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Artigo de método

Medição da taxa de consumo de oxigênio em fatias estriatais agudas de camundongos adultos

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DOI:

10.3791/63379

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8 de junho de 2022

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1Department of Neuroscience, Thomas Jefferson University, 2School of Biomedical Engineering, Drexel University, 3Department of Pathology, MitoCare Center, Thomas Jefferson University, 4School of Life Sciences, Peking University

Neste artigo

Resumo

A taxa de consumo de oxigênio (OCR) é um proxy comum para a função mitocondrial e pode ser usada para estudar diferentes modelos de doenças. Desenvolvemos um novo método usando um analisador Seahorse XF para medir diretamente o OCR em fatias estriatais agudas de camundongos adultos que é mais fisiologicamente relevante do que outros métodos.

Resumo

Mitocôndrias desempenham um papel importante na produção de ATP celular, regulação reativa de espécies de oxigênio e controle de concentração de Ca2+ . A disfunção mitocondrial tem sido implicada na patogênese de múltiplas doenças neurodegenerativas, incluindo a doença de Parkinson (DP), a doença de Huntington e a doença de Alzheimer. Para estudar o papel das mitocôndrias em modelos dessas doenças, podemos medir a respiração mitocondrial via taxa de consumo de oxigênio (OCR) como proxy para a função mitocondrial. OCR já foi medido com sucesso em culturas celulares, bem como mitocôndrias isoladas. No entanto, essas técnicas são menos fisiologicamente relevantes do que medir OCR em fatias cerebrais agudas. Para superar essa limitação, os autores desenvolveram um novo método utilizando um analisador Seahorse XF para medir diretamente o OCR em fatias estriatais agudas de camundongos adultos. A técnica é otimizada com foco no estriato, uma área cerebral envolvida na DP e na doença de Huntington. O analisador realiza um ensaio de célula viva usando uma placa de 24 poços, o que permite a medição cinética simultânea de 24 amostras. O método usa pedaços circulares de fatias cerebrais estriatais como amostras. Demonstramos a eficácia desta técnica identificando um OCR basal inferior em fatias estriais de um modelo de rato de DP. Este método será de amplo interesse para pesquisadores que trabalham no campo da DP e da doença de Huntington.

Introdução

A disfunção mitocondrial tem sido implicada em várias doenças neurológicas, incluindo a doença de Parkinson (DP), doença de Huntington e doença de Alzheimer 1,2,3. Modelos PD como camundongos e ratos pink1 knockout (KO) exibem função mitocondrial prejudicadafunção 4,5,6,7,8,9,10,11. Mitocôndrias isoladas do estrias (STR) ou cérebro inteiro do camundongo PINK1 KO envelhecem exibem defeitos no complexo I 7,10,12,13. Medir diretamente a taxa de consumo de oxigênio (OCR) é um dos métodos mais comuns para avaliar a função mitocondrial, uma vez que o OCR está associado à produção de ATP, a principal função das mitocôndrias14. Portanto, medir o OCR em modelos de doenças ou amostras/tecidos derivados do paciente pode ajudar a investigar como a disfunção mitocondrial leva à doença.

Atualmente, existem várias maneiras de medir o OCR mitocondrial, incluindo o eletrodo Clark e outros eletrodos O2, corante fluorescente O2, e o analisador de fluxo extracelular 15,16,17,18,19. Como vantagem, os métodos baseados em eletrodos O2 permitem que vários substratos sejam facilmente adicionados. No entanto, são insuficientes para medir simultaneamente várias amostras. Comparado aos métodos tradicionais baseados em eletrodos O2, o analisador de fluxo extracelular, uma ferramenta comumente usada para OCR em culturas celulares ou mitocôndrias purificadas, oferece melhor throughput 15,18,20. No entanto, todos esses métodos são geralmente aplicados para medir o OCR em mitocôndrias isoladas ou culturas celulares 6,16,17,19,20,21. O isolamento das mitocôndrias causa danos inadvertidos, e mitocôndrias extraídas ou culturas celulares são menos relevantes fisiologicamente do que as fatias cerebrais intactas22. Mesmo quando microeletrodos são usados em fatias, eles são menos sensíveis e mais difíceis de operar do que em células cultivadas23.

Para enfrentar esses desafios, desenvolvemos um método utilizando o analisador de fluxo extracelular XF24, que permite a análise de múltiplos parâmetros metabólicos a partir de fatias cerebrais estriais agudas de camundongos24. Esta técnica fornece quantificação contínua direta da respiração mitocondrial através do OCR. Em suma, pequenas seções de fatias cerebrais striatais são colocadas em poços da placa de ilhota, e o analisador usa biosensores à base de oxigênio e prótons fluorescentes para medir a taxa de acidificação OCR e extracelular, respectivamente 17,21,25.

