Um método robusto para a produção em larga escala de spheroids para aplicativos de triagem e análise de alto conteúdo

Resumo

Este protocolo detalha um método para a produção de três tipos diferentes de esferoides de uma maneira que os torna adequados para triagem e análise de alto conteúdo em larga escala. Além disso, são apresentados exemplos mostrando como eles podem ser analisados nos níveis esferoide e células individuais.

Resumo

A triagem de alto teor de conteúdo (HCS) e a análise de alto teor de conteúdo (HCA) são tecnologias que fornecem aos pesquisadores a capacidade de extrair medições fenotípicas quantitativas em larga escala das células. Essa abordagem tem se mostrado poderosa para aprofundar nossa compreensão de uma ampla gama de eventos fundamentais e aplicados na biologia celular. Até o momento, a maioria das aplicações para essa tecnologia tem se apoiado no uso de células cultivadas em monocamadas, embora se realize cada vez mais que tais modelos não recapitulem muitas das interações e processos que ocorrem nos tecidos. Como tal, houve um surgimento no desenvolvimento e uso de conjuntos celulares tridimensionais (3D), como esferoides e organoides. Embora esses modelos 3D sejam particularmente poderosos no contexto de estudos de biologia do câncer e entrega de medicamentos, sua produção e análise de forma reprodutível adequada para o HCS e hca apresentam uma série de desafios. O protocolo aqui detalhado descreve um método para a geração de esferoides tumorais multicelulares (MCTS), e demonstra que ele pode ser aplicado a três linhas celulares diferentes de forma compatível com HCS e HCA. O método facilita a produção de várias centenas de esferoides por poço, proporcionando a vantagem específica de que, quando utilizados em um regime de triagem, os dados podem ser obtidos a partir de várias centenas de estruturas por poço, todas tratadas de forma idêntica. Também são fornecidos exemplos, que detalham como processar os esferoides para imagens de fluorescência de alta resolução e como o HCA pode extrair características quantitativas tanto no nível esferoide quanto em células individuais dentro de cada esferoide. Este protocolo poderia ser facilmente aplicado para responder a uma ampla gama de questões importantes na biologia celular.

Introdução

Tradicionalmente, ensaios baseados em células têm sido realizados em monocamadas crescendo em um substrato sólido, que efetivamente pode ser considerado como um ambiente bidimensional (2D). No entanto, está se tornando cada vez mais reconhecido que os modelos de cultura celular 2D carecem de relevância fisiológica em alguns contextos e não conseguem replicar muitas das interações complexas que ocorrem entre as ^células1. Os métodos de cultura celular tridimensional (3D) estão rapidamente se tornando populares entre os pesquisadores, e modelos de células 3D mostram alto potencial para imitar melhor as condições fisiológicas encontradas pelas células no ambiente tecidual2. Existem vários tipos diferentes de conjuntos de células 3D que foram empregados, mas os dois tipos mais comuns são esferoides e organoides. Esferoides podem ser cultivados a partir de muitas linhas celulares diferentes, e eles podem adotar várias formas e tamanhos, dependendo do tipo de célula usada e seu método de ^montagem3. Além disso, os esferoides também podem ser chamados de esferoides de tumores multicelulares (MCTS) quando são cultivados a partir de linhas de células cancerosas, e esses modelos têm encontrado uso especial para estudos pré-clínicos de entrega de medicamentos in vitro e toxicidade4,5. Os organoides, por outro lado, visam imitar melhor os tecidos e órgãos do nosso corpo e podem adotar arranjos morfológicos mais complexos. A produção de organoides envolve o uso de células-tronco adultas ou células-tronco pluripotentes, que podem ser reprogramadas nas células apropriadas para se assemelhar ao tecido ou órgão de interesse. Eles são usados principalmente para investigar o desenvolvimento de órgãos e para modelar doenças e interações hospedeiro-patógeno6.

