Artigo de método

Geração e Caracterização do Infarto do Miocárdio Ventricular Direito Induzido pela Ligação Permanente da Artéria Coronária Direita em Camundongos

DOI:

10.3791/63508

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1 de fevereiro de 2022

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1The First Clinical College of Dalian Medical University, 2Department of Cardiology, State Key Laboratory of Organ Failure Research, Nanfang Hospital, Southern Medical University, 3College of Pharmacy, Dalian Medical University

Neste artigo

Resumo

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Há várias diferenças entre os ventrículos direito e esquerdo. No entanto, a fisiopatologia do infarto ventricular direito (RVI) não foi esclarecida. No presente protocolo, é introduzido um método reprodutível para geração de modelos de mouse RVI, o que pode fornecer um meio de explicar o mecanismo do RVI.

Resumo

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

O infarto ventricular direito (RVI) é uma apresentação comum na prática clínica. RVI grave pode levar a disfunção hemodinâmica fatal e arritmia. Em contraste com o modelo de infarto do miocárdio (MI) extensivamente utilizado gerado pela ligadura da artéria coronária esquerda, o modelo de mouse RVI raramente é empregado devido à dificuldade associada à geração do modelo. Pesquisas sobre os mecanismos e tratamento da remodelação e disfunção de RV induzidas pelo RVI exigem modelos animais para imitar a fisiopatologia do RVI em pacientes. Este estudo introduz um procedimento viável para a geração de modelos RVI em camundongos C57BL/6J. Além disso, este modelo foi caracterizado com base no seguinte: avaliação do tamanho do infarto em 24 h após MI, avaliação de remodelagem cardíaca e função com ecocardiografia, avaliação hemodinâmica de RV e histologia da zona de infarto às 4 semanas após o RVI. Além disso, foi realizado um molde de vasculatura coronária para observar o arranjo arterial coronária na RV. Este modelo de mouse de RVI facilitaria a pesquisa sobre mecanismos de insuficiência cardíaca direita e buscaria novos alvos terapêuticos de remodelação de RV.

Introdução

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

O ventrículo direito (RV), considerado por muito tempo um tubo simples ligado à artéria pulmonar, foi negligenciado injustamente por muitos anos1. No entanto, tem havido um interesse crescente pela função RV recentemente, uma vez que desempenha um papel essencial nos distúrbios hemodinâmicos 2,3 e pode servir como um preditor de risco independente de doenças cardiovasculares 4,5,6,7. As doenças da RV incluem infarto de RV (RVI), hipertensão arterial pulmonar e doença valvular8. Em contraste com o imenso interesse pela hipertensão arterial pulmonar, o RVI permaneceu negligenciado 7,9.

RVI, geralmente acompanhado de infarto do miocárdio inferior-posterior10,11, é causado pela oclusão da artéria coronária direita (RCA). De acordo com investigações clínicas, o RVI grave provavelmente induz distúrbios hemodinâmicos e arritmias, como hipotensão, bradicardia e bloqueio atrioventricular, associados à maior morbidade hospitalar e mortalidade 12,13,14. A função RV poderia se recuperar espontaneamente até certo ponto, mesmo na ausência de reperfusão 15,16. Existem várias diferenças morfológicas e funcionais entre o ventrículo esquerdo (LV) e o RV17. Acredita-se que o RV seja mais resistente à isquemia do que a LV8, em parte devido à formação mais extensa de circulação colateral após o RVI. Esclarecer as diferenças entre o infarto de LV (LVI) e o RVI e identificar os mecanismos subjacentes forneceria novos alvos terapêuticos para a regeneração cardíaca e insuficiência cardíaca isquêmica. No entanto, devido à dificuldade associada à geração de modelos de mouse RVI, a pesquisa básica sobre RVI é limitada principalmente.

Um grande modelo animal de RVI tem sido gerado ligando RCA no suíno18, que é mais fácil de operar por causa da RCA visível. Em comparação com o modelo animal de grande porte, o modelo do mouse tem as seguintes vantagens: mais acessibilidade na manipulação genética, menor custo econômico e menor período experimental19,20. Embora um modelo de RVI do mouse com foco na influência do RVI na função LV tenha sido relatado anteriormente, as etapas detalhadas do procedimento, as dificuldades e os principais pontos de operação e as características do modelo, como alterações hemodinâmicas, não foram totalmenteintroduzidas 9,21.

