Summary
In questo protocollo, le isole pancreatiche vengono ricostruite e analizzate utilizzando algoritmi computazionali implementati in un'applicazione multipiattaforma dedicata.
Abstract
Le proprietà strutturali delle isole pancreatiche sono fondamentali per la risposta funzionale delle cellule secernenti insulina, glucagone e somatostatina, a causa delle loro implicazioni nella comunicazione intraisletale tramite segnalazione elettrica, paracrina e autocrina. In questo protocollo, l'architettura tridimensionale di un'isolotto pancreatica viene prima ricostruita da dati sperimentali utilizzando un nuovo algoritmo computazionale. Successivamente, si ottengono le proprietà morfologiche e di connettività dell'isolotto ricostruito, come il numero e le percentuali del diverso tipo di cellule, il volume cellulare e i contatti da cellula a cellula. Quindi, la teoria della rete viene utilizzata per descrivere le proprietà di connettività dell'isolotto attraverso metriche derivate dalla rete come grado medio, coefficiente di clustering, densità, diametro ed efficienza. Infine, tutte queste proprietà sono valutate funzionalmente attraverso simulazioni computazionali utilizzando un modello di oscillatori accoppiati. Nel complesso, qui descriviamo un flusso di lavoro passo-passo, implementato in IsletLab, un'applicazione multipiattaforma sviluppata appositamente per lo studio e la simulazione di isole pancreatiche, per applicare una nuova metodologia computazionale per caratterizzare e analizzare le isole pancreatiche come complemento al lavoro sperimentale.
Introduction
Il pancreas è diviso in regioni denominate testa, collo, corpo e coda, ognuna con diverse strutture, funzioni e posizione anatomica 1,2. Da un punto di vista funzionale, il pancreas può essere suddiviso in sistemi endocrino ed esocrino con il primo responsabile della secrezione di ormoni criticamente coinvolti nella regolazione dell'omeostasi del glucosio, mentre il secondo contribuisce alla digestione degli alimenti attraverso la secrezione di enzimi nel duodeno1. Le isole pancreatiche costituiscono il tessuto endocrino del pancreas e sono responsabili della secrezione di glucagone, insulina e somatostatina, secreti rispettivamente dalle cellule ɑ, β e δ,rispettivamente 3. Oltre ai loro meccanismi di regolazione intrinseci, queste cellule sono regolate tramite comunicazione elettrica diretta (tra cellule β e probabilmente β e δ cellule), e anche dalla segnalazione paracrina e autocrina 4,5,6. Entrambi i meccanismi dipendono fortemente dall'architettura dell'isolotto (cioè dalla composizione e dall'organizzazione dei diversi tipi di cellule all'interno dell'isolotto)7,8. È importante sottolineare che l'architettura delle isole è alterata in presenza di diabete, molto probabilmente disturbando la comunicazione intraisleta di conseguenza 9,10.
Lo studio delle isole pancreatiche coinvolge una vasta gamma di metodologie sperimentali. Tra questi, l'uso di tecniche di fluorescenza per determinare il numero, la posizione e il tipo delle diverse cellule nell'isolotto ha permesso di studiare le proprietà strutturali e morfologiche delle isole pancreatiche 11,12,13 e di acquisire una migliore comprensione delle implicazioni funzionali in salute e malattia. Come complemento, modelli computazionali di cellule pancreatiche 14,15,16 e, più recentemente, isole pancreatiche 12,17,18,19 sono stati utilizzati negli ultimi decenni per valutare aspetti difficili o addirittura impossibili da affrontare sperimentalmente.
In questo protocollo, miriamo a colmare il divario tra il lavoro sperimentale e computazionale delineando una metodologia per ricostruire le architetture delle isole, per analizzare le loro proprietà morfologiche e di connettività attraverso metriche quantitative e per eseguire simulazioni di base per valutare le implicazioni funzionali delle proprietà delle isole.
