Summary
O presente protocolo descreve um procedimento cirúrgico para remover a faixa ascendente-aórtica em um modelo de rato de hipertensão pulmonar devido a doença cardíaca esquerda. Esta técnica estuda mecanismos endógenos de remodelação reversa na circulação pulmonar e no coração direito, informando estratégias para reverter a hipertensão pulmonar e/ou disfunção ventricular direita.
Abstract
A hipertensão pulmonar devido à doença cardíaca esquerda (PH-LHD) é a forma mais comum de PH, mas sua fisiopatologia é pouco caracterizada do que a hipertensão arterial pulmonar (AP). Como resultado, faltam intervenções terapêuticas aprovadas para o tratamento ou prevenção da PH-LHD. Medicamentos utilizados para tratar PH em pacientes com APS não são recomendados para o tratamento de PH-LHD, pois a redução da resistência vascular pulmonar (PVR) e o aumento do fluxo sanguíneo pulmonar na presença de aumento das pressões de enchimento do lado esquerdo podem causar descompensação do coração esquerdo e edema pulmonar. Novas estratégias precisam ser desenvolvidas para reverter o PH em pacientes com LHD. Em contraste com o PAH, o PH-LHD desenvolve-se devido ao aumento da carga mecânica causada pelo congestionamento do sangue na circulação pulmonar durante a insuficiência cardíaca esquerda. Clinicamente, o descarregamento mecânico do ventrículo esquerdo (LV) por substituição da válvula aórtica em pacientes com estenose aórtica ou pela implantação de dispositivos auxiliares de LV em pacientes com insuficiência cardíaca em estágio final normaliza não apenas pressões pulmonares e ventriculares direitas (RV), mas também PVR, fornecendo evidências indiretas para remodelação reversa na vasculatura pulmonar. Utilizando um modelo de rato estabelecido de PH-LHD devido à insuficiência cardíaca esquerda desencadeada pela sobrecarga de pressão com o desenvolvimento subsequente de PH, um modelo é desenvolvido para estudar os mecanismos moleculares e celulares deste processo fisiológico de remodelação reversa. Especificamente, foi realizada uma cirurgia de debandada de aoórtica, que resultou na remodelação reversa do miocárdio lv e sua descarga. Em paralelo, foi detectável a normalização completa da pressão sistólica do RV e a reversão significativa, mas incompleta, da hipertrofia do RV. Este modelo pode apresentar uma ferramenta valiosa para estudar os mecanismos de remodelação fisiológica reversa na circulação pulmonar e no RV, visando desenvolver estratégias terapêuticas para o tratamento do PH-LHD e outras formas de PH.
Introduction
A insuficiência cardíaca é a principal causa de morte nos países desenvolvidos e deve aumentar 25% na próxima década. A hipertensão pulmonar (PH) - um aumento patológico da pressão arterial na circulação pulmonar - afeta aproximadamente 70% dos pacientes com insuficiência cardíaca em estágio terminal; a Organização Mundial da Saúde classifica a PH como hipertensão pulmonar devido à doença cardíaca esquerda (PH-LHD)1. O PH-LHD é iniciado pela função ventricular esquerda (LV) sistólica e/ou diastólica prejudicada que resulta em pressão de enchimento elevada e congestão passiva de sangue na circulação pulmonar2. Embora inicialmente reversível, o PH-LHD gradualmente se fixa devido à remodelação vascular pulmonar ativa em todos os compartimentos da circulação pulmonar, ou seja, artérias, capilares e veias 3,4. Tanto o PH reversível quanto o PH fixo aumentam a carga posterior do RV, inicialmente conduzindo hipertrofia miocárdio adaptativa, mas, em última análise, causando dilatação de RV, hipocinese, fibrose e descompensação que progressivamente levam à falha do RV 1,2,5,6. Assim, a AP acelera a progressão da doença em pacientes com insuficiência cardíaca e aumenta a mortalidade, particularmente em pacientes submetidos ao tratamento cirúrgico por implantação de dispositivos de assistência ventricular esquerda (LVAD) e/ou transplante de coração 7,8,9. Atualmente, não existem terapias curativas que possam reverter o processo de remodelação vascular pulmonar, por isso são necessárias pesquisas mecanicistas fundamentais em sistemas de modelos adequados.