Há uma gama de diferentes métodos usados para gerar conjuntos de células 3D. Os métodos baseados em andaimes fornecem um substrato ou suporte ao qual as células podem se conectar ou crescer dentro. Estes andaimes podem ter várias formas e podem ser feitos a partir de uma variedade de materiais diferentes. Os mais comuns são componentes e hidrogéis de matriz extracelular (ECM), e são projetados para se assemelhar ao ambiente extracelular natural das células e, assim, facilitar interações fisiológicas4,7. O material do porão ECM foi extraído do tumor de sarcoma do rato Engelbreth-Holm-Swarm e mostrado conter uma rica mistura de componentes ECM, incluindo laminina, colágeno tipo IV e ^perlecan8. No entanto, apesar de sua composição vantajosa, há dois desafios principais com seu uso, ou seja, sua variabilidade lote-a-lote e que possui dois estados agregados diferentes abaixo e acima de 10 °^C8,9. Em contraste, os hidrogéis têm a vantagem de serem flexíveis em relação aos seus componentes e rigidez, e podem ser personalizados para se adequarem ao conjunto específico de células 3D ^desejado7,10. Métodos à base de andaimes são essenciais para o crescimento organoide, mas também são amplamente utilizados para esferoides. Métodos livres de andaimes, que funcionam impedindo que as células se conectem à superfície em que estão crescendo, geralmente são compatíveis apenas com o conjunto esferoide. Exemplos incluem placas de fixação ultra-baixa (ULA), com fundo plano ou fundo U, que permitem a agregação das células em esferoides, ou o uso de agitação contínua das células em frascos rotadores/^rotatório10.

O uso de conjuntos de células 3D para estudar uma grande variedade de eventos biológicos está rapidamente ganhando popularidade; no entanto, é essencial que o método escolhido para sua cultura seja apropriado e compatível com os planos para sua análise a jusante. Por exemplo, o uso de placas ULA gera esferoides de alta consistência; no entanto, este método está restrito à produção de um único esferoide por bem, limitando assim o rendimento. Consideração especial é necessária quando a imagem de fluorescência da estrutura 3D é planejada. O substrato ou placa em que o conjunto é cultivado precisa ser opticamente compatível, e deve-se tomar cuidado para minimizar os efeitos da dispersão de luz causada por quaisquer andaimes que possam ter sido ^usados11. Este problema em particular torna-se mais agudo à medida que a abertura numérica das lentes objetivas do microscópio aumenta.

Sem dúvida, uma das principais razões para selecionar para trabalhar com um modelo de célula 3D é extrair dados de imagem volumosa sobre não apenas todo o conjunto, mas também as células individuais dentro dele. Os modelos MCTS, em particular, estão começando a se mostrar muito poderosos para aprofundar nossa compreensão de como a terapêutica transita de fora para as células centrais (como precisariam em um tumor)¹², e assim ganhar conhecimento de células individuais em diferentes camadas é essencial. A tecnologia de imagem que extrai informações quantitativas de células individuais é denominada análise de alto conteúdo (HCA) e é uma abordagem poderosa no contexto da ^triagem13. Até o momento, o HCA tem sido aplicado quase exclusivamente às culturas de monocamadas, mas há uma percepção crescente de que essa abordagem tem o poder de ser aplicada às culturas 3D, permitindo que uma ampla gama de funções e processos celulares sejam ^estudados14. Teria a clara vantagem de que um grande número de conjuntos 3D poderia ser analisado, potencialmente fornecendo dados de nível celular de cada estrutura. No entanto, os desafios associados à imagem de conjuntos celulares potencialmente espessos, bem como os grandes conjuntos de dados gerados, precisam ser superados.

Neste artigo, é apresentado um método robusto baseado em andaimes para a produção em larga escala de MCTS em formato de 96 poços. O método facilita a produção de várias centenas de conjuntos de células 3D em cada poço. Exemplos são mostrados para três tipos diferentes de células, representando modelos de tumor sólidos do fígado, pulmão e cólon. Os esferoides que formam podem ser de uma variedade de tamanhos, e por isso o HCA é usado para selecionar estruturas de um determinado tamanho e/ou morfologia. Este recurso fornece a vantagem adicional de que quaisquer fenótipos observados podem ser comparados entre esferoides de diferentes tamanhos, mas todos tratados da mesma forma no mesmo poço. Esta abordagem é compatível com imagens de alta resolução, fornecendo, importantemente, dados quantitativos de nível celular e subcelular dos mesmos conjuntos celulares. Este método de produção de esferoides tem a vantagem adicional sobre métodos que geram um único esferoide por permérito, que o grande número de esferoides produzidos em cada poço potencialmente fornecem biomassa suficiente para outras análises a jusante, como transcriptome e profilto de proteome.

