Célula única reutilizável para análises epigenômicas iterativas

Hidetaka Ohnuki; David J. Venzon; Alexei Lobanov; Giovanna Tosato

doi:10.3791/63456

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Artigo de método

Célula única reutilizável para análises epigenômicas iterativas

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DOI:

10.3791/63456

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11 de fevereiro de 2022

Hidetaka Ohnuki¹ , David J. Venzon² , Alexei Lobanov³^,⁴ , Giovanna Tosato¹

¹Laboratory of Cellular Oncology, Center for Cancer Research, National Cancer Institute, National Institutes of Health, ²Biostatistics and Data Management Section, Center for Cancer Research, National Cancer Institute, National Institutes of Health, ³CCR Collaborative Bioinformatics Resource (CCBR), Center for Cancer Research, National Cancer Institute, National Institutes of Health, ⁴Advanced Biomedical Computational Science, Frederick National Laboratory for Cancer Research sponsored by the National Cancer Institute

Neste artigo

Resumo

O presente protocolo descreve um método de célula única para análises epigenômicas iterativas usando uma única célula reutilizável. A célula única reutilizável permite a análise de múltiplas marcas epigenéticas em uma mesma célula e a validação estatística dos resultados.

Resumo

As análises atuais do epigenoma de célula única são projetadas para uso único. A célula é descartada após um único uso, impedindo a análise de múltiplas marcas epigenéticas em uma única célula e exigindo dados de outras células para distinguir o sinal do ruído de fundo experimental em uma única célula. Este artigo descreve um método para reutilizar a mesma célula única para análises epigenômicas iterativas.

Neste método experimental, as proteínas celulares são primeiramente ancoradas a um polímero de poliacrilamida em vez de reticulá-las à proteína e ao DNA, aliviando o viés estrutural. Esta etapa crítica permite experimentos repetidos com a mesma célula única. Em seguida, um primer aleatório com uma sequência de andaime para ligadura de proximidade é recozido ao DNA genômico, e a sequência genômica é adicionada ao primer por extensão usando uma DNA polimerase. Posteriormente, um anticorpo contra um marcador epigenético e IgG de controle, cada um marcado com diferentes sondas de DNA, são ligados aos respectivos alvos na mesma célula.

A ligadura de proximidade é induzida entre o primer randômico e o anticorpo pela adição de um conector de DNA com sequências complementares à sequência de scaffold do primer randômico e à sonda anticorpo-DNA. Esta abordagem integra informações de anticorpos e sequências de genoma próximas em um único produto de DNA de ligadura de proximidade. Ao permitir experimentos repetidos com a mesma célula única, este método permite um aumento na densidade de dados de uma célula rara e análise estatística usando apenas dados de IgG e anticorpos da mesma célula. As células individuais reutilizáveis preparadas por este método podem ser armazenadas por pelo menos alguns meses e reutilizadas posteriormente para ampliar a caracterização epigenética e aumentar a densidade dos dados. Esse método proporciona flexibilidade aos pesquisadores e seus projetos.

Introdução

A tecnologia de célula única está entrando na era da multiômica de célula única, que integra tecnologias ômicas individuais de célula única¹. Recentemente, a transcriptômica de célula única tem sido combinada com métodos para detectar acessibilidade da cromatina (scNMT-seq² e SHARE-seq³) ou modificações de histonas (Paired-seq⁴ e Paired-Tag⁵). Mais recentemente, transcriptômica e proteômica de célula única foram integradas com acessibilidade à cromatina (DOGMA-seq⁶). Esses métodos usam marcação baseada em transposase para dete....