Este artigo fornece procedimentos cirúrgicos detalhados para a geração de um modelo de camundongos de RVI. Além disso, este modelo foi caracterizado por medição ecocardiográfica, avaliação hemodinâmica invasiva e análise histológica. Além disso, foi realizado um molde de vasculatura coronária para observar o arranjo arterial coronária na caravana. A técnica introduzida neste artigo ajudaria os iniciantes a compreender rapidamente a geração do modelo RVI do mouse com mortalidade de operação aceitável e abordagens de avaliação confiáveis. O modelo de mouse de RVI ajudaria a pesquisar os mecanismos de insuficiência cardíaca direita e buscar novos alvos terapêuticos de remodelação de RV.

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Protocolo

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Todos os procedimentos foram realizados de acordo com o Guia para o Cuidado e Uso de Animais de Laboratório publicado pelos Institutos Nacionais de Saúde dos EUA (Publicação NIH nº 85-23, revisado em 1996) e aprovado pelo Comitê de Ética Animal do Hospital Nanfang, Southern Medical University (Guangzhou, China). Camundongos C57BL/6J masculinos saudáveis (8-10 semanas de idade; peso corporal, 25-30 g) foram obtidos do Centro Animal da Universidade Médica do Sul. Camundongos fêmeas também podem ser usados, mas misturar ambos os sexos não é recomendado devido às potenciais influências das diferenças sexuais. Após a chegada, os ratos foram alojados sob um ciclo escuro/claro de 12 h/12 h (3-4 ratos por gaiola), com comida e água ad libitum.

1. Preparação para cirurgia

  1. Esterilizar instrumentos cirúrgicos autoclavando antes da cirurgia. Ajuste a almofada de aquecimento para 37 °C.
  2. Anestesiar os camundongos por uma injeção intraperitoneal de 50 mg/kg de pentobarbital (ver Tabela de Materiais) para aliviar a dor cirúrgica. Coloque os ratos em caixas separadas para indução de anestesia. Certifique-se da profundidade da anestesia pela ausência de uma resposta de retirada dos dedos.
    NOTA: Também é recomendado o uso de isoflurano de 1,5% para anestesia de inalação, pois é melhor para analgesia.
  3. Coloque os ratos supinos na almofada fixando seus incisivos com uma sutura e imobilizando seus membros com fita adesiva. Certifique-se novamente da profundidade da anestesia verificando o reflexo.
  4. Remova o cabelo do pescoço para xiphoid com um creme depilatório. Desinfete a área cirúrgica 3 vezes com esfoliação antisséptica alternada e 75% de álcool e, em seguida, drape o campo cirúrgico.
  5. Realizar entubação seguindo os passos abaixo.
    1. Ajuste a frequência respiratória do animal com um mini ventilador (ver Tabela de Materiais) para 150/min e o volume da maré para 300 μL.
      NOTA: É desnecessário usar o modo de pressão final-expiratória positiva.
    2. Puxe a língua ligeiramente com pinças, levante a mandíbula com um depressor de língua para expor o glottis, e realize a intubação intra-traqueal inserindo uma cânula de 22 G no glottis.
    3. Ligue o mini ventilador e conecte a cânula traqueal ao ventilador. O fenômeno da ondulação torácica torácica se tornando igual à frequência do ventilador indica intubação bem sucedida. Corrija a cânula com fita adesiva para evitar escorregar durante a operação.