É importante ressaltar que os estudos clínicos mostram que o PH-LHD como uma complicação frequente em pacientes com estenose aórtica pode melhorar rapidamente no período pós-operatório inicial após a substituição da válvula aórtica10. Análogamente, alta (>3 Unidades de Madeira) resistência vascular pulmonar pré-operatória (PVR) que era, no entanto, reversível em nitroprusside foi sustentávelmente normalizada após o transplante de coração em um estudo de acompanhamento de 5 anos11. Da mesma forma, uma redução adequada da PVR reversível e fixa e a melhoria da função RV em pacientes com LHD poderiam ser realizadas dentro de vários meses, descarregando o ventrículo esquerdo usando dispositivos de assistência ventricular pulsal e não pulsante 12,13,14. Atualmente, os mecanismos celulares e moleculares que impulsionam a remodelação reversa na circulação pulmonar e no miocárdio rv não são claros. No entanto, sua compreensão pode fornecer uma visão importante sobre vias fisiológicas que podem ser exploradas terapeuticamente para reverter a remodelação vascular pulmonar e rv em PH-LHD e outras formas de PH.
Um modelo pré-clínico adequado que replica adequadamente as características fisiopatológicas e moleculares do PH-LHD pode ser usado para estudos translacionais em insuficiência cardíaca congestiva induzida por sobrecarga de pressão devido à banda aórtica cirúrgica (AoB) em ratos 4,15,16. Em comparação com a insuficiência cardíaca semelhante devido à sobrecarga de pressão no modelo murino de constrição aórtica transversa (TAC)17, a banda da aorta ascendente acima da raiz aórtica em ratos AoB não produz hipertensão na artéria carótida esquerda, pois o local de banda é proximal do fluxo da artéria carótida esquerda da aorta. Como resultado, o AoB não causa lesão neuronal do lado esquerdo no córtex como é característico do TAC18, e que pode afetar o resultado do estudo. Em comparação com outros modelos de roedores de PH-LHD cirurgicamente induzidos, modelos de ratos em geral, e AoB em particular, provam ser mais robustos, reprodutíveis e replicar a remodelagem da característica de circulação pulmonar para pacientes com PH-LHD. Ao mesmo tempo, a letalidade perioperatória é baixade 19. O aumento das pressões de LV e a disfunção de LV em ratos aoB induzem o desenvolvimento de PH-LHD, resultando em pressões elevadas de RV e remodelação de RV. Como tal, o modelo de ratos aoB tem se mostrado extremamente útil em uma série de estudos anteriores por grupos independentes, incluindo nós mesmos, para identificar pathomecanismos de remodelação vascular pulmonar e testar estratégias potenciais de tratamento para PH-LHD 4,15,20,21,22,23,24,25.
No presente estudo, o modelo de rato AoB foi utilizado para estabelecer um procedimento cirúrgico de debandagem aórtica para estudar mecanismos de remodelação reversa na vasculatura pulmonar e no RV. Anteriormente, modelos de remodelação reversa do miocárdio, como a debandagem aórtica em camundongos26 e ratos27 foram desenvolvidos para investigar os mecanismos celulares e moleculares que regulam a regressão da hipertrofia ventricular esquerda e testar potenciais opções terapêuticas para promover o miocárdio recuperação. Além disso, um número limitado de estudos anteriores têm explorado os efeitos da debandada aórtica no PH-LHD em ratos e mostrado que a debandada aórtica pode reverter a hipertrofia medial em artérias pulmonares, normalizar a expressão da pré-endotelina 1 e melhorar a hemodinâmica pulmonar27,28, fornecendo evidências para a reversibilidade de PH em ratos com insuficiência cardíaca. Aqui, os procedimentos técnicos da cirurgia de desbandada são otimizados e padronizados, por exemplo, aplicando uma traqueotomia em vez de intubação endotraqueal ou utilizando clipes de titânio de diâmetro interno definido para banda aórtica em vez de suturas de polipropileno com agulha cega 26,27, proporcionando assim melhor controle dos procedimentos cirúrgicos, maior reprodutibilidade do modelo e uma melhor taxa de sobrevivência.
Do ponto de vista científico, a importância do modelo de desbanding ph-LHD não reside apenas em demonstrar a reversibilidade do fenótipo cardiovascular e pulmonar na insuficiência cardíaca, mas, mais importante, na identificação de condutores moleculares que desencadeiam e/ou sustentam a remodelação reversa nas artérias pulmonares como candidatos promissores para futuras segmentações terapêuticas.
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Protocol
Todos os procedimentos foram realizados seguindo o "Guia de Cuidado e Uso de Animais de Laboratório" (Instituto de Recursos Animais laboratoriais, 8ª edição 2011) e aprovados pelo comitê de cuidados e uso de animais governamentais locais do Escritório Estadual alemão de Saúde e Assuntos Sociais (Landesamt für Gesundheit und Soziales (LaGeSO), Berlim; protocolo nº. G0030/18). Primeiro, a insuficiência cardíaca congestiva foi cirurgicamente induzida em ratos juvenis Sprague-Dawley ~100 g de peso corporal (bw) (ver Tabela de Materiais) colocando um clipe de titânio com um diâmetro interno de 0,8 mm na aorta ascendente (banda aórtica, AoB) como descrito anteriormente29,30. Na semana 3, após a AoB (Figura 1), foi realizada a cirurgia de debandada (Deb) para retirada do clipe da aorta. Os procedimentos cirúrgicos e a validação da reversão de PH em ratos aoB realizados são esquematicamente retratados na Figura 1.