Il protocollo descritto di seguito si basa su algoritmi computazionali specificamente progettati per lo studio delle isole pancreatiche. In sintesi, nella prima fase del protocollo, l'architettura delle isole viene ricostruita da dati sperimentali utilizzando l'algoritmo recentemente proposto da Félix-Martínez et al.19 in cui posizioni nucleari ottenute attraverso la colorazione 4′,6-diamidino-2-fenilindolo (DAPI) e tipi cellulari identificati attraverso l'immunofluorescenza (come descritto in dettaglio da Hoang et al.11,12 ) sono elaborati in una procedura di ottimizzazione iterativa. Questo porta a determinare la dimensione e la posizione ottimali di ogni cella e ad ottenere un isolotto composto da celle non sovrapposte. In secondo luogo, sulla base dell'architettura ricostruita, vengono identificati i contatti cellula-cellula per determinare le proprietà di connettività e per generare la corrispondente rete isolotta che consente all'utente di ottenere metriche quantitative per descrivere ulteriormente l'architettura dell'isolotto (i dettagli sull'algoritmo di ricostruzione possono essere consultati nel lavoro originale sull'argomento19). Infine, vengono eseguite simulazioni funzionali di base utilizzando l'approccio modellistico proposto da Hoang et al.12 in cui, in base alla natura pulsatile della secrezione ormonale osservata sperimentalmente20,21, ogni cellula viene trattata come un oscillatore, e quindi l'isolotto è rappresentato come una rete di oscillatori accoppiati che seguono le proprietà di connettività dell'isolotto ricostruito.
Data la complessità computazionale degli algoritmi utilizzati in questo protocollo, tutti i passaggi coinvolti sono stati implementati in un'applicazione standalone22 con l'obiettivo principale di avvicinare questi strumenti computazionali a tutti i lettori interessati indipendentemente dal loro livello di esperienza nell'uso di software specializzati o linguaggi di programmazione.
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Protocol
NOTA: un diagramma schematico del protocollo è illustrato nella Figura 1. Una descrizione dettagliata è la seguente (vedere Il file supplementare 1 per i dettagli sui pannelli di controllo utilizzati in ogni fase del protocollo).
Figura 1: Diagramma di flusso. Diagramma di flusso che descrive l'ordine sequenziale del protocollo implementato in IsletLab. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
1. Installazione di IsletLab in Linux
NOTA: seguire le istruzioni fornite nelle sezioni 2 e 3 del File supplementare 2 per installare IsletLab in Windows o macOS.
- Apri un browser Internet e vai su https://github.com/gjfelix/IsletLab. Scaricare ed estrarre i file del repository IsletLab.
NOTA: il file supplementare 3 include una copia della versione di IsletLab utilizzata in questo protocollo. - Verificare che i compilatori gcc e nvcc siano installati. Aprire un terminale e digitare i seguenti comandi:
gcc --versione
nvcc --versione
Seguire le istruzioni elencate nella sezione 1 del file supplementare 2 se uno di questi comandi non viene riconosciuto dal sistema. - Scaricare e installare la piattaforma di data science (vedere Tabella dei materiali). Apri un terminale e vai alla cartella IsletLab.
- Creare un nuovo ambiente digitando il seguente comando nel terminale:
conda env create -f isletlabgui_v1.0.yml - Attivare il nuovo ambiente digitando:
conda activate isletlab_v1.0 - Avviare l'applicazione IsletLab digitando il seguente comando nel terminale (vedere la Figura 2 per una descrizione della finestra principale):
python isletlabgui_v1.0.py
Figura 2: Interfaccia utente di IsletLab. L'interfaccia è composta da tre pannelli principali: configurazione (1), statistiche (2) e grafica (3) pannelli. La barra degli strumenti grafica (4) si trova nella parte inferiore del pannello grafico. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
2. Ricostruzione dell'isolotto
- Preparare i dati di input. Organizzare i dati dell'isolotto di input (ad esempio, tipi di cella e coordinate tridimensionali (3D)) in un file a quattro colonne in cui la colonna 1 contiene il tipo di cella (codificato come 11: ɑ-cell, 12: β-cell, 13: δ-cell) e le colonne da 2 a 4 contengono rispettivamente le coordinate x, y e z (vedere un estratto di un file di input nella sezione 5 del file supplementare 2 o il file di test di input incluso nel repository IsletLab).
- Assicurarsi che il file di input non includa intestazioni di colonna. Utilizzare il file di input di esempio incluso nel repository IsletLab per seguire il protocollo, se necessario (Input_Islet_test.txt).
NOTA: I dati di input utilizzati per sviluppare gli algoritmi implementati in IsletLab sono stati ottenuti sperimentalmente come descritto in dettaglio da Hoang et al.11,12 utilizzando la colorazione DAPI per determinare le posizioni nucleari e l'immunofluorescenza per identificare i tipi cellulari. - Fare clic sul pulsante Carica isolotto iniziale e selezionare il file contenente i dati di input per generare un'isolotta iniziale, la rappresentazione 3D e le statistiche corrispondenti. In caso di errore, verrà visualizzato il seguente messaggio: "Errore durante il caricamento del file isolotto". Per risolvere il problema, ripetere il passaggio 2.1.