2. Ligadura permanente da artéria coronária direita

  1. Conecte os eletrocardiografia (ECG) (ver Tabela de Materiais) aos membros do mouse corretamente e registo o ECG.
    NOTA: Um dos líderes II, III ou AVF é selecionado como um lead de monitoramento; Chumbo III é mais apropriado.
  2. Abra o peito.
    1. Faça uma incisão de 1 cm de comprimento na pele paralela à terceira costela direita com uma tesoura oftálmica. Determine o terceiro intercostal novamente e garanta espaço adequado de acordo com o ângulo do esterno.
      NOTA: A direção da incisão da pele é feita do ângulo do esterno para a linha axilar anterior direita.
    2. Separe e corte os músculos peitoral e peitoral com tesoura e micro fórceps acima do terceiro espaço intercostal. Depois disso, separe sem rodeios o músculo intercostal com fórceps do cotovelo para expor o campo cirúrgico.
      NOTA: Apenas uma pequena parte dos músculos peitorais precisa ser cortada, e então uma separação contundente é recomendada para expor o coração.
    3. Inciso o pericárdio. Levante o átrio direito com algodão estéril e ligate a RCA com um 8-0 estéril linha de nylon com uma faixa de ligadura de 3-5 mm. Após a ligadura do RCA, o ECG de monitoramento (chumbo III) mostra elevação do segmento ST.
      NOTA: Como o RCA do mouse é invisível, sua localização anatômica deve ser cuidadosamente confirmada. O miocárdio do trailer é muito mais fino que o da LV. Portanto, é difícil entender a profundidade da agulha inserida. É fácil induzir bradicardia sinusa e bloqueio atrioventricular se a profundidade da agulha inserida for muito profunda e a faixa de ligadura é muito grande.
  3. Remova os músculos estéreis de algodão e sutura e a pele com um fio de nylon estéril 5-0 para fechar a incisão intercostal. Desinfete a pele novamente com 75% de álcool e abriga o rato após a cirurgia.
    NOTA: O músculo bem suturado é importante para evitar o aerotórax. Um tubo de drenagem estéril é colocado na cavidade torácica até a conclusão do fechamento do peito, e então a cavidade torácica é evacuada por uma seringa de injeção que liga o tubo de drenagem.
    NOTA: Após a cirurgia, os ratos são colocados em uma almofada de aquecimento. Analgésicos como buprenorfina (0,1 mg/kg de peso corporal, injeção subcutânea) são necessários para reduzir a dor dos animais após a cirurgia. As complicações esperadas são bradicardia sinusa e bloco atrioventricular, e a taxa de mortalidade pós-cirurgia é de 10 a 20%.

3. Avaliação ecocardiográfica da função RV após cirurgia

NOTA: Para a ecocardiografia, use uma sonda MS400D com uma frequência central de 30 MHz, conectada a um sistema de imagem de ultrassom de alta resolução (ver Tabela de Materiais). O exame de ecocardiografia é realizado 4 semanas após a cirurgia.