1. Preparações cirúrgicas
- Esterilize os instrumentos cirúrgicos necessários (Figura 2) por autoclavagem.
- Injete rato com carprofeno (5 mg/kg bw) (ver Tabela de Materiais) intraperitoneally (i.p.) para analgesia 30 min antes da cirurgia.
- Anesthetize rato por injeção i.p. de cetamina (87 mg/kg bw) e xilazina (13 mg/kg bw).
- Remova o cabelo do decote e do peito do animal usando uma máquina de barbear elétrica.
- Aplique um pouco de pomada ocular para proteger os olhos durante a cirurgia.
- Coloque o rato em uma posição supina sobre uma mesa cirúrgica esterilizada. Conserte cuidadosamente o abdômen e os membros do animal com fita adesiva.
NOTA: Para manter a temperatura corporal, coloque um tapete de aquecimento de 37 °C sob a mesa cirúrgica. Evite o aquecimento da região da cabeça para evitar a secagem dos olhos. - Desinfete a pele animal com solução povidone-iodo/iodophor. Note cicatrizes e suturas da cirurgia aob primária e drape o campo cirúrgico.
- Certifique-se de profundidade adequada da anestesia pelo dedo do dedo do sol.
NOTA: A profundidade da anestesia precisa ser controlada regularmente durante a cirurgia.
2. Traqueotomia e ventilação mecânica
NOTA: Durante toda a cirurgia, troque as luvas após o manuseio de equipamentos não estéreis.
- Com uma tesoura fina (Figura 2A), faça uma incisão midline cervical de 7-10 mm de comprimento (Figura 3A).
- Com a ajuda de um par de fórceps contundentes (Figura 2B'), dissecar o tecido mole cervical para expor os músculos infra-heróides. Divida os músculos na linha média para visualizar a traqueia. Corte e remova a sutura da cirurgia aoB primária.
- Faça incisão de ~2 mm traqueia entre dois anéis cartilaginosos usando tesouras angulares de mola Noyes (Figura 2C,3B). Insira a cânula traqueal de diâmetro externo 2 mm (Figura 2D) na traqueia e fixe-a com uma sutura de seda 4-0 (Figura 2E,3C).
- Conecte a cânula traqueal a um ventilador mecânico (ver Tabela de Materiais) mantendo o espaço morto ao mínimo (Figura 3D-E). Mantenha a ventilação pulmonar perioperatória a uma taxa respiratória de 90 respirações/min em um volume de maré (Vt) de 8,5 mL/kg bw.
3. Debandagem aórtica
- Faça uma incisão de pele longa de ~20 mm entre a segunda e a terceira costelas usando uma tesoura fina (Figura 3F).
- Com a ajuda de uma tesoura cirúrgica menor (Figura 2F), espalhe cuidadosamente os músculos e corte-os camada por camada (Figura 3G). Faça uma incisão lateral de 10 mm ao longo do espaço intercostal entre a segunda e a terceira costela.
NOTA: A linha do meio-coração precisa ser cuidadosamente abordada para evitar sangramento. - Use um espalhador de costela (Figura 2G) para expandir o espaço intercostal entre a segunda e a terceira costela para criar uma janela cirúrgica (Figura 3H).
- Com a ajuda de fórceps contundentes (Figura 2B,B'), separe cuidadosamente o timo do coração e artérias de conduítes para visualizar a aorta com o clipe (Figura 4A).
- Segure o clipe com a ajuda dos fórceps e remova cuidadosamente o tecido conjuntivo ao redor do clipe para expô-lo.
NOTA: Evite segurar ou levantar a aorta com os fórceps, pois pode ferir a aorta resultando em sangramento e um desfecho letal. - Com a ajuda de um suporte de agulha (Figura 2H), abra o clipe (Figura 4B) e remova-o da cavidade torácica.
- Antes de fechar o tórax, abra atelectasia pulmonar, garanta o recrutamento adequado do pulmão sem excesso de distensão, continue a ventilação mecânica com um Vt de 9,5 mL/kg bw por mais 10 minutos, e retorne a um Vt de 8,5 mL/kg bw para recrutar os pulmões e resolver um possível pneumotórax.
- Feche os músculos profundos por uma sutura simples interrompida usando seda 4-0. Em seguida, conecte os músculos superiores e a pele com uma sutura contínua simples (Figura 5A,B).
