2 - 2∑(xy) · ∑x-1 · ∑-1

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Resultados

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Usando este protocolo, as partículas de glicogênio parecem negras e distintas (Figuras 1 e Figura 2). Os valores normais do glicogênio são retratados na Figura 3. Esses dados são baseados em um total de 362 fibras de 41 jovens saudáveis, conforme coletado em diferentes estudos anteriores19,24,29,30,31.

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Discussão

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

A etapa crítica do método é o uso de osmium reduzido por ferrocianídeo de potássio durante a pós-fixação. A seletividade deste fixador modificado para detecção de glicogênio não pode ser totalmente explicada pela química, mas também inclui achados experimentais que demonstram nenhuma detecção de tais partículas em tecidos conhecidos por estarem livres de glicogênio ou no espaço extracelular11.

Parâmetros críticos são a precisão das estimativas e a variação de fibra para...

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Divulgações

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Os autores não declaram interesses concorrentes.

Agradecimentos

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Este trabalho foi apoiado pelo Comitê Olímpico Sueco.

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Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo
NomeEmpresaNúmero de catálogoComentários
1,2-Óxido de propilenoMerck75-56-9
Incorporando 812 kit de resina médiaTaabT031
Solução de glutaraldeído 25%Merck1.04239.0250
ITEMOlympusImaging software
Leica EM AC20LeicaSistema de contraste automático
OSIS Veleta câmera digitalSolução de
4%Polysciences0972A
Philips CM 100 Transmissão EMPhilips
Hexacianoferrato de potássio (II) trihidratadoSigma-Aldrich455989-245G
Cacodiltampão de sódio 0,2 M ph 7.4Ampliqon.comAMPQ40989.0500
Ultramicrótomo Leica UC7Leica
Ultrostain citrato de chumbo 3%, solução estabilizadaLeica16707235
acetato de uranila di-hidratadoPolysciences6159-44-0
tetróxido de ósmio Olympus

Referências

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
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Glycogen StainingMuscle Fiber TypesImage AnalysisGlycogen Particle SizeUltrastructural QuantificationSubcellular Compartments

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