Uma das características únicas do analisador são os quatro poços de injeção, que permitem a medição contínua do OCR enquanto injetam sequencialmente até quatro compostos ou reagentes; isso permite a medição de vários parâmetros de respiração celular, como OCR mitocondrial basal, OCR ligado a ATP e OCR mitocondrial máximo. Os compostos injetados durante as medições para o protocolo aqui mostrado foram concentrações de trabalho de piruvato de 10 mM na primeira solução bem (porta A), 20 μM de oligomicina na segunda solução bem (porta B), 10 μM cianeto de carbonil 4-(trifluorometoxy) fenilhidrazone (FCCP) no terceiro poço (porta C), e 20 μM antimicina A no quarto poço (porta D), com base em Fried et al.25. Deve-se notar que essas concentrações foram concentrações de trabalho, e soluções de estoque de 10x, 11x, 12x e 13x foram injetadas nas portas de solução A a D, respectivamente. O objetivo de utilizar cada solução foi o seguinte: 1) O piruvato foi necessário, pois, sem ela, a adição de FCCP teria uma resposta OCR reduzida causada por uma limitação dos substratos disponíveis; 2) A oligomicina inibe a synthase ATP e permite a medição da respiração ligada ao ATP; 3) A FCCP desacoplula a oxidação da fosforilação e permite a medição da capacidade mitocondrial máxima; 4) A antimicina inibe o complexo III na cadeia de transporte de elétrons e, portanto, permite a medição do OCR não ligado às mitocôndrias.

A concentração de oligomicina utilizada foi determinada com base nas seguintes razões: 1) A dose recomendada de oligomicina para a maioria dos tipos de células (mitocôndrias isoladas ou culturas celulares) é de 1,5 μM. Pela experiência, geralmente 3x-10x da dose de células dissociadas é usado para os experimentos de fatia, uma vez que pode haver um gradiente, e a penetração da solução nas fatias leva tempo. Portanto, a concentração deve estar na faixa de 5 μM a 25 μM. 2) Foi selecionada uma concentração de 20 μM com base em Fried et al.25. Maiores concentrações não foram tentadas devido à toxicidade não específica da oligomicina. 3) No relatório de Underwood et al.26, os autores fizeram um experimento de titulação para oligomicina e descobriram que as doses em 6,25, 12,5, 25 e 50 μg/mL resultaram em inibição semelhante. A maior concentração de oligomicina (50 μg/mL) não inibiu mais, mas apresentou maior variância. 4) Em nossa observação, o fator determinante parece ser a capacidade penetrante da oligomicina. É difícil para a oligomicina penetrar no tecido, e é por isso que leva pelo menos 7 a 8 ciclos para chegar ao planalto, a resposta máxima. Desde que atinja o planalto, a inibição é assumida como máxima.

Um dos principais desafios técnicos da adaptação do analisador de fluxo extracelular para medir OCR em fatias estriais é prevenir a hipóxia tecidual. Como o tampão não foi oxigenado durante toda a duração das medições (cerca de 4h), a hipóxia foi um problema central. Isso é especialmente verdadeiro para amostras de tecido mais espessas, onde o oxigênio não pode se difundir em todas as amostras. Para superar esse problema, as fatias foram seccionadas com 150 μm de espessura, para que o oxigênio ambiente pudesse penetrar no meio das fatias cerebrais. Além disso, 4 mg/mL de soro bovino albumina (BSA) foi adicionado ao buffer de fluido cerebrospinal artificial pré-oxigenado (ACSF), o que facilitou a determinação do OCR máximo, como sugerido anteriormente23. Examinamos se as células estavam vivas. Primeiro, hoechst 33258 (10 μM) e iodeto de propidium (10 μM) foram usados para examinar se as células eram saudáveis nessas condições. Em seguida, examinamos se os neurônios espinhosos médios eram funcionalmente saudáveis usando a gravação de grampo de remendo. Avaliamos ainda se os terminais de dopamina (DA) nas fatias estriais eram funcionalmente saudáveis, medindo a liberação de DA usando voltammemetria de varredura rápida. Os resultados mostraram que as fatias estriais que não estavam oxigenadas (grupo ACSF/BSA) eram tão saudáveis quanto o grupo de controle oxigenado24.