4. Extubação traqueal
- Desconecte a cânula traqueal da máquina de ventilação. Observe atentamente o rato até que a respiração espontânea seja restabelecido. Se o animal não respirar espontaneamente após a desconexão, reconecte o ventilador e continue ventilando por mais 5 minutos. Em seguida, repita o procedimento.
- Após a restabelecição espontânea, retire a cânula da traqueia e limpe o líquido ao redor da traqueia com pontos de esponja (Figura 2I) (ver Tabela de Materiais).
- Feche a traqueia com uma sutura simples usando prolene 6-0 (Figura 2E' e Figura 5C). Em seguida, feche os músculos infra-heróides em uma sutura simples interrompida usando seda 4-0 (Figura 5D), e conecte a pele em uma sutura simples contínua (Figura 5E). Limpe e desinfete os músculos e a pele durante o processo com solução povidone-iodophor/iodophor.
5. Cuidados pós-operatórios
- Após a conclusão do procedimento cirúrgico, mova cuidadosamente o animal para uma gaiola de recuperação com oxigênio suplementar e uma lâmpada infravermelhada para manter os animais aquecidos e suficientemente oxigenados durante a fase de recuperação. Coloque a máscara de oxigênio perto do focinho do rato. Só mantenha um animal por gaiola de recuperação a qualquer momento.
- Depois que o animal acordar, mova-o cuidadosamente para uma gaiola normal abastecida com água e comida. Para as próximas 12 horas, controle o estado de saúde do animal operado em intervalos de 2h.
- Após completar o procedimento cirúrgico, aplique analgesia diariamente por injeção de carprofeno (5 mg/kg bw) durante uma semana.
- Para evitar infecções bacterianas, administre amoxicilina (500 mg/L) na água potável durante uma semana após o operatório.
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Representative Results
Primeiro, o debandado aórtico bem sucedido foi confirmado pela ecocardiografia transtorácica realizada antes e depois do procedimento de debandada em animais aoB (Figura 6). Para isso, o arco aórtico foi avaliado na visualização do modo B do eixo longo parasternal (PLAX). A posição do clipe na aorta ascendente em animais AoB e sua ausência após a cirurgia de Deb foi visualizada (Figura 6A,B). Em seguida, o fluxo sanguíneo aórtico foi avaliado por imagens doppler de ondas pulsadas (Figura 6C-F). O pico de velocidade de fluxo sanguíneo em animais aoB medido antes e depois do clipe foi de 733,24 ± 17,39 mm/s e 5215,08 ± 48,05 mm/s (n = 8 animais), respectivamente (Figura 6C,E), demonstrando um gradiente íngreme em todo o local do AoB. Após a remoção do clipe, a velocidade de fluxo sanguíneo máxima foi de 1093,79 ± 28,97 mm/s e 2578,73 ± 42,27 mm/s, respectivamente, em locais de aorta correspondentes, mostrando atenuação acentuada do gradiente em consonância com a debandagem funcional (Figura 6D,F). Para sondar a reversão da insuficiência cardíaca esquerda por debandada aórtica, os níveis de expressão do peptídeo natriurético cerebral (BNP), parâmetro de rotina clínica para avaliação da doença cardíaca31, foram acessados no miocárdio lv. Nas semanas 3 e 5 após a banda aórtica, os animais aoB mostraram uma produção significativamente maior de BNP em comparação com os controles operados por farsas. Em contraste, os ratos de Deb na semana 5 expressaram o BNP em níveis comparáveis aos animais falsos, indicando a reversão da falha da LV por debandagem aórtica (Figura 7A-C). Em paralelo, a avaliação da função LV por ecocardiografia transtorácica revelou uma maior fração de ejeção de LV e volume de LV em animais Deb em comparação com ratos AoB (Figura 7D-E). Enquanto a fração de ejeção de LV em animais Deb era comparável aos ratos falsos, o volume de LV em ratos Deb não conseguiu normalizar totalmente os valores vistos no grupo falso, indicando que a reversão da função LV está incompleta.
