Traduzindo ribossomos decodificam três nucleotídeos por codon em peptídeos. Seu movimento ao longo do mRNA, capturado pelo perfil ribossomo, produz as pegadas exibindo periodicidade trigêmea característica. Este protocolo descreve como usar o RiboCode para decifrar esse recurso proeminente de dados de criação de perfil ribossomos para identificar quadros de leitura abertos traduzidos ativamente no nível de transcriptome inteiro.
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Artigo de método
De novo Identificação de quadros de leitura abertos traduzidos ativamente com dados de perfil ribossomo
* These authors contributed equally
Neste artigo
Resumo
Resumo
A identificação de quadros de leitura aberto (ORFs), especialmente aqueles que codificam pequenos peptídeos e sendo ativamente traduzidos em contextos fisiológicos específicos, é fundamental para anotações abrangentes de translatomes dependentes do contexto. O perfil ribossomo, uma técnica para detectar os locais de ligação e densidades de tradução de ribossomos no RNA, oferece uma avenida para descobrir rapidamente onde a tradução está ocorrendo na escala de todo o genoma. No entanto, não é uma tarefa trivial na bioinformática identificar de forma eficiente e abrangente os ORFs de tradução para o perfil ribossomo. Descrito aqui é um pacote fácil de usar, chamado RiboCode, projetado para procurar traduzir ativamente ORFs de qualquer tamanho a partir de sinais distorcidos e ambíguos em dados de perfil ribossomos. Tomando nosso conjunto de dados publicado anteriormente como exemplo, este artigo fornece instruções passo a passo para todo o pipeline RiboCode, desde o pré-processamento dos dados brutos até a interpretação dos arquivos finais de resultado de saída. Além disso, para avaliar as taxas de tradução dos ORFs anotados, procedimentos de visualização e quantificação de densidades ribossósas em cada ORF também são descritos em detalhes. Em resumo, o presente artigo é uma instrução útil e oportuna para os campos de pesquisa relacionados à tradução, pequenos ORFs e peptídeos.
Introdução
Recentemente, um corpo crescente de estudos revelou a produção generalizada de peptídeos traduzidos de ORFs de genes codificadores e os genes anteriormente anotados como não codificação, como RNAs de não codificação longa (lncRNAs)1,2,3,4,5,6,7,8. Esses ORFs traduzidos são regulados ou induzidos por células a responder a mudanças ambientais, estresse e diferenciação celular1,8,9,1....
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Protocolo
1. Configuração do ambiente e instalação do RiboCode
- Abra uma janela de terminal Linux e crie um ambiente conda:
conda criar -n RiboCode python=3.8 - Mude para o ambiente criado e instale o RiboCode e as dependências:
conda ativar RiboCode
conda instalar -c bioconda ribocode ribominer sra-tools fastx_toolkit cutadapt bowtie star samtools
2. Preparação de dados
- Pegue arquivos de referência de genoma.
- Para a sequência de referência, acesse o site do Ensemble em https://www.ensembl.org/index.html, clique no menu supe....
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Resultados
Os conjuntos de dados de perfil ribossosome foram depositados no banco de dados GEO sob o número de adesão GSE131074. Todos os arquivos e códigos usados neste protocolo estão disponíveis nos arquivos suplementares 1-4. Aplicando o RiboCode a um conjunto de conjuntos de dados de perfil ribossosome publicado23, identificamos os novos ORFs traduzidos ativamente em células MCF-10A tratadas com controle e siRNAs EIF3E. Para selecionar as leitu.......
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Discussão
O perfil ribossomo oferece uma oportunidade sem precedentes para estudar a ação dos ribossomos nas células em uma escala de genoma. Decifrar precisamente as informações transportadas pelos dados de criação de perfil ribossomos poderia fornecer informações sobre quais regiões de genes ou transcrições estão traduzindo ativamente. Este protocolo passo a passo fornece orientações sobre como usar o RiboCode para analisar os dados de perfil ribossomo em detalhes, incluindo instalação de pacotes, preparação de dados, execução d.......
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Divulgações
Os autores não têm conflitos de interesse para divulgar.
Agradecimentos
Os autores gostariam de reconhecer o apoio dos recursos computacionais fornecidos pela plataforma HPCC da Universidade Xi'an Jiaotong. Z.X. agradece com gratidão ao Plano de Apoio ao Talento Jovem Topnotch da Universidade Xi'an Jiaotong.
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Materiais
| Nome | Empresa | Número de catálogo | Comentários |
|---|---|---|---|
| Um computador/servidor executando Linux | Any | - | - |
| Anaconda ou Miniconda | Anaconda-Anaconda | : https://www.anaconda.com; Miniconda:https://docs.conda.io/en/latest/miniconda.html | |
| R | R R | Foundation-https://www.r-project.org/ | |
| Rstudio | Rstudio-https://www.rstudio.com/ |
Referências
- Eisenberg, A. R., et al. Translation Initiation Site Profiling Reveals Widespread Synthesis of Non-AUG-Initiated Protein Isoforms in Yeast. Cell Systems. 11 (2), 145-160 (2020).
- Spealman, P., et al.
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Reimpressões e permissões