Em seguida, testamos diferentes combinações de espessura de fatia e tamanho do soco para determinar as condições ideais de fatia striatal para o ensaio de respiração de fluxo. Foram utilizadas fatias estriais dorsais com espessuras diferentes (150 μm e 200 μm) e tamanhos de perfuração (1,0 mm, 1,5 mm e 2,0 mm de diâmetro) para análise de OCR utilizando o analisador. As fatias striatais de 150 μm de espessura com um tamanho de soco de 1,5 mm de diâmetro tiveram a maior eficiência de acoplamento e OCRs dentro de uma faixa ideal para o analisador24.

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Protocolo

Todos os procedimentos, incluindo o trabalho animal, foram conduzidos de acordo com as diretrizes nacionais e internacionais e foram aprovados pelo Comitê de Cuidado e Uso de Animais da Universidade Thomas Jefferson. Foram utilizados camundongos FVB/NTac masculinos de 3 a 14 meses. As etapas a seguir foram realizadas em um ambiente não estéril, mas deve-se tomar cuidado para manter tudo o mais limpo possível.

NOTA: O método aqui apresentado foi estabelecido e utilizado na pesquisa relatada por Zhi et al.24. Os experimentos descritos aqui utilizaram um analisador de fluxo extracelular Seahorse XF24 (ver Tabela de Materiais). Esses métodos podem ser adaptados para o analisador XFe24, e alguns resultados foram confirmados usando este analisador.

1. Hidrate os sensores do cartucho (1 dia antes do ensaio)

  1. Abra o kit de ensaio de fluxo extracelular (ver Tabela de Materiais) e remova tanto o cartucho do sensor (verde) quanto a placa de utilidade (claro; Figura 1A). Coloque o cartucho do sensor de lado (sensores para cima) e não toque nos sensores.
  2. Adicione 600 μL de solução calibrante (pH 7.4) a cada poço da placa de utilidade. Coloque o cartucho do sensor em cima da placa de utilidade e submerse os sensores na solução calibrante. Certifique-se de que o entalhe triangular do utilitário e da placa do cartucho do sensor estejam corretamente alinhados (Figura 1B).
  3. Sele o kit de ensaio de fluxo extracelular com filme de vedação para evitar a evaporação da solução calibrante e, em seguida, coloque-o em uma incubadora de 37 °C não suplementada com CO2 ou oxigênio durante a noite.

2. Prepare a placa de tecido (no dia do ensaio)

  1. Abra a microplacão de captura de ilhotas e tire a placa de ilhota para sentar o tecido.
  2. Aqueça um volume apropriado (625 μL por poço) de fluido cerebrospinal artificial modificado pré-oxigenado (ACSF, composição 140 mM NaCl, 2,5 mM KCl, 2,4 mM CaCl2, 1,3 mM MgSO4, 0,3 mM KH2PO4, 25 mM de glicose, 10 mM HEPES, pH 7,2) tampão a 37 °C em um tubo de 50 mL. Em seguida, adicione BSA a uma concentração final de 4 mg/mL para preparar o tampão de respiração. Em geral, 50 mL é suficiente para uma placa.
  3. Adicione 625 μL de tampão de respiração (tampão ACSF pré-oxigenado com glicose de 25 mM e 4 mg/mL BSA) a cada poço da placa de ilhota cuidadosamente e evite agitar a placa. Certifique-se de que não há gotas residuais em cima do cartucho do sensor e que não há bolhas de ar no buffer de cada poço.