- Configurare il processo di ricostruzione. Fare clic sul pulsante Impostazioni di ricostruzione e modificare i parametri di ottimizzazione (vedere le sezioni 4 e 5 del File supplementare 2 per una breve descrizione dell'algoritmo e dei parametri mostrati nella finestra delle impostazioni di ricostruzione).
- Impostare la temperatura iniziale = 1, il fattore di iterazione = 1 e il fattore di accettazione = 1. Fare clic sul pulsante OK per salvare i valori dei parametri.
NOTA: Come regola generale, un aumento del parametro di temperatura, così come delle iterazioni e dei fattori di accettazione, produrrà migliori risultati di ricostruzione in termini di celle sperimentali incluse nell'isolotto ricostruito a scapito di un aumento del tempo di calcolo. - Fare clic sul pulsante Ricostruisci isolotto per aprire la finestra del registro di ricostruzione (vedere la sezione 6 del file supplementare 2 per una descrizione delle informazioni fornite nel registro di ricostruzione).
- Fare clic sul pulsante Esegui per avviare il processo di ricostruzione. Monitorare il processo di ottimizzazione fino a quando non viene visualizzato il messaggio: "Chiudi questa finestra per continuare". Chiudere la finestra del registro di ricostruzione per generare la rappresentazione visiva dell'isolotto ricostruito e per calcolare le relative statistiche (vedere la colonna di sinistra nella Figura 3A-C).
- Valutare i risultati del processo di ricostruzione analizzando le statistiche di ottimizzazione mostrate nella scheda isolotto finale del pannello statistiche. In particolare, concentrarsi sulla massimizzazione della percentuale di cellule sperimentali incluse negli isolotti ricostruiti (% di sperimentali) o equivalentemente, sulla minimizzazione del numero di sovrapposizioni (mostrato anche graficamente nel grafico di convergenza, colonna di destra nella Figura 3A-C).
- Se la % della statistica sperimentale è considerata bassa in base agli obiettivi dell'utente, riavviare IsletLab come descritto nel passaggio 9.1 e aumentare la temperatura iniziale, il fattore di iterazione e il fattore di accettazione nelle impostazioni di ricostruzione e ripetere i passaggi 2.1-2.4 fino a ottenere risultati soddisfacenti (> 95% delle cellule sperimentali). Cfr. sezioni 5-7 del fascicolo supplementare 2 per un'ulteriore descrizione del processo di ricostruzione e dei relativi risultati.
3. Identificazione dei contatti cellula-cellula
- Fate clic sul pulsante Impostazioni ricostruzione (Reconstruction Settings) e impostate il parametro Tolleranza contatto (Contact Tolerance) per definire la tolleranza di contatto cella-cella, quindi fate clic su OK per salvare i valori dei parametri.
NOTA: il parametro di tolleranza di contatto rappresenta la distanza massima tra le celle per essere considerato come a contatto. - Fare clic sul pulsante Contatti cella a cella per identificare le celle a stretto contatto. Nella scheda contatti, verificare la presenza di celle a contatto mostrate graficamente (linee nere) nel pannello grafico e le statistiche corrispondenti (ad esempio, contatti totali, omotipici ed eterotipici e contatti ɑ-ɑ, β-β, δ-δ, ɑ-β, ɑ-δ, contatti β-δ) mostrati nel pannello statistiche (vedere la colonna di sinistra della Figura 4A-C).
- Aumentare (diminuire) il parametro di tolleranza di contatto per aumentare (diminuire) il numero di contatti da cella a cella. Vedere la sezione 8 del file supplementare 2 per i dettagli sull'identificazione dei contatti cellula-cellula e i risultati associati.
4. Costruire la rete isolotta
- Fare clic sul pulsante Crea rete per generare la rete isolotta e calcolare le metriche di rete associate (vedere la colonna di destra nella Figura 4A-C).
NOTA: Un'ulteriore descrizione dei risultati relativi alla rete isolotta generata è fornita nella sezione 9 del fascicolo supplementare 2.
