O presente protocolo descreve a precipitação de proteínas à base de solventes em condições controladas para recuperação e purificação robustas e rápidas de amostras de proteome antes da espectrometria de massa.
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Artigo de método
Precipitação de proteína orgânica baseada em solventes para purificação robusta de proteome antes da espectrometria de massa
Neste artigo
Resumo
Resumo
Embora os múltiplos avanços nos instrumentos de espectrometria de massa (MS) tenham melhorado a análise qualitativa e quantitativa do proteome, abordagens front-end mais confiáveis para isolar, enriquecer e processar proteínas à frente da ES são fundamentais para uma caracterização proteome bem-sucedida. Recuperação de proteínas baixas e inconsistentes e impurezas residuais, como surfactantes, são prejudiciais à análise de ESM. A precipitação proteica é muitas vezes considerada não confiável, demorada e tecnicamente desafiadora de executar em comparação com outras estratégias de preparação da amostra. Essas preocupações são superadas pela utilização de protocolos ideais de precipitação de proteínas. Para precipitação de acetona, a combinação de sais específicos, controle de temperatura, composição de solventes e tempo de precipitação é crítica, enquanto a eficiência da precipitação de clorofórmio/metanol/água depende da manipulação adequada da tubulação e do frasco. Alternativamente, esses protocolos de precipitação são simplificados e semi-automatizados dentro de um cartucho de spin descartável. Os resultados esperados da precipitação proteica à base de solventes no formato convencional e utilizando um cartucho descartável de filtragem e extração em dois estágios são ilustrados neste trabalho. Isso inclui a caracterização detalhada das misturas proteômicas por análise de LC-MS/MS de baixo para cima. O desempenho superior dos fluxos de trabalho baseados em SDS também é demonstrado em relação à proteína não contaminada.
Introdução
A análise proteome por espectrometria de massa tornou-se cada vez mais rigorosa, devido à sensibilidade, resolução, velocidade de varredura aprimorada e versatilidade dos instrumentos modernos de ESM. Os avanços em MS contribuem para maior eficiência de identificação de proteínas e uma quantitação mais precisa 1,2,3,4,5. Com a melhor instrumentação de ES, os pesquisadores exigem uma estratégia de preparação de amostra frontal correspondentemente consistente capaz de recuperação quantitativa de proteínas de ....
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Protocolo
1. Considerações materiais e pré-preparação da amostra
- Utilize apenas solventes de alta pureza (acetona, clorofórmio, metanol) (>99,5%) e produtos químicos, livres de excesso de umidade.
- Prepare as soluções de cloreto de sódio e sulfato de zinco (1 M) na água.
NOTA: As soluções de sal podem ser armazenadas indefinidamente à temperatura ambiente, desde que estejam livres de contaminantes ou crescimento microbiano. - Use o menor frasco de microcentrífugo de polipropileno (PP) suficiente para reter o volume necessário de amostra e solventes para induzir a precipitação.
- Certifique-se de que a concentração de SDS na....
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Resultados
A Figura 4 resume o esgotamento esperado do SDS após a precipitação facilitada por frascos ou cartuchos de proteínas em um cartucho de filtro descartável usando acetona. A incubação noturna convencional (-20 °C) em acetona é comparada com o protocolo de precipitação de acetona rápida à temperatura ambiente (passo 2), bem como a precipitação cmw (passo 4). A SDS residual foi quantificada pelo ensaio 29 das substâncias ativas azul-metileno (MBAS). Resumidamente, a amost.......
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Discussão
A caracterização ótima de MS é alcançada quando o SDS residual é esgotado abaixo de 10 ppm. Enquanto abordagens alternativas, como FASP e digestão on-bead, oferecem esgotamento quantitativo de SDS com recuperação variável 31,32,33, o objetivo principal da precipitação é maximizar a pureza e o rendimento simultaneamente. Isso depende de isolar efetivamente o supernasce (contendo o SDS) sem perturbar a pelota de proteína. Com prec.......