Protocolo

1. Cultura celular

1. Preparar mídia
   1. Prepare mídia específica de cultura celular, dependendo do tipo de linha celular. Certifique-se de que todas as mídias para manutenção celular contenham 10% de Soro Bovino Fetal (FBS).
      NOTA: Diferentes linhas de celular usam diferentes mídias. As células de carcinoma de cólon HT-29 (ATCC HTB-38) são cultivadas em McCoys 5A + 10% FBS. As células hepatocelulares hepG2 (ATCC HB-8065) são cultivadas em Meio Essencial Mínimo + 1% L-glutamina + 10% FBS. As células de carcinoma broncoalveolar H358 (ATCC CRL-5807) são cultivadas em RPMI 1640 médio + 1% L-glutamina + 10% FBS. Todos os meios de comunicação contendo L-glutamina e FBS são referidos como mídia completa. Ao emplacamento de células para crescer como esferoides, um meio livre de fenol com 10% de FBS é necessário para evitar a coloração do material do porão ECM, que por sua vez pode causar artefatos durante o processo de imagem.
2. Células de subcultura
   1. Quando as células estiverem aproximadamente 80% confluentes, lave brevemente com 2 mL de trypsin-EDTA (0,25% (w/v) trypsin/0,53 mM EDTA). Aspire o trypsin-EDTA, adicione 3 mL de trippsina-EDTA fresco e incubar por 3-5 min a 37 °C.
   2. Quando as células forem separadas do prato de cultura celular, adicione 7 mL de meio completo fresco.
   3. Pipeta 1 mL de suspensão celular em um novo prato de cultura celular de 10 cm e adicionar 9 mL de meio completo fresco para dar uma diluição de 1:10 de células.
   4. Cultume as células a 37 °C em uma incubadora umidificada com 5% de _CO2.
   5. Subcultura as células a cada 3-5 dias, dependendo da linha celular.

2. Geração de esferoides

1. Casaco 96-well placas com material de porão ECM
   1. Descongele o material do porão do ECM no gelo durante a noite.
   2. Diluir material do porão ECM em meio frio sem soro sem fenol usando pontas pré-refrigeradas mantidas a -20 °C.
      NOTA: A concentração final do material do porão ECM depende da linha celular utilizada. Para células HT-29 e H358, utilize 4 mg·^mL-1 de material de porão ECM. Para células HepG2, utilize 4 mg·^mL-1 de material de porão do fator de crescimento reduzido ECM.
   3. Pipeta 15 μL do material do porão ECM/solução média em uma placa de imagem de 96 poços.
      NOTA: Para a produção de spheroid em larga escala, esta etapa pode ser realizada com uma pipeta de 8 canais e uma cabeça de pipetação de 96 canais, desde que as pontas e reservatórios contendo o material do porão ECM sejam refrigerados.
   4. Centrifugar a placa por 20 min a 91 x g a 4 °C.
   5. Incubar a placa por não mais do que 30 min a 37 °C.
2. Células de subcultura e contagem
   1. Durante o período de incubação da placa, incubar as células com trypsin-EDTA e resuspensá-las em um meio completo contendo 10% de FBS.
   2. Pipeta 10 μL da suspensão da célula em uma câmara de contagem de hemótmetros. Conte o número de células em 4 quadrantes da câmara.
   3. Calcule o número de células dentro da suspensão celular determinando o número médio de células dentro dos 4 quadrantes.
      NOTA: As células também podem ser contadas usando dispositivos automatizados de contagem de células.
   4. Centrifugar as células a 135 x g por 4 min em temperatura ambiente (RT).
   5. Uma vez que as células são pelotas, aspire o supernasal e resuspend as células em um meio completo livre de fenol para obter uma concentração de 1 x ¹⁰⁶ células por mL.
3. Células de sementes em placas revestidas de material do porão ECM
   1. Diluir as células em um meio completo livre de fenol.
      NOTA: A densidade das células semeadas depende da linha celular utilizada. Para células HT-29 e HepG2, as células 3 x ¹⁰⁴ são semeadas por poço; para células H358, 4 x ¹⁰⁴ células são semeadas por poço.
   2. Seme as células em um volume total de 35 μL por poço. Certifique-se de adicioná-los dropwise em um movimento circular.
      NOTA: Para a produção de spheroid em larga escala, esta etapa pode ser realizada com uma pipeta de 8 canais, desde que o movimento circular de pipetação possa ser alcançado.
   3. Incubar as células por 1h a 37 °C em uma incubadora umidificada com 5% de _CO2.
   4. Prepare uma solução de material de porão ECM em meio completo sem fenol, o que resulta em uma concentração final de 2% de material de porão ECM no poço. Para isso, adicione 1,2 μL de material de porão ECM a 23,8 μL de meio completo sem fenol por poço, resultando em um volume final de 60 μL por poço.
   5. Incubar as células a 37 °C em uma incubadora umidificada com 5% de _CO2.
   6. No dia seguinte, substitua o meio por 100 μL de meio completo sem fenol fresco.
   7. Substitua o meio a cada dois dias por 100 μL de meio completo fresco sem fenol.