5. Simulazione funzionale dell'isolotto ricostruito
- Passare alla scheda Simulazione del pannello di configurazione dell'interfaccia (Figura 5).
- Selezionare la modalità di frequenza intrinseca desiderata - Costante o Casuale - e fare clic sul pulsante Configura frequenza intrinseca per definire la frequenza degli oscillatori (in Hz). Se viene selezionata una frequenza intrinseca casuale, definire la media e la deviazione (in Hz) per generare frequenze casuali normalmente distribuite (vedere la sezione 11 del file supplementare 2 per una descrizione dei parametri di simulazione).
- Selezionare la modalità desiderata della fase iniziale - Costante o Casuale. Se è selezionata una fase iniziale costante, fare clic sul pulsante Configura fase iniziale per definire la fase degli oscillatori (in radianti). Se viene selezionata una fase iniziale casuale, il sistema assegnerà fasi casuali tra 0 e 2π a tutti gli oscillatori.
NOTA: se viene selezionata una fase iniziale costante, tutti gli oscillatori verranno inizializzati in fase. - Fare clic sul pulsante Configura interazioni per definire i parametri di interazione da cella a cella nella finestra di intensità dell'interazione. Per una descrizione dei parametri di interazione, vedere la sezione 11 del file supplementare 2.
- Configurare la simulazione definendo il tempo totale di simulazione (in s), il passo temporale (in s) e il fattore di salvataggio (numero di passaggi tra i punti dati salvati). Nella simulazione mostrata nella Figura 5 il tempo totale era di 20000 s, con un passo temporale di 0,1 s e un fattore di risparmio di 500.
- Definire il numero di blocchi, thread e funzionalità della piattaforma di elaborazione disponibili per eseguire la simulazione. Definire questi parametri in base alle caratteristiche specifiche dell'unità di elaborazione grafica (GPU) disponibile.
NOTA: nell'esempio illustrato nella Figura 5, sono stati utilizzati 36 blocchi e 64 thread per blocco (2304 core della piattaforma di elaborazione) poiché è stata utilizzata una GPU con 36 multiprocessori e 64 core della piattaforma di elaborazione per multiprocessore. Il valore del parametro di capacità della piattaforma di elaborazione utilizzato era 75 poiché la capacità della piattaforma di elaborazione hardware era 7,5 (vedere la sezione 10 del file supplementare 2 per i dettagli su questi parametri). - Fare clic sul pulsante Esegui simulazione per aprire la finestra del registro di simulazione. Fare clic sul pulsante Esegui per avviare la simulazione e monitorare il processo fino a quando non viene visualizzata la legenda: "Chiudi la finestra per continuare". Vedere la sezione 12 del file supplementare 2 per i dettagli sul registro di simulazione.
- Chiudere la finestra del registro di simulazione per osservare i risultati della simulazione (vedere la Figura 5). I dettagli sui risultati della simulazione sono forniti nella sezione 13 del file supplementare 2.
6. Salva il progetto (facoltativo)
- Fare clic su File > Esporta progetto nella barra dei menu. Selezionare la directory in cui verrà salvato il file di progetto e fare clic sul pulsante OK .
Nota : il nome del file di progetto viene determinato automaticamente in base al nome del file di dati iniziale. Se il progetto non viene salvato, tutti i risultati e i file correlati verranno eliminati automaticamente. - Caricare un progetto esportato facendo clic su File > Carica progetto.
7. Salva cifre (opzionale)
- Fare clic sull'icona Salva plottaggio disponibile nella barra degli strumenti di stampa per salvare la visualizzazione corrente in un file di immagine. Ripetere questo passaggio per tutte le figure create durante il protocollo.
NOTA: le visualizzazioni di grafici e isole possono essere modificate utilizzando le icone disponibili sulla barra degli strumenti di stampa del pannello grafico.
8. Carica progetto (opzionale)
- Fare clic su File > Carica progetto nel menu principale e selezionare un file di progetto salvato in precedenza come descritto nei passaggi 6.1-6.2.
NOTA: un progetto non verrà caricato correttamente se il file di progetto è stato modificato esternamente. Se un progetto viene caricato correttamente, saranno disponibili solo le funzionalità di simulazione.
9. Riavviare il processo di ricostruzione e analisi (facoltativo)
- In qualsiasi momento l'utente può selezionare File > Riavvia per scartare tutti i risultati e avviare una nuova ricostruzione e analisi.