3. Preparação aguda de fatia striatal e colocação de fatias extirpadas

  1. Decapitar o camundongo após a luxação cervical e dissecar imediatamente o cérebro em 10 mL de solução de corte pré-oxigenada gelada (125 mM NaCl, 2,5 mM KCl, 26 mM NaHCO3, 3,7 mM MgSO4, 0,3 mM KH2PO4, 10 mM de glicose, pH 7.4).
  2. Seção de estrias coronárias com um vibratome seguindo a instrução do fabricante (ver Tabela de Materiais) a uma espessura de 150 μm em solução de corte pré-oxigenada e gelada.
  3. Recupere as fatias em 50 mL de ACSF oxigenado (125 mM NaCl, 2,5 mM KCl, 26 mM NaHCO3, 2,4 mM CaCl2, 1,3 mM MgSO4, 0,3 mM KH2PO4, 10 mM de glicose, 2 mM HEPES, pH 7.4) e manter em solução até 30 min à temperatura ambiente (RT).
  4. Após a recuperação, transfira as fatias para uma placa de Petri de 35 mm x 10 mm com 5 mL de tampão de respiração.
  5. Use um soco de biópsia de aço inoxidável (por exemplo, 1,5 mm de diâmetro) para criar um pedaço circular de tecido na área desejada do cérebro fatiado. Mantenha a fatia no buffer enquanto pressione suavemente com o soco. Certifique-se de que o soco é empurrado para baixo com força suficiente para cortar o tecido. Remova o resto do tecido, levante o soco e remova o pedaço circular de tecido no tampão.
  6. Corte a extremidade de uma ponta de pipeta de 1 mL para fazer um orifício com um diâmetro de 1,5-2,0 mm e use-o para segurar e transferir a fatia perfurada para a parte superior da tela de captura. Sucção um pedaço de tecido cerebral perfurado e coloque cuidadosamente o tecido no lado da malha da tela de captura (Figura 2A). A tela de captura será um pedaço circular de plástico com a malha presa a um lado.
    NOTA: As telas de captura estão incluídas no pacote de microplacões (ver Tabela de Materiais) e são semelhantes às usadas em Schuh et al.23.
  7. Use suavemente um tecido de papel para secar brevemente a tela de captura. Com a umidade removida, o tecido fica pegajoso, o que permite que a fatia se anexe ao centro da malha. Não seque muito a fatia, pois, caso contrário, ela será danificada.
  8. Segure a tela de captura lado para baixo com pinças e coloque-a em um dos poços da placa de ilhota incubadora (Figura 2B). Tenha cuidado para não soltar a fatia; se assim for, tire a tela e coloque uma nova fatia sobre ela.
    NOTA: Não coloque fatias cerebrais nos dois poços de correção de fundo (A1 e D6) na placa de ilhota.
  9. Incubar a placa de ilhota a 37 °C em uma incubadora por pelo menos 30 minutos para permitir a temperatura e o equilíbrio do pH antes de executar o ensaio.

4. Carregamento de cartuchos com compostos desejados

  1. Diluir os compostos desejados em ACSF modificado (37 °C) para a concentração final de estoque de 10x, 11x, 12x e 13x da concentração de trabalho para as portas A a D, respectivamente, e ajustar-se ao pH 7.4. O teste administrará os compostos em ordem da porta A ao D. Para este experimento foram utilizadas as seguintes soluções, com suas respectivas concentrações de trabalho mencionadas antes delas: piruvato de 10 mM (porta A), 20 μM de oligomicina (porta B), 10 μM ou outras concentrações de FCCP (porta C) e 20 μM de antimicina A (porta D).
  2. Precarreça suavemente 75 μL dos compostos diluídos nas portas de injeção apropriadas do cartucho do sensor. Coloque as pontas no meio do caminho para as portas de injeção em um ângulo de 45° com a ponta contra a parede da porta de injeção. As pontas não devem ser inseridas completamente na parte inferior das portas de injeção, pois isso pode causar vazamento composto através da porta.
  3. Retire as pontas das portas cuidadosamente para evitar a criação de bolhas de ar. Não toque em nenhuma porção do cartucho para evitar aliviar bolhas de ar.
  4. Inspecione visualmente as portas de injeção para até mesmo carregar. Certifique-se de que todo o líquido está na porta e não há gotas residuais em cima do cartucho.
  5. Coloque o cartucho do sensor sobre a placa do utilitário e coloque-o em uma incubadora (não-CO2) por 30 minutos para permitir que ele aqueça até 37 °C novamente. Manuseie cuidadosamente apenas segurando a placa de utilidade. Mova-se o mínimo possível.

5. Calibração e execução do ensaio

  1. Carregue o modelo de ensaio no software. Pressione o botão START verde.
  2. Certifique-se de carregar o protocolo correto. O protocolo contém uma combinação de 3 min de mix, 3 min de espera e 2 min de sequências de medida (estes três passos formam uma medição). Altere a distância da cabeça da sonda de 26.600 para 27.800 nas configurações de hardware em configurações de instrumentos25. Não há necessidade de mudar a cabeça da sonda para o analisador XFe24. Pressione start.
  3. Carregue o cartucho do sensor na placa do utilitário na bandeja do instrumento. O entalhe vai para a frente, canto esquerdo. Certifique-se de que a placa está bem e está plana. Coloque o cartucho do sensor cheio de drogas no analisador para calibração.
  4. Siga as instruções na tela para calibrar e equilibrar os sensores. Isso leva cerca de 30 min.
  5. Uma vez feito o passo de calibração, remova a placa de calibração e substitua-a pela placa de ilhota (contendo a malha e as fatias de tecido).
  6. Meça o consumo de oxigênio em cada poço da placa usando os protocolos de ensaio. O protocolo contém uma combinação de 3 min de mix, 3 min de espera e sequências de medida de 2 min (estes três passos formam uma medição), momento em que o OCR é calculado.
  7. Para todo o experimento, incluam medições de OCR 4x para criar uma linha de base, seguidas pela injeção da porta A (piruvato) com medições de 4x, depois a injeção da porta B (oligomicina) com medições de 8x, depois a injeção da porta C (FCCP) com medições de 5x e, finalmente, a injeção da porta D (antimicina A) com medições de 6x.
    NOTA: Este número de medidas após cada injeção composta é determinado dependendo de quando a medição atinge o platô.
  8. Analise os dados de medição do OCR e os dados de eficiência de acoplamento.