Para sondar se os animais de Deb podem servir como modelo pré-clínico para estudar a remodelação do ventricular pulmonar reverso e do ventricular (RV) em PH-LHD, a pressão sistólica ventricular esquerda (LVSP) e a pressão sistólica ventricular direita (RVSP) foi avaliada usando um cateter Millar de microtálcula. Em suma, os ratos foram novamente anestesiados com cetamina (87 mg/kg bw) e xilazina (13 mg/kg bw), traqueotomizada e ventilada como descrito acima. O cateterismo cardíaco foi realizado após a toracotomia mediana32 através do ápice do (primeiro) ventrículo esquerdo e (segundo) do ventrículo direito, respectivamente, uma vez que o cateterismo direto do ventrículo esquerdo através da rota vascular é impedido pela banda aórtica em animais aoB. Após a eutanásia por uma overdose de cetamina/xilazina, o coração foi extirpado, e a hipertrofia ventricular foi avaliada como o peso do ventrículo esquerdo, incluindo septo (LV+S) ou o ventrículo direito (RV) normalizado para o peso corporal (BW). De acordo com os ratos aob como um modelo estabelecido para PH-LHD, os animais aoB mostraram um aumento significativo da hipertrofia LVSP e RV e RV em comparação com animais operados por vergonha em 3 semanas após a cirurgia (Figura 8A-F). A cirurgia de debandada (Deb) realizada na semana 3 após o AoB resultou em uma redução significativa tanto da hipertrofia lvsp quanto lv em comparação com animais aoB sem Deb na semana 3 e semana 5 pós-AoB, demonstrando que a normalização da hemodinâmica lv após a remoção do clipe da remodelagem reversa da aorta LV (Figura 8C,D). Em comparação com os ratos aoB na semana 3 e semana 5, os animais de Deb também apresentaram uma redução significativa no RVSP e RV/BW, demonstrando reversão bem sucedida do PH-LHD (Figura 8E,F). Notavelmente, o RVSP em ratos Deb era comparável aos valores medidos em animais falsos, indicando uma normalização completa da hemodinâmica rv. Em contraste, a hipertrofia rv em animais Deb foi apenas parcialmente revertida com RV/BW, permanecendo significativamente aumentada em comparação com os controles falsos (Figura 8E,F).
Figura 1: Representação esquemática dos procedimentos cirúrgicos e validação da reversão de PH em ratos aob. O esquema retrata os diferentes grupos experimentais utilizados no presente estudo para testar se a cirurgia de debandada reverte o PH-LHD. Sham, controles operados por farsas; AoB, banda aórtica; Deb, debandando. Triângulos marcam o ponto de tempo das intervenções cirúrgicas: operação primária (sham ou AoB; vermelho) na semana 0 e operação secundária (Deb; verde) na semana 3. Os círculos marcam as análises de ponto final nas quais o PH-LHD foi avaliado por pressões de LV e RV e medidas de hipertrofia, respectivamente. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 2: Instrumentos cirúrgicos. (A) Tesoura fina carboneto de tungstênio. (B) A fórceps de Moria Iris e (B') Fórceps graefedos serrados. As pontas dos fórceps são mostradas ampliadas. (C) Tesoura de mola Noyes. (D) Cânula traqueal. (E, E') 4-0 e 6-0 suturas, respectivamente. (F) Tesoura fina Tungstênio carboneto. (G) Espalhador de costela. (H) Suporte de agulhas Mathieu. (I) Esponja aponta tecido. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 3: Traqueotomia e toracotomia. As imagens ilustram os passos cirúrgicos para a traqueotomia. (A) Incisão cervical da linha média. (B) Incisão da traqueia entre dois anéis cartilaginosos. (C) C C cânula traqueal inserida na traqueia e presa com uma sutura. (D) A cânula traqueal está conectada a um ventilador mecânico. (E) As imagens ilustram os passos cirúrgicos para a toracotomia. (F) Incisão de pele entre a segunda e a terceira costelas. (G) Corte de músculos. (H) Criação de uma janela cirúrgica torácica espalhando a segunda e a terceira costelas. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 4: Visualização do clipe aórtico-constritor in vivo e ex vivo. (A) A imagem mostra a cavidade torácica de um rato AoB com um clipe de titânio colocado na aorta ascendente. (B) A imagem mostra clipe fechado e aberto ex vivo. O asterisco marca a parte do clipe que o porta-agulha comprime in vivo para abrir o clipe. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 5: Fechamento da ferida. As imagens ilustram o fechamento dos músculos torácicos superiores (A) e da pele (B) com uma sutura contínua simples. A traqueia (C) e os músculos infraidóides (D) são fechados por uma sutura simples e a pele no pescoço (E) por uma simples sutura contínua. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 6: Fluxo sanguíneo aórtico antes e depois da cirurgia debandada. (A-B) Visualização da aorta ascendente em um rato com bandagem aórtica (AoB, esquerda) e um rato após a cirurgia debandada (Deb, à direita) por ecocardiografia transtorácica. A seta mostra o clipe de titânio na aorta em (A) ausente em (B). (C,D) Imagens ecocardiográficas de ondas pulsadas do doppler mostram o fluxo sanguíneo antes do clipe em um rato AoB (C) e fluxo sanguíneo no segmento aórtico correspondente em um rato Deb (D) tirada um dia antes e um dia após a cirurgia de debandada aórtica, respectivamente. (E,F) Analogamente, as imagens mostram o fluxo sanguíneo no segmento aórtico após o clipe em um rato AoB (E) e no segmento aórtico correspondente em um rato Deb (F) tirado um dia antes e um dia após a cirurgia de debandada aórtica, respectivamente. Linhas verticais turquesas ilustram medições da velocidade de fluxo aórtico de pico. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 7: Normalização da função ventricular esquerda por debandagem aórtica. (A) As manchas ocidentais representativas mostram os níveis de proteína do BNP e com gapdh como controle de carga em ventrículos esquerdos (LV) de ratos AoB na semana 3 após bandagem aórtica (n = 5) e em controles falsos correspondentes (n = 5). (B) As manchas ocidentais representativas mostram BNP e GAPDH em ventrículos esquerdos (LV) de ratos AoB na semana 5 após bandagem aórtica (n = 4), em ratos de Deb na semana 5 (n = 5), e em controles falsos no tempo correspondente após cirurgia primária (n = 4). (C) As parcelas de caixa e bigode mostram quantificação da expressão BNP normalizada para GAPDH e controle falso no tempo correspondente após a cirurgia primária. As caixas apresentam mediana, 25, e 75 percentis, respectivamente; bigodes indicam os valores mínimos e máximos. Para análises estatísticas, foi utilizado o teste t33 do aluno. *valor p < 0,05. (D) Gráficos de barras (desvio padrão ± médio) mostram fração de ejeção de LV e volume em sham (n = 4), AoB (n = 9) e Animais de Deb (n = 7) na semana 5, medidos pela ecocardiografia a partir de imagens do modo M e B. (E) As imagens ecocardiográficas representativas do modo M mostram alterações no encurtamento fracionado lv em animais sham, AoB e Deb na semana 5. Para análises estatísticas foi utilizado o teste33 da Mann-Whitney U. *valor p < 0,05. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 8: A hemodinâmica ventricular é normalizada, e a hipertrofia cardíaca é revertida pela debandagem aórtica. (A) Medidas representativas da pressão arterial ventricular esquerda (LV) e ventricular direita (RV) em um rato 3 semanas após a banda aórtica (AoB) em comparação com o controle falso correspondente. (B) Imagens representativas mostram hipertrofia cardíaca em um rato AoB 3 semanas após a banda aórtica em comparação com o controle falso. (C-F) As parcelas de caixa e bigode mostram pressão sistólica ventricular esquerda (LVSP; C), hipertrofia LV ([LV+S]/BW; D), pressão sistólica ventricular direita (RVSP; E) e hipertrofia rv (RV/BW; F) em animais sham e AoB em 3 e 5 semanas após a cirurgia, e parâmetros normalizados (em comparação com grupos aoB de 3 e 5 semanas) em ratos Deb. As caixas apresentam mediana, 25, e 75 percentis, respectivamente; bigodes indicam os valores mínimos e máximos. n = 9-12 animais foram analisados para medidas hemodinâmicas, e o peso cardíaco foi medido em n = 7-12 ratos por grupo. Para análises estatísticas, u teste Mann-Whitney U foi utilizado. *valor p < 0,05. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
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Discussion
Aqui, é relatada uma técnica cirúrgica detalhada para debandar aórtico em um modelo aob de rato que pode ser utilizada para investigar a reversibilidade do PH-LHD e os mecanismos celulares e moleculares que impulsionam a remodelação reversa na vasculatura pulmonar e no RV. Três semanas de constrição aórtica em ratos juvenis resultam em PH-LHD evidente como aumento das pressões de LV, hipertrofia lv, e concomitantemente aumentado pressões de RV e hipertrofia rv. A debandagem do aórtico na semana 3 pós-AoB foi capaz de descarregar o LV e reverter totalmente a hipertrofia lv dentro de duas semanas após Deb. Paralelamente, a debandagem aórtica também causou uma normalização completa das pressões de RV e uma reversão parcial da hipertrofia rv.
O modelo atual imita, assim, aspectos críticos do cenário clínico onde o descarregamento mecânico da LV por um LVAD não pulsante implantável com propriedades de fluxo contínuo já foi encontrado para reverter a PH em pacientes com insuficiência cardíaca34,35. Em uma análise retrospectiva, o suporte lvad mostrou-se reduzir a pressão arterial pulmonar em graus semelhantes em pacientes com insuficiência cardíaca com PH reversível ou fixo, com PH fixo definido como pressão arterial pulmonar média > 25 mm Hg, resistência vascular pulmonar >2,5 Unidade de Madeira e um gradiente transpulmonar de pressão média > 12 mm Hg apesar do tratamento farmacológico35. É importante ressaltar que esses achados34,35 fornecem evidências indiretas de que o descarregamento ventricular esquerdo não só diminui o congestão pulmonar passiva e alterações secundárias no tom vascular pulmonar, mas desencadeia a remodelação reversa da vasculatura pulmonar por mecanismos "fisiológicos", ou seja, por adaptação à hemodinâmica alterada. Análises em profundidade e multi-omics dos processos celulares e moleculares que impulsionam a remodelação reversa na vasculatura pulmonar poderiam abrir novos caminhos para identificar novas opções terapêuticas para o tratamento de PH em pacientes com insuficiência cardíaca e potencialmente também em outras formas de PH, incluindo PAH. O presente modelo de debandada em ratos aob fornece uma possibilidade única para tais análises como a normalização completa do RVSP confirma a reversão efetiva da PH, permitindo assim que estudos mecanísticos identifiquem caminhos com a capacidade de restaurar processos homeostáticos na vasculatura pulmonar doente.