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Representative Results
La ricostruzione delle isole pancreatiche utilizzando la metodologia proposta da Félix-Martínez et al.19 dipende fortemente dai parametri dati all'algoritmo di ottimizzazione (definito nelle impostazioni di ricostruzione). Un esempio di questo è mostrato visivamente nella Figura 3 dove vengono mostrati gli isolotti ricostruiti ottenuti utilizzando diversi insiemi di parametri. In primo luogo, nella Figura 3A, viene mostrata una ricostruzione che includeva l'86,6% delle celle incluse nei dati iniziali (509 su 588 celle, temperatura iniziale = 1, fattore di iterazione = 1, fattore di accettazione = 1). Quando la temperatura iniziale e i fattori di iterazione e accettazione sono aumentati (temperatura iniziale = 10, fattore di iterazione = 5 e fattore di accettazione = 5, Figura 3B), una percentuale più alta (93,37%) di cellule iniziali è stata inclusa nelle isole ricostruite (cioè 549 su 588 celle). Risultati ancora migliori possono essere ottenuti se si utilizzano valori molto più elevati, in particolare per i fattori di iterazione e accettazione, come illustrato nella Figura 3C (temperatura iniziale = 10, fattore di iterazione = 1000, fattore di accettazione = 500), dove l'isolotto ricostruito è composto dal 99,15% delle celle iniziali (583 su 588 celle). I grafici di convergenza (colonna di destra in Figura 3A-C), che mostrano l'evoluzione delle celle sovrapposte in funzione della temperatura, devono essere valutati per determinare come i parametri influenzano il processo di ottimizzazione. Come regola generale, i fattori di interazione e accettazione devono essere aumentati quando l'isolotto ricostruito include una bassa percentuale di cellule iniziali. Di conseguenza, il tempo di calcolo aumenterà inevitabilmente, poiché questi fattori aumentano direttamente il numero di iterazioni valutate. Ad esempio, il tempo di calcolo della prima ricostruzione sopra descritta era di 6 s. Al contrario, i tempi di calcolo della seconda e della terza ricostruzione sono stati rispettivamente di 21 s e 24 min 6 s.
Figura 3: Ricostruzione di isole utilizzando insiemi di parametri non ottimali nelle impostazioni di ricostruzione L'utilizzo di insiemi di parametri non ottimali potrebbe portare a una bassa percentuale di cellule sperimentali nelle isole ricostruite. (A) A sinistra: l'86,6% delle cellule sperimentali sono state incluse nell'isolotto ricostruito (temperatura iniziale = 1, fattore di iterazione = 1, fattore di accettazione = 1, tempo di calcolo = 6 s). A destra: trama di convergenza del processo di ricostruzione. (B) A sinistra: il 93,4% delle cellule sperimentali sono state incluse nell'isolotto ricostruito (temperatura iniziale = 10, fattore di iterazione = 10, fattore di accettazione = 5, tempo di calcolo = 21 s). A destra: trama di convergenza del processo di ricostruzione. (C) A sinistra: il 99,15% delle cellule sperimentali sono state incluse nell'isolotto ricostruito (temperatura iniziale = 10, fattore di iterazione = 1000, fattore di accettazione = 500, tempo di calcolo = 24 min, 8 s). A destra: trama di convergenza del processo di ricostruzione. Le frecce nei grafici di convergenza indicano il numero iniziale e finale di celle sovrapposte del processo di ricostruzione (prima della fase di post-elaborazione dell'algoritmo di ricostruzione). Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
L'identificazione dei contatti cellula-cellula dall'isolotto ricostruito dipende dal valore del parametro di tolleranza di contatto (definito nelle impostazioni di ricostruzione) come illustrato nella Figura 4A-C, dove vengono presentati i contatti cellula-cellula (rappresentati da linee nere), identificati dalle architetture ricostruite mostrate in Figura 3A-C. Ad esempio, se viene definita una tolleranza di contatto di 1 μm, come nella Figura 4A, vengono identificati solo 290 contatti cellula-cellula. Al contrario, se la tolleranza di contatto è aumentata a 2 μm, come nella Figura 4B,C, i contatti totali identificati sono aumentati rispettivamente a 636 e 731 (vedere il pannello statistico nella Figura 4A-C). Queste differenze possono anche essere notate nella rappresentazione visiva dei contatti da cella a cella mostrata nella colonna di sinistra della Figura 4A-C, poiché il numero di contatti tra le celle aumenta chiaramente man mano che viene utilizzato un valore più elevato della tolleranza di contatto. Vale la pena sottolineare che il numero di contatti dipende anche dal numero di celle incluse negli isolotti ricostruiti e, pertanto, la combinazione del parametro di temperatura, delle iterazioni e dei fattori di accettazione e della tolleranza di contatto determinano in definitiva la connettività dell'isolotto ricostruito, che si riflette sulle reti di isolotti formate e sulle metriche di rete corrispondenti, come mostrato nella colonna di destra della Figura 4A-C. Il grafico di rete consente all'utente di visualizzare come sono collegate le diverse celle. Quantitativamente, le proprietà di connettività dell'isolotto sono descritte in termini delle seguenti metriche di rete: grado medio, densità, coefficiente medio di clustering, efficienza e diametro (i dettagli su queste metriche possono essere consultati nella sezione 9 del file supplementare 2).