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Resultados

O primeiro passo deste estudo foi otimizar a espessura da fatia e o tamanho do soco usado para extirver uma seção do estriato da fatia (Figura 3A). Uma fatia com 150 μm de espessura e um tamanho de soco de 1,5 mm deu os melhores resultados determinados pela eficiência do acoplamento (Figura 3B-C). Como mostrado na Figura 3B, o OCR é relativamente estável por 5 h com menos de 10% de execução. Além di...

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Discussão

O método que desenvolvemos permitiu que um analisador XF fosse usado para medir OCR em fatias estriais de camundongos adultos durante um período de tempo de 4 h. Este método fornece uma nova maneira de medir bioenergésicos celulares em socos extirpados de estruturas cerebrais anatomicamente definidas. Como as amostras de tecido que estão sendo analisadas são bastante pequenas, os parâmetros metabólicos de áreas cerebrais específicas envolvidas em uma doença podem ser investigados. Além disso, o uso de fatias agudas imita...

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Divulgações

Os autores não têm nada a revelar.

Agradecimentos

Agradecemos a Wangchen Tsering e Pamela Walter por sua leitura crítica e edição deste manuscrito. Este trabalho foi apoiado pelo Instituto Nacional de Distúrbios Neurológicos e Derrame (NINDS) (NS054773 a C.J. L. e NS098393 a H.Z.) e pelo Departamento de Neurociência da Universidade Thomas Jefferson (Startup Funds to H.Z.).

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Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo
NomeEmpresaNúmero de catálogoComentários
Accumet AB150 medidor de pH de bancadaThermo Fisher Scientific13-636-AB150Para medir o pH
Antimicina A de streptomyces sp.SIGMAA8674Para inibir o complexo III da albumina de soro bovino mitocondrial
(BSA)SIGMAA6003Para fazer líquido cefalorraquidiano artificial modificado (BSA-ACSF)
Cianeto de carbonila 4-(trifluorometoxi) fenilhidrazona (FCCP)SIGMAC2920Para desacoplar a respiração mitocondrial
D-GlicoseSIGMAG8270Para fazer líquido cefalorraquidiano artificial (ACSF)
DMSOSIGMAD8418Para dissolver compostos
HEPESSIGMAH3375Para fazer líquido cefalorraquidiano artificial (ACSF)
Incubadora umidificada não-CO2Fisher Scientific11-683-230DPara hidratar placas a 37 &graus; C
Oligomicina de Streptomyces diastatochromogenesSIGMAO4876Para inibir a ATP sintase mitocondrial
ParafilmSIGMA-ALDRICHfilme de vedação
RotenoneTocris3616Para inibir o complexo I das mitocôndrias
Seahorse XF Calibrant Solution 500 mLSeahorse Bioscience103681-100Solução para calibração de cavalos-marinhos
Analisador de Fluxo Extracelular Seahorse XFde Biociênciausado para analisar a taxa de consumo de oxigênio,
Analisador de Fluxo Extracelular Seahorse XFe24Biociênciausado para analisar a taxa de consumo de oxigênio,
Seahorse XF24 FluxPaksBiociência de Cavalos-Marinhos101174-100Pacote de cartuchos de sensor de analisador de fluxo, placas de cultura de tecidos, telas de captura,  solução calibrante e placas de calibração; kit de ensaio.
Piruvato de sódioSIGMAP2256Para evitar quaisquer restrições limitantes do substrato do fornecimento de substrato
Punções de biópsia de aço inoxidávelMiltexDispositivo usado para perfurar fatias
Placa de cultura de células estéreis, 35 x 10 mmEppendrof0030700102Usado para punção de fatia
VibratomeLeicaVT1200Para cortar tecido cerebral
Banho-mariaThermo Scientific Precision282-115Para aquecer tampão e soluções
Equipamento de Cavalos-Marinhos de geração antiga Equipamento de de Cavalos-Marinhos de nova geração

Referências

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