Com uma lógica semelhante, o modelo atual pode ser utilizado ainda para estudar processos intra e intercelulares que impulsionam a remodelação reversa da função RV. Recentemente, o RV foi reconhecido como um preditor significativo de prognóstico para morbidade e mortalidade em doenças cardiovasculares. No entanto, nenhuma terapia foi clinicamente aprovada para melhorar a funçãorv 36. Como tal, a capacidade de estudar processos de remodelação reversa no miocárdio rv em um modelo animal oferece uma oportunidade única para atender a uma lacuna significativa de conhecimento e uma necessidade médica crítica.
O sucesso do procedimento de desbandada aórtica tecnicamente desafiador em ratos aoB depende de habilidades cirúrgicas e estratégias perioperatórias precisas. Descritas a seguir estão etapas críticas do procedimento cirúrgico que podem causar letalidade perioperatória por sangramento excessivo (1-5) ou respiração insuficiente (6) e recomendações para evitar essas complicações.
(1) Durante uma toracotomia, a linha midernal precisa ser abordada cuidadosamente com uma tesoura para evitar ferimentos na artéria mamária interna. (2) Para visualizar o coração e as artérias do conduíte, o timo deve ser mobilizado e cuidadosamente realocado na direção craniana. Na cirurgia de desbandada, o tecido de timo é frequentemente conectado ao coração e artérias através de aderências pós-operatórias da cirurgia aoB original. Essas aderências devem ser cuidadosamente separadas com um par de fórceps contundentes para evitar lesões nas estruturas cardiovasculares. (3) Na cirurgia de desbandada, a aorta com o clipe é frequentemente incorporada no tecido conjuntivo. Este tecido conjuntivo deve ser suavemente dissecado com fórceps contundentes para visualizar o clipe. Aqui, a ecocardiografia transtorácica realizada antes da cirurgia é uma etapa útil de preparação, permitindo identificar se o clipe está localizado perto da raiz aórtica, no meio da aorta ascendente, ou perto da artéria braquiocefálica. Esse conhecimento economiza tempo precioso para a alocação de clipes durante a cirurgia. (4) A orientação do clipe é um passo crítico que deve ser considerado cuidadosamente durante a cirurgia inicial de banda aórtica. Para facilitar a avaliação ideal e a abertura rápida do clipe durante a debandada ao ao mesmo período, a parte que precisa ser compactada pelo suporte da agulha (Figura 4B) deve ser orientada ventricamente. A reorientação do clipe durante a cirurgia de debandada é viável, embora com risco de lesão na aorta. Para a reorientação do clipe, os clipes precisam ser mantidos por fórceps enquanto o tecido conjuntivo circundante é cuidadosamente removido, então o clipe deve ser mobilizado e virado. Segurar a aorta com os fórceps deve ser evitado. (5) Para debandar, o clipe deve ser segurado por um fórceps com uma mão e aberto com um suporte de agulha com a outra mão. A aorta não precisa ser levantada ventrally. (6) Após a conclusão do procedimento de desbandada, os ratos PH-LHD extubados correm um risco considerável de insuficiência respiratória, com animais comumente morrendo dentro de 10-20 minutos após a cirurgia enquanto ainda estão sob a anestesia. A atelectasia do pulmão esquerdo é a causa mais comum de morte neste período, e a ventilação mecânica prolongada antes do fechamento do peito ajuda a recrutar o pulmão e justificar respiração suficiente após a cirurgia.
Também sugerimos que, em comparação com a intubação endotraqueal realizada em estudos anteriores26,27, a traqueostomia proporciona um melhor controle da ventilação adequada durante os procedimentos cirúrgicos, o que é especificamente relevante durante a debandada aórtica. Esta noção baseia-se na seguinte lógica: (1) A traqueostomia, realizada rotineiramente em nosso laboratório para ventilação pulmonar perioperatória, é uma técnica simples e segura, sem complicações perioperatórias ou pós-operatórias. (2) A traqueostomia elimina o risco de intubação esofágica ou lesão traqueal; permite posicionamento e fixação precisos da cânula traqueal e controle visual constante da cânula durante todas as etapas do procedimento cirúrgico. (3) No momento da debandada aórtica, os animais aoB já estão com insuficiência cardíaca e são mais sensíveis ao estresse adicional; como resultado, os riscos potenciais que vêm com a intubação endotraqueal podem aumentar a letalidade. (4) Finalmente, quando o animal operado é desmamado do ventilador, mas não desenvolve respiração espontânea, uma traqueostomia permite uma reintubação rápida e reconexão com o ventilador, potencialmente salvando vidas devido à capacidade de ventilação pós-operatória prolongada.