Figura 4: Effetto del parametro di tolleranza di contatto nell'identificazione dei contatti cellula-cellula. (A-C) A sinistra: contatti cellula-cellula identificati dalle isole ricostruite mostrate nella Figura 3A-C (290, 636 e 731 contatti totali nei pannelli A, B e C, rispettivamente). I valori utilizzati per il parametro di tolleranza di contatto erano 1 μm (A) e 2 μm (B e C). Si noti che il numero di cellule incluse nelle isole ricostruite influisce anche sul numero di contatti cellula-cellula identificati. A destra: le reti generate dai contatti cell-to-cell sono mostrate nella colonna di sinistra corrispondente. Si noti che l'impatto della connettività sulle metriche di rete è evidenziato nel pannello delle statistiche. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Infine, una volta ricostruita l'isolotto e identificati i contatti cell-to-cell, è possibile eseguire una simulazione funzionale (solo quando è disponibile una GPU compatibile). I risultati tipici della simulazione sono mostrati nella Figura 5, comprese le oscillazioni sommate delle diverse popolazioni cellulari (ɑ, β e δ celle) e dell'intero isolotto (grafico superiore del pannello grafico nella Figura 5). Questa figura mostra le differenze di fase nel tempo tra le diverse popolazioni cellulari come risultato delle proprietà di connettività e interazione e consente all'utente di determinare il contributo di ciascuna popolazione cellulare (linee rosse, verdi e blu) al comportamento oscillatorio dell'intero isolotto (linea nera). Ad esempio, il pannello superiore della Figura 5 suggerisce che, a livello di popolazione, le cellule ɑ e β oscillano completamente fuori fase, mentre le cellule δ oscillano fuori fase con ɑ e β-celle. Inoltre, secondo la simulazione, il comportamento oscillatorio dell'isolotto è dominato dalle oscillazioni delle cellule ɑ, sebbene si possa notare anche l'effetto delle altre popolazioni cellulari. Si noti che i segnali oscillatori di tutte le celle insulari vengono salvati automaticamente in un file di dati (vedere Tabella 1 e sezione 13 nel File supplementare 2), consentendo così all'utente di eseguire un'analisi dettagliata dei risultati della simulazione. Come complemento, viene calcolato e visualizzato anche l'indice di sincronizzazione delle isole, che riflette la coerenza di fase delle oscillazioni (grafico in basso del pannello grafico nella Figura 5). Si noti che l'indice di sincronizzazione varia da 0 a 1, dove 0 e 1 indicano rispettivamente una sincronizzazione nulla e totale tra tutte le celle dell'isolotto. Il grafico dell'indice di sincronizzazione può quindi essere interpretato come una visualizzazione di come la sincronicità tra le celle insulari varia nel tempo a causa delle proprietà di connettività e interazione dell'isolotto ricostruito. Poiché la simulazione eseguita si basa sull'idea di oscillatori accoppiati12 e dipende fortemente dalla connettività dell'isolotto ricostruito, è fondamentale raggiungere una ricostruzione isolotta accettabile e una connettività cellula-cella prima di eseguire una simulazione funzionale.
