A taxa de consumo de oxigênio (OCR) é um proxy comum para a função mitocondrial e pode ser usada para estudar diferentes modelos de doenças. Desenvolvemos um novo método usando um analisador Seahorse XF para medir diretamente o OCR em fatias estriatais agudas de camundongos adultos que é mais fisiologicamente relevante do que outros métodos.
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Artigo de método
Medição da taxa de consumo de oxigênio em fatias estriatais agudas de camundongos adultos
Neste artigo
Resumo
Resumo
Mitocôndrias desempenham um papel importante na produção de ATP celular, regulação reativa de espécies de oxigênio e controle de concentração de Ca2+ . A disfunção mitocondrial tem sido implicada na patogênese de múltiplas doenças neurodegenerativas, incluindo a doença de Parkinson (DP), a doença de Huntington e a doença de Alzheimer. Para estudar o papel das mitocôndrias em modelos dessas doenças, podemos medir a respiração mitocondrial via taxa de consumo de oxigênio (OCR) como proxy para a função mitocondrial. OCR já foi medido com sucesso em culturas celulares, bem como mitocôndrias isoladas. No entanto, essas técnicas são menos fisiologicamente relevantes do que medir OCR em fatias cerebrais agudas. Para superar essa limitação, os autores desenvolveram um novo método utilizando um analisador Seahorse XF para medir diretamente o OCR em fatias estriatais agudas de camundongos adultos. A técnica é otimizada com foco no estriato, uma área cerebral envolvida na DP e na doença de Huntington. O analisador realiza um ensaio de célula viva usando uma placa de 24 poços, o que permite a medição cinética simultânea de 24 amostras. O método usa pedaços circulares de fatias cerebrais estriatais como amostras. Demonstramos a eficácia desta técnica identificando um OCR basal inferior em fatias estriais de um modelo de rato de DP. Este método será de amplo interesse para pesquisadores que trabalham no campo da DP e da doença de Huntington.
Introdução
A disfunção mitocondrial tem sido implicada em várias doenças neurológicas, incluindo a doença de Parkinson (DP), doença de Huntington e doença de Alzheimer 1,2,3. Modelos PD como camundongos e ratos pink1 knockout (KO) exibem função mitocondrial prejudicadafunção 4,5,6,7,8,9,10,11. Mitocôndrias isoladas do estr....
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Protocolo
Todos os procedimentos, incluindo o trabalho animal, foram conduzidos de acordo com as diretrizes nacionais e internacionais e foram aprovados pelo Comitê de Cuidado e Uso de Animais da Universidade Thomas Jefferson. Foram utilizados camundongos FVB/NTac masculinos de 3 a 14 meses. As etapas a seguir foram realizadas em um ambiente não estéril, mas deve-se tomar cuidado para manter tudo o mais limpo possível.
NOTA: O método aqui apresentado foi estabelecido e utilizado na pesquisa relatada por Zhi et al.24. Os experimentos descritos aqui utilizaram um analisador de fluxo extracelular Seahorse XF24 (ver Tabela....
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Resultados
O primeiro passo deste estudo foi otimizar a espessura da fatia e o tamanho do soco usado para extirver uma seção do estriato da fatia (Figura 3A). Uma fatia com 150 μm de espessura e um tamanho de soco de 1,5 mm deu os melhores resultados determinados pela eficiência do acoplamento (Figura 3B-C). Como mostrado na Figura 3B, o OCR é relativamente estável por 5 h com menos de 10% de execução. Além di.......
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Discussão
O método que desenvolvemos permitiu que um analisador XF fosse usado para medir OCR em fatias estriais de camundongos adultos durante um período de tempo de 4 h. Este método fornece uma nova maneira de medir bioenergésicos celulares em socos extirpados de estruturas cerebrais anatomicamente definidas. Como as amostras de tecido que estão sendo analisadas são bastante pequenas, os parâmetros metabólicos de áreas cerebrais específicas envolvidas em uma doença podem ser investigados. Além disso, o uso de fatias agudas imita.......
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Divulgações
Os autores não têm nada a revelar.
Agradecimentos
Agradecemos a Wangchen Tsering e Pamela Walter por sua leitura crítica e edição deste manuscrito. Este trabalho foi apoiado pelo Instituto Nacional de Distúrbios Neurológicos e Derrame (NINDS) (NS054773 a C.J. L. e NS098393 a H.Z.) e pelo Departamento de Neurociência da Universidade Thomas Jefferson (Startup Funds to H.Z.).
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Materiais
| Nome | Empresa | Número de catálogo | Comentários |
|---|---|---|---|
| Accumet AB150 medidor de pH de bancada | Thermo Fisher Scientific | 13-636-AB150 | Para medir o pH |
| Antimicina A de streptomyces sp. | SIGMA | A8674 | Para inibir o complexo III da albumina de soro bovino mitocondrial |
| (BSA) | SIGMA | A6003 | Para fazer líquido cefalorraquidiano artificial modificado (BSA-ACSF) |
| Cianeto de carbonila 4-(trifluorometoxi) fenilhidrazona (FCCP) | SIGMA | C2920 | Para desacoplar a respiração mitocondrial |
| D-Glicose | SIGMA | G8270 | Para fazer líquido cefalorraquidiano artificial (ACSF) |
| DMSO | SIGMA | D8418 | Para dissolver compostos |
| HEPES | SIGMA | H3375 | Para fazer líquido cefalorraquidiano artificial (ACSF) |
| Incubadora umidificada não-CO2 | Fisher Scientific | 11-683-230D | Para hidratar placas a 37 &graus; C |
| Oligomicina de Streptomyces diastatochromogenes | SIGMA | O4876 | Para inibir a ATP sintase mitocondrial |
| Parafilm | SIGMA-ALDRICH | filme de vedação | |
| Rotenone | Tocris | 3616 | Para inibir o complexo I das mitocôndrias |
| Seahorse XF Calibrant Solution 500 mL | Seahorse Bioscience | 103681-100 | Solução para calibração de cavalos-marinhos |
| Analisador de Fluxo Extracelular Seahorse XF | de Biociência | usado para analisar a taxa de consumo de oxigênio, | |
| Analisador de Fluxo Extracelular Seahorse XFe24 | Biociência | usado para analisar a taxa de consumo de oxigênio, | |
| Seahorse XF24 FluxPaks | Biociência de Cavalos-Marinhos | 101174-100 | Pacote de cartuchos de sensor de analisador de fluxo, placas de cultura de tecidos, telas de captura, solução calibrante e placas de calibração; kit de ensaio. |
| Piruvato de sódio | SIGMA | P2256 | Para evitar quaisquer restrições limitantes do substrato do fornecimento de substrato |
| Punções de biópsia de aço inoxidável | Miltex | Dispositivo usado para perfurar fatias | |
| Placa de cultura de células estéreis, 35 x 10 mm | Eppendrof | 0030700102 | Usado para punção de fatia |
| Vibratome | Leica | VT1200 | Para cortar tecido cerebral |
| Banho-maria | Thermo Scientific Precision | 282-115 | Para aquecer tampão e soluções |
Referências
- Hauser, D. N., Hastings, T. G. Mitochondrial dysfunction and oxidative stress in Parkinson's disease and monogenic parkinsonism. Neurobiology of Disease. 51, 35-42 (2013).
- Swerdlow, R. H. Mitochondria and mitochondria....
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Reimpressões e permissões