O presente estudo relata uma técnica de debanding aórtica realizada 3 semanas após a banda aórtica inicial em ratos. Para estudos que visam comparar a remodelagem reversa da vasculatura pulmonar e do RV em diferentes estágios de PH, os procedimentos descritos também podem ser realizados em momentos posteriores após a banda aórtica. No entanto, a cautela é justificada, pois a cicatriz e o tecido conjuntivo ao redor da aorta provavelmente se tornarão mais abundantes com o tempo, complicando ainda mais o procedimento e exigindo solução e refinamento adicionais. Ao mesmo tempo, os princípios básicos do protocolo relatado ainda se aplicam.
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Disclosures
Os autores não têm conflitos de interesse para declarar. Todos os coautores viram e concordam com o conteúdo do manuscrito.
Acknowledgments
Esta pesquisa foi apoiada por doações do DZHK (Centro Alemão de Pesquisa Cardiovascular) à CK e à WMK, à BMBF (Ministério Alemão da Educação e Pesquisa) à CK no âmbito da VasBio, e à WMK no âmbito da VasBio, SYMPATH e PROVID, e à Fundação Alemã de Pesquisa (DFG) à WMK (SFB-TR84 A2, SFB-TR84 C9, SFB 1449 B1, SFB 1470 A4, KU1218/9-1 e KU1218/11-1).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Amoxicillin | Ratiopharm | PC: 04150075615985 | Antibiotic |
| Anti-BNP antibody | Abcam | ab239510 | Western Blotting |
| Aquasonic 100 Ultrasound gel | Parker Laboratories | BT-025-0037L | Echocardiography consumables |
| Bepanthen | Bayer | 6029009.00.00 | Eye ointment |
| Carprosol (Carprofen) | CP-Pharma | 401808.00.00 | Analgesic |
| Clip holder | Weck stainless USA | 523140S | Surgical instruments |
| Fine scissors Tungsten carbide | Fine Science Tools | 14568-12 | Surgical scissors |
| Fine scissors Tungsten carbide | Fine Science Tools | 14568-09 | Surgical scissors |
| High-resolution imaging system | FUJIFILM VisualSonics, Amsterdam, Netherlands | VeVo 3100 | Echocardiography machine. Images were acquired with pulse-wave Doppler mode, M-mode and B-mode |
| Isoflurane | CP-Pharma | 400806.00.00 | Anesthetic |
| Ketamine | CP-Pharma | 401650.00.00 | Anesthetic |
| Mathieu needle holder | Fine Science Tools | 12010-14 | Surgical instruments |
| Mechanical ventilator (Rodent ventilator) | UGO Basile S.R.L. | 7025 | Volume controlled respirator |
| Metal clip | Hemoclip | 523735 | Surgical consumables |
| Microscope | Leica | M651 | Manual surgical microscope for microsurgical procedures |
| Millar Mikro-Tip pressure catheters | ADInstruments | SPR-671 | Hemodynamics assessment |
| Moria Iris forceps | Fine Science Tools | 11373-12 | Surgical forceps |
| Noyes spring scissors | Fine Science Tools | 15013-12 | Surgical scissors |
| Povidone iodine/iodophor solution | B/Braun | 16332M01 | Disinfection |
| PowerLab | ADInstruments | 4_35 | Hemodynamics assessment |
| Prolene Suture, 4-0 | Ethicon | EH7830 | Surgical consumables |
| Rib spreader (Alm selfretaining retractor blunt, 70 mm, 2 3/4″) | Austos | AE-BV010R | Surgical instruments |
| Serrated Graefe forceps | Fine Science Tools | 11052-10 | Surgical forceps |
| Silk Suture, 4-0 | Ethicon | K871 | Surgical consumables |
| Skin disinfiction solution (colored) | B/Braun | 19412M07 | Disinfection |
| Spectra 360 Elektrode gel | Parker Laboratories | TB-250-0241H | Echocardiography consumables |
| Sponge points tissue | Sugi | REF 30601 | Surgical consumables |
| Sprague-Dawley rat | Janvier Labs, Le Genest-Saint-Isle, France | Study animals | |
| Tracheal cannula | Outer diameter 2 mm | ||
| Xylazin | CP-Pharma | 401510.00.00 | Anesthetic |
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