Figura 5: I parametri di simulazione sono definiti nel pannello di configurazione della scheda simulazione. I risultati della simulazione sono mostrati nella scheda simulazione del pannello grafico dove sono mostrati il comportamento oscillatorio sommato delle diverse popolazioni di celle (ɑ, β e δ) e l'intero isolotto (in alto). Viene mostrato anche l'indice di sincronizzazione, una misura della coerenza di fase tra le celle insulari (in basso). Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Vale la pena ricordare che praticamente in ogni fase del processo vengono generati file di dati. Una descrizione dei file di dati generati è disponibile nella tabella 1 e nel fascicolo supplementare 2.
| File | Descrizione |
| IsletFileName | Dati di input (forniti dall'utente) |
| IsletFileName_initial.txt | Architettura iniziale dell'isolotto proposta dall'algoritmo come fase iniziale della ricostruzione |
| IsletFileName_reconstructed.txt | Isolotto ricostruito (non posptrocesso) |
| IsletFileName_postprocessed_islet.txt | Isolotto finale ricostruito e isolotto post-bonificato |
| IsletFileName_processlog.txt | Log di ricostruzione (algoritmo di ottimizzazione) |
| IsletFileName_overlapped_cells.txt | Celle sovrapposte alla fine del processo di ricostruzione (post-elaborazione) |
| IsletFileName_all_contacts.txt | Matrice di adjancency di tutti i contatti |
| IsletFileName_aa_contacts.txt | Matrice di adistanza dei contatti ɑ-ɑ |
| IsletFileName_ab_contacts.txt | Matrice di adiancency dei contatti ɑ-β |
| IsletFileName_ad_contacts.txt | Matrice di adiancency dei contatti ɑ-δ |
| IsletFileName_bbbd_contacts.txt | Matrice di adienza dei contatti β-β e β-δ |
| IsletFileName_bb_contacts.txt | Matrice di adienza dei contatti β-β |
| IsletFileName_bd_contacts.txt | Matrice di adienza dei contatti β-δ |
| IsletFileName_dd_contacts.txt | Matrice di adienza dei contatti δ δ |
| IsletFileName_Kmat.txt | Matrice di interazione utilizzata nella simulazione |
| IsletFileName_kuramoto_angles.txt | Risultati della simulazione Kuramoto |
Tabella 1: Descrizione dei file salvati come parte del file di progetto. Si noti che il nome file utilizzato per salvare i file di progetto viene definito automaticamente dal file di dati iniziale selezionato dall'utente.
Fascicolo complementare 1: Descrizione grafica del protocollo utilizzando i pannelli di controllo di IsletLab. Fare clic qui per scaricare questo file.
Fascicolo complementare 2: Documentazione IsletLab. Fare clic qui per scaricare questo file.
Fascicolo complementare 3: Include tutti i file necessari per installare IsletLab. Fare clic qui per scaricare questo file.
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Discussion
Il protocollo di cui sopra delinea un approccio pratico per ricostruire e analizzare le architetture delle isole pancreatiche utilizzando nuovi algoritmi computazionali. L'obiettivo principale di questo lavoro è quello di consentire alla comunità di ricerca sulle isole di ricavare metriche quantitative per caratterizzare le proprietà morfologiche e di connettività delle architetture delle isole pancreatiche e per valutare le possibili implicazioni funzionali di tali proprietà attraverso simulazioni computazionali.
Mentre gli algoritmi adottati in questo protocollo sono stati precedentemente descritti in dettaglio12,19, è mancata un'implementazione diretta e user-friendly a causa della loro relativa complessità, limitando così il loro utilizzo come strumento complementare al lavoro sperimentale e teorico.
In primo luogo, un recente algoritmo proposto da Félix-Martínez et al.19 viene utilizzato per ricostruire le architetture delle isole da dati sperimentali (ad esempio, coordinate nucleari e tipo di cellula). Di conseguenza, l'utente ottiene un'architettura isolotta composta da celle sferiche non sovrapposte con raggi assegnati automaticamente in base alle distribuzioni sperimentali riportate. In pratica, l'algoritmo di ricostruzione è una procedura di ottimizzazione iterativa che diventa costosa dal punto di vista computazionale all'aumentare del numero di cellule nell'isolotto. Per questo motivo, si consiglia vivamente di utilizzare un sistema multiprocessore per sfruttare l'implementazione dell'elaborazione parallela dell'algoritmo descritto in questo protocollo. Come descritto sopra, un passo fondamentale per il processo di ricostruzione è definire valori appropriati per i parametri coinvolti (ad esempio, iterazioni, fattori di accettazione e temperatura iniziale), poiché il tempo di calcolo sarà direttamente correlato al numero di iterazioni eseguite, oltre al numero di processi paralleli utilizzati (ad esempio, parametro thread nelle impostazioni di ricostruzione). Se il tempo di calcolo non è un problema, si consiglia vivamente di utilizzare i valori più alti possibili per le iterazioni e i fattori di accettazione al fine di aumentare il numero di iterazioni eseguite.