3. Mancha de imunofluorescência de esferoides

NOTA: Este protocolo é adaptado de Nürnberg et al., 202015. Essas adaptações baseiam-se principalmente no fato de que os esferoides descritos neste protocolo são menores do que os utilizados no Nürnberg et al. ^work15 e, como tal, facilitam tempos de incubação mais curtos. Por exemplo, os tempos de bloqueio são reduzidos de 2h para 1 h. Além disso, como o protocolo é projetado para a produção de alto rendimento de esferoides, todas as etapas de processamento são realizadas no poço em que os esferoides são cultivados, o que significa que a transferência de esferoides individuais em tubos não é necessária.

1. Prepare todas as soluções e buffers necessários para fixação e coloração
   1. Prepare o Salino Tampão fosfato (PBS) adicionando 1 comprimido PBS por 200 mL de água. Autoclave o PBS.
   2. Prepare paraformaldeído (PFA) seguindo as etapas 3.1.3-3.1.4.
   3. Use um agitador aquecido para aquecer 400 mL de PBS a 60-70 °C em um capô de fumaça. Adicione 15 g de PFA enquanto mexe. Uma vez que o PFA tenha dissolvido, adicione 50 μL de 1 M _CaCl2 e 50 μL de 1 M _MgCl2.
   4. Adicione 100 mL de PBS para fazer um volume final de 500 mL. Use o NaOH para equilibrar o PFA ao pH 7.4. Filtre o PFA através de filtros de vácuo estéreis (tamanho de poros 0,22 μm), aliquot e armazenar a -20 °C.
   5. Prepare uma solução de estoque de 1 M de glycina adicionando 3,75 g de glicina a 50 mL de PBS. Armazenar a 4 °C.
   6. Prepare 5 mL de tampão de permeabilização adicionando 100 μL de Triton X-100, 1 mL de sulfoxida de dimetila (DMSO) e 1,5 mL de 1 M de glicacina a 2,4 mL de PBS. Guarde a 4 °C por não mais do que 2 semanas.
   7. Prepare 5 mL de tampão de bloqueio adicionando 100 μL de Triton X-100, 0,5 mL de DMSO e 0,05 g de albumina de soro bovino (BSA) a 4,9 mL de PBS. Aliquot o tampão de bloqueio em tubos de 1,5 mL e armazene a -20 °C.
   8. Prepare 5 mL de tampão de incubação de anticorpos adicionando 10 μL de polisorbato 20, 0,05 g de BSA e 250 μL de DMSO a 4,74 mL de PBS. Aliquot o tampão de incubação de anticorpos em tubos de 1,5 mL e armazene-o a -20 °C.
      NOTA: No protocolo aqui descrito, os esferoides são montados apenas nos 60 poços internos de uma placa de 96 poços, embora possam ser preparados em todos os 96 poços da placa. A razão para apenas preparar esferoides nos 60 poços internos é que algumas lentes objetivas de alta abertura numérica não são capazes de ser fisicamente capaz de imaginar todo o poço dos poços externos devido à 'saia' em alguns tipos de placas. Os volumes acima são suficientes para a preparação de 60 poços contendo esferoides.
2. Corrigir e permeabilize os esferoides
   1. Remova cuidadosamente o meio dos esferoides, garantindo que a camada de material do porão ECM não seja perturbada.
   2. Lave os esferoides duas vezes com 70 μL de PBS por 3 minutos cada vez.
   3. Fixar os esferoides com 70 μL de 3% PFA por 1h a 37 °C.
   4. Lave os esferoides duas vezes com 70 μL de PBS por 3 minutos cada vez.
   5. Sacie com 70 μL de solução de 0,5 M de glycina por 30 min a 37 °C.
   6. Permeabilize os esferoides usando 70 μL do tampão de permeabilização por 30 min no RT.
   7. Lave os esferoides duas vezes com 70 μL de PBS por 3 minutos cada vez.
   8. Incubar os esferoides em 70 μL de tampão de bloqueio por 1 h a 37 °C.
      NOTA: Uma vez fixados os esferoides, todas as etapas subsequentes de processamento podem ser executadas usando uma pipeta de 8 canais ou uma cabeça de pipetação de 96 poços, se disponível. Isso aumenta a velocidade de preparação de esferoides antes da imagem.
3. Esferoides imunossusuários usando anticorpos primários e secundários
   1. Diluir o anticorpo primário a uma diluição apropriada no tampão de incubação de anticorpos e adicionar 70 μL a cada poço. Incubar os esferoides com o anticorpo primário durante a noite.
      NOTA: A diluição depende do anticorpo específico utilizado. No exemplo mostrado aqui, os lysosomos são imunossuídos com anticorpos anti-LAMP1 do rato usando uma diluição de 1:500.
   2. No dia seguinte, lave os esferoides 5 vezes com 70 μL de PBS por 3 minutos cada vez.
   3. Diluir o anticorpo secundário a uma diluição de 1:500, falooidina fluorescentemente conjugada às 1:500, e Hoechst 33342 (de um estoque de 1 mg ^mL-1 ) a 1:5000 no tampão de incubação de anticorpos e adicionar 70 μL a cada poço. Incubar durante a noite.
      NOTA: A diluição do anticorpo depende do anticorpo específico utilizado. Anticorpos secundários altamente transversais que mostram alta fotoe alto brilho são recomendados.
   4. No dia seguinte, lave os esferoides 5 vezes com 70 μL de PBS por 3 minutos cada vez.
      NOTA: As placas podem ser armazenadas por até duas semanas na RT antes da imagem, desde que os esferoides permaneçam cobertos com PBS.