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Divulgações
O laboratório Doucette concebeu e patenteou o ProTrap XG empregado neste estudo. A AAD também é sócia-fundadora da Proteoform Scientific, que comercializou o cartucho de preparação da amostra.
Agradecimentos
Este trabalho foi financiado pelo Conselho de Ciências Naturais e Engenharia do Canadá. Os autores agradecem à Bioinformatics Solutions Inc. (Waterloo, Canadá) e ao SPARC BioCentre (Análise Molecular) no Hospital para Crianças Doentes (Toronto, Canadá) por suas contribuições para a aquisição de dados de MS.
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Materiais
| Nome | Empresa | Número de catálogo | Comentários |
|---|---|---|---|
| Acetona | Fisher Scientific | AC177170010 | ≤ 0,002 % aldeído |
| Acetonitrila | Fisher Scientific | A998-4 | Grau HPLC |
| Bicarbonato de Amônio | Millipore Sigma | A6141-1KG | sólido |
| Beta-mercaptoetanol | Millipore Sigma | M3148-25ML | Grau em biologia molecular |
| Azul de bromofenol | Millipore Sigma | B8026-5G | Bromofenol sal azul de sódio |
| Clorofórmio | Fisher Scientific | C298-400 | Clorofórmio |
| Ácido Fórmico | Honeywell | 56302 | Aditivo eluente para LC-MS |
| Espectrômetro de Massa Lumos de Fusão | ThermoFisher Scientific | para análise de mistura proteica padrão | |
| Glicerol | Millipore Sigma | 356352-1L-M | Para biologia molecular, > 99% |
| Isopropanol | Fisher Scientific | A4641 | Grau HPLC |
| Metanol | Fisher Scientific | A452SK-4 | Grau HPLC |
| Microcentrífuga | Fisher Scientific | 75-400-102 | Até 21.000 xG |
| Tubo de Microcentrífuga (1,5 mL) | Fisher Scientific | 05-408-130 | Fundo afilado |
| Tubo de Microcentrífuga (2 mL) | Fisher Scientific | 02-681-321 | Base arredondada |
| Dicas de Micropipeta (0.1-10 μ L) | Fisher Scientific | 21-197-28 | Ponta universal de pipeta, não estéril |
| Dicas de Micropipeta (1-200 & mu; L) | Fisher Scientific | 07-200-302 | Ponta universal de pipeta, não estéril |
| Dicas de Micropipeta (200-1000 & mu; L) | Fisher Scientific | 07-200-303 | Ponta universal de pipeta, não estéril |
| Micropipetas | Fisher Scientific | 13-710-903 | Pacote de Trio de Micropipetas |
| Pepsin | Millipore Sigma | P0525000 | Pó liofilizado, >3200 unidades/mg |
| ProTrap XG | Proteoform Scientific | PXG-0002 | 50 unidades completas por caixa |
| Cloreto de sódio | Millipore Sigma | S9888-1KG | Reagente ACS, >99% |
| Dodecil sulfato de sódio | ThermoFisher Scientific | 28312 | Pó sólido |
| Espectrômetro de Massa TimsTOF Pro | Bruker | para análise do extrato de proteoma do fígado | |
| Ácido Trifluoroacético | ThermoFisher Scientific | L06374. AP | 99% |
| Tris | Fisher Scientific | BP152-500 | Grau em biologia molecular |
| Tripsina | Millipore Sigma | 9002-07-7 | Do pâncreas bovino, tratado com TPCK |
| Ureia | Bio-Rad | 1610731 | sólido |
| Água (deionizada) | Sistema de Purificação de Água Mini Sartorius Arium | 76307-662 | Tipo 1 ultrapuro (18,2 MΩ cm) |
| Sulfato de Zinco | Millipore Sigma | 307491-100G | sólido |
Referências
- Kilpatrick, L. E., Kilpatrick, E. L. Optimizing high-resolution mass spectrometry for the identification of low-abundance post-translational modifications of intact proteins. Journal of Proteome Research. 16 (9), 3255-3265 (2017).
- Scheffler, K., Viner, R., Damoc, E.
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Reimpressões e permissões