I prossimi passi del protocollo sono l'identificazione dei contatti cellula-cellula e la generazione della rete isolotta. Entrambi i passaggi sono direttamente correlati al processo di ricostruzione e come tali, il numero di celle incluse negli isolotti ricostruiti (e quindi i parametri coinvolti), così come il valore della tolleranza di contatto utilizzata, è la chiave per ottenere i migliori risultati possibili.
Infine, se desiderato dall'utente, le simulazioni funzionali possono essere eseguite attraverso l'implementazione del modello di oscillatori accoppiati proposto da Hoang et al.12 utilizzando la rete di connettività derivata dal processo di ricostruzione per configurare il sistema oscillatorio. Dato che il processo di simulazione prevede la risoluzione di un sistema di centinaia o migliaia di equazioni differenziali accoppiate (una per ogni cella dell'isolotto), l'algoritmo di simulazione è stato implementato sfruttando la possibilità di eseguire calcoli paralleli utilizzando la GPU, consentendo così all'utente di simulare simulazioni considerevolmente lunghe in un tempo di calcolo relativamente breve. I passaggi chiave nella fase di simulazione del protocollo sono determinare il numero appropriato di blocchi e thread disponibili nella sezione delle impostazioni della piattaforma di calcolo del pannello di simulazione, un aspetto direttamente correlato alle caratteristiche dell'hardware utilizzato. Gli altri parametri coinvolti (frequenza intrinseca, fase iniziale e punti di forza di interazione nel pannello di simulazione), sebbene rilevanti per i risultati della simulazione, sono principalmente correlati al problema in esame e devono essere definiti dall'utente dopo un'attenta considerazione al fine di rappresentare lo scenario di simulazione desiderato.
Nonostante i vantaggi offerti dal protocollo, alcune limitazioni devono essere riconosciute. In primo luogo, i parametri relativi al processo di ricostruzione e all'identificazione dei contatti cellula-cellula non sono univoci e potrebbero variare da caso a caso. Per questo motivo, sebbene sia possibile utilizzare una regola empirica per determinare il valore dei parametri richiesti, un approccio per tentativi ed errori è ancora inevitabile. Un altro aspetto che potrebbe limitare l'applicabilità del protocollo sono le risorse computazionali necessarie, in particolare per le fasi di ricostruzione e simulazione del protocollo. Nonostante queste limitazioni, il fatto che la conoscenza della programmazione non sia necessaria per l'implementazione del protocollo consente ai ricercatori di diversa estrazione di utilizzare prontamente gli algoritmi proposti che altrimenti rimarrebbero oscuri per l'utente non specializzato.
I potenziali usi del protocollo proposto includono la visualizzazione di dati sperimentali, l'analisi comparativa di isole normali e alterate (ad esempio, in presenza di diabete di tipo 1 o 2), o anche il confronto tra isole di specie diverse utilizzando metriche morfologiche quantitative, strutturali e basate sulla rete23. Inoltre, le isole ricostruite utilizzando il protocollo qui delineato possono essere facilmente utilizzate per generare modelli matematici funzionali dettagliati in cui la connettività e le dimensioni delle cellule determinate dall'algoritmo di ricostruzione sono integrate con modelli elettrofisiologici dettagliati delle cellule pancreatiche per chiarire le implicazioni funzionali della comunicazione intercellulare all'interno delle isole ricostruite.
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Disclosures
Gli autori non hanno nulla da rivelare.
Acknowledgments
G.J. Félix-Martínez ringrazia CONACYT (Consejo Nacional de Ciencia y Tecnología, México) e il Dipartimento di Ingegneria Elettrica dell'Universidad Autónoma Metropolitana (Città del Messico) per il sostegno dato a questo progetto. Ringraziamo il Dr. Danh-Tai Hoang, il Dr. Manami Hara e il Dr. Junghyo Jo per il loro eccezionale lavoro e la generosità nel condividere le architetture degli isolotti che hanno reso possibile questo lavoro con la comunità di ricerca.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| CUDA-capable NVIDIA graphics card | Required for the functional simulations | ||
| IsletLab | https://github.com/gjfelix/IsletLab (Follow the instructions to download and install the application.) |
References
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