4. Aquisição de imagens e análise de esferoides

1. Aquisição de imagens
   1. Insira a placa de 96 poços contendo esferoides em um microscópio de triagem de alto teor de alta qualidade.
   2. Selecione os lasers apropriados para excitar os fluoroforos utilizados.
   3. Adquira os canais sequencialmente para evitar conversas cruzadas.
   4. Imagem dos esferoides usando objetivos apropriados.
      NOTA: Recomenda-se o uso de objetivos de imersão em água, se disponível. Por exemplo, um objetivo 20x/1.0 NA pode imaginar um poço inteiro em ~77 campos de visão. Um objetivo 63x/1.15 NA pode visualizar um poço inteiro em aproximadamente 826 campos de visão.
   5. Imagem ~30-40 fatias, dependendo da profundidade do esferoide, com cada fatia tirada em um intervalo de 1,5 μm do anterior.
2. Análise de imagem
   1. Para análise morfológica de esferoides, siga os passos 4.2.2-4.2.6.
   2. Segmente os esferoides com base na coloração de faloideina fluorescentemente conjugada.
   3. Segmentar os núcleos com base na coloração hoechst 33342.
   4. Segmente o citoplasma de cada célula pela mancha residual hoechst 33342 que está presente no citoplasma celular.
   5. Calcule diferentes propriedades morfológicas dos esferoides, incluindo volume, área de superfície, esférica e o número de núcleos por esferoide.
      NOTA: Essas informações são extraídas usando vários algoritmos que estão embutidos no software de análise de imagem de escolha.
   6. Processe imagens ainda mais para remover esferoides menores que 75.000 ^μm3 e maiores que 900.000 ^μm3.
      NOTA: Esses valores são sugestões para permitir a remoção de conjuntos de células muito pequenas e grandes conjuntos que podem ter surgido como resultado da fusão de múltiplos esferoides. Os spheroids também podem ser categorizados em diferentes classes de tamanho nesta etapa.
   7. Para analisar células únicas dentro de esferoides, siga os passos 4.2.8-4.2.12.
   8. Segmente os esferoides com base na coloração de faloideina fluorescentemente conjugada.
   9. Segmentar os núcleos com base na coloração hoechst 33342.
   10. Segmente o citoplasma de cada célula pela mancha residual hoechst 33342 que está presente no citoplasma celular.
   11. Segmente os lysosomos com base na coloração de anticorpos secundários.
   12. Calcule diferentes propriedades morfológicas das células dentro de cada esferoide, incluindo o número de lysosos por célula, volume celular e área da superfície celular.
       NOTA: Essas informações são extraídas usando vários algoritmos que estão embutidos no software de análise de imagem de escolha.

Resultados

Neste protocolo, um método robusto para produzir conjuntos de cultura celular 3D na forma de esferoides, usando diferentes tipos de células para representar vários tecidos tumorais, é detalhado. Este método permite a geração de centenas de esferoides por poço, o que permite que ensaios baseados em células sejam realizados de forma de alto conteúdo (Figura 1). Esta abordagem já foi usada para estudar a absorção de nanopartículas em esferoides ^HT-2916 e toxicidade induz...

Discussão

A abordagem descrita aqui detalha uma plataforma para gerar várias centenas de esferoides por poço de uma maneira adequada para HCS e HCA. Em comparação com outros métodos populares, como o uso de placas ULA de fundo plano e de fundo redondo, que permitem a formação de apenas um poço esferoide por ^18,19, este método oferece a oportunidade de informações de alta resolução serem extraídas de um grande número de esferoides em um formato de triagem. Notavelmente, est...

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
0,05% Tripsina-EDTA (1x), vermelho de fenol	Gibco	25300054
Albumina de soro bovino (BSA)	Sigma Aldrich	A6003
Cloreto de cálcio	Fisher Scientific	10050070
CellCarrier-96 Ultra Microplacas, tratadas para cultura de tecidos, pretas, 96 poços com tampa	Perkin Elmer	6055302	Essas placas foram renomeadas como Fenoplacas
Dimetilsulfóxido (DMSO)	Sigma Aldrich	D2650
Soro Fetal Bovino (FBS), qualificado, aprovado pela UE, origem na América do Sul, inativado	por calor Gibco	10500064
Glicina	Fisher Scientific	BP381-1
Anticorpo secundário altamente adsorvido de cabra IgG (H+L) de cabra, Alexa Fluor 488	Invitrogen	A-11029
Solução de L-glutamina, 200	mM Gibco	25030024
Hoechst 33342	Sigma Aldrich	14533
Cloreto de magnésio	Fisher Scientific	10647032
Matrigel Matriz de Membrana Inferior, sem Vermelho de Fenol, sem LDEV, 10 mL	Corning	356237	Esta formulação de Matrigel também pode ser encontrada com o mesmo número de catálogo na BD Biosciences
Matrigel Growth Factor Reduced Matrigel	BD Biosciences	356231	Esta formulação Matrigel também pode ser encontrada com o mesmo número de catálogo no meio 5A da Corning
McCoy	Gibco	26600023
no meio 5A da McCoy com L glutamina e bicarbonato de sódio, sem vermelho de fenol	Hyclone	10358633
meio essencial mínimo (MEM)	Gibco	21090022
Meio Essencial Mínimo (MEM), sem glutamina, sem vermelho de fenol	Gibco	51200046
Anticorpo monoclonal anti-LAMP1 de camundongo (concentrado)	Estudos de desenvolvimento Banco de hibridoma	H4A3-a
Câmara de contagem Neubauer	Hirschmann	8100203
Placa de cultura de tecidos Nunclon com tampa, poliestireno, 92 mm x 17 mm	ThermoFisher Scientific	150350
Opera Phenix HCS System e Harmony HCA software	Perkin Elmer	HCSHH14000000
Paraformaldeído (PFA)	Sigma Aldrich	P6148
Faloidina Alexa Fluor 568	Invitrogen	A12380
Phosphate Buffered Saline (PBS)	comprimidos Sigma Aldrich	P4417
Polissorbato 20	Sigma Aldrich	P5927
RPMI 1640 Medium, GlutaMAX Suplemento	Gibco	61870010
RPMI 1640 Medium, sem glutamina, sem vermelho de fenol	Gibco	11835063
Triton X-100	Sigma Unidades	T9284
Stericup	Millipore	SCGVU05RE