  1. Anestesiar o rato com 3% de isoflurane por inalação.
  2. Coloque o mouse na posição supina em uma plataforma ultrassônica para fixação animal e operação ultrassônica. Tape suas garras no eletrodo para obter uma gravação de ECG através de um sistema conectado à máquina ultrassônica.
  3. Monitore a frequência cardíaca através do ECG e mantenha-a entre 450-550 batidas/min, ajustando a concentração anestésico entre 1,5% e 3%.
  4. Retire o cabelo do peito do rato com um creme depilatório e aplique gel de ultrassom na pele do peito.
  5. Coloque a plataforma na posição horizontal. Oriente o transdutor paralelo à perna esquerda e obtenha a imagem ventricular de longo eixo esquerdo. Gire a sonda 90° no sentido horário para obter a visão do eixo curto LV. Pressione o botão da loja Cine para salvar as imagens.
    NOTA: A parte superior esquerda da plataforma está inclinada no ponto mais baixo. O ângulo de rotação do eixo curto LV do transdutor é mantido enquanto o transdutor é orientado para o ombro direito do mouse.
  6. Mova-se para baixo do transdutor verticalmente, mantendo sua posição sobre o abdômen superior e abaixo do diafragma do mouse sob o modo B. Ajuste ligeiramente a posição da plataforma girando seus eixos x e y até que o RV, o átrio direito (RA), o átrio esquerdo (LA) e o LV sejam claramente vistos na tela. Salve imagens apical de quatro câmaras pressionando a loja Cine ou o botão da loja Frame .
    NOTA: O modo B é usado para mostrar a visão de duas dimensões (2D) do coração.
  7. Pressione o modo M; após a linha indicadora 2x aparecer, localize a linha indicadora no orifício da válvula tricúspide para obter o movimento do plano anular tricúspide. Pressione a loja Cine ou o botão frame store para salvar dados e imagens.
    NOTA: Modo M significa modo de movimento, que revela o movimento do coração ou do vaso em uma forma de curva.
  8. Pressione o botão Medir para entrar no modo de medição. Clique no botão de medição da área para a região em RV e LV. Calcule a área de RV e LV para obter a razão de área de RV para LV.
    1. Clique no botão Linha do Tempo e faça duas linhas de base para definir a faixa de movimento do plano anular tricúsplica durante os períodos sistólico e diastólico. Clique no botão Distância e meça a distância entre duas linhas de base para obter excursão sistólica do plano anular tricúsplica (TAPSE).
  9. Incline o lado esquerdo da plataforma no ponto mais baixo. Mantenha a sonda em um ângulo de 30° para o eixo horizontal ao longo da linha axilar anterior direita. Gire os eixos x e y da plataforma para exibir o RV.
    1. Pressione o botão do modo M e localize a linha indicadora no ponto hiperérico do septo para obter a imagem do modo M da interface RV. Pressione o botão da loja Cine para salvar a imagem.
  10. Abra a imagem do modo M da interface RV, pressione o botão Medir para entrar no modo de medição. Meça a distância interna do RV no final da diastole (RVIDd), fração de ejeção de RV (RVEF) e encurtamento de fração RV (RVFS) utilizando a ferramenta de medição embutida do sistema ecocardiográfico.
  11. Pare de administrar isoflurane e coloque o rato na almofada de aquecimento por 3-5 minutos até que ele recupere a consciência. Depois disso, devolva o mouse à sua gaiola com 12 h de ciclo claro/escuro.

4. Medições invasivas do RV hemodinâmica

NOTA: A hemodinâmica do RV é avaliada através do cateterismo cardíaco direito 4 semanas após o RVI. Um cateter 1.0 F juntamente com um sistema de monitoramento é aplicado.

  1. Anestesiar o camundongo com uma injeção intraperitoneal de 50 mg/kg de pentobarbital de sódio (ver Tabela de Materiais).
  2. Após confirmar o desaparecimento do reflexo de retirada do pedal, mantenha o rato na posição supina e imobilize-o com fita adesiva.
  3. Raspe o cabelo do peito do ângulo severo para o xiphoide. Desinfetar a área de operação com 75% de álcool.
  4. Realizar intubação traqueal e definir o parâmetro do ventilador animal conforme descrito nas etapas 1.5.2-1.5.3.
  5. Faça uma incisão bilateral de 1 cm na pele acima do processo xifoide e transecte o diafragma e a costela com uma tesoura oftálmica para expor o coração.
  6. Puna a parede livre ventricular direita com uma agulha de 32 G. Retire a agulha e pressione a ferida com algodão para estancar o sangramento.
  7. Insira a ponta do cateter no ventrículo direito através do local da punção e empurre o cateter para a frente lentamente. Ajuste a posição da ponta para obter uma forma de onda de pressão típica do RV mostrada em um monitor e sistema de gravação.
    NOTA: A veia jugular direita também é uma rota apropriada para a medição hemodinâmica.
  8. Após 10 minutos de estabilização, registos os dados da pressão arterial sistólica do RV (RVSBP), da pressão diatólica final do RV (RVEDP) e do RV dP/dt. Clique no botão Selecionar para selecionar ciclos cardíacos para cálculo e, em seguida, clique no botão Analisar para calcular os valores médios dos ciclos selecionados.
  9. Remova o cateter após a conclusão da gravação e coloque-o dentro da solução salina normal.
  10. Eutanize o camundongo com uma injeção intraperitoneal de sódio pentobarbital de overdose (150 mg/kg) e, em seguida, sacrificá-lo por luxação cervical.
  11. Colete o coração e a tíbia para análise histológica.

5. Elenco vascular coronário usando um agente de fundição vascular

  1. Heparinize o camundongo com uma injeção intraperitoneal de 200 UI/mL de sódio de heparina a 2000 UI/kg (ver Tabela de Materiais).
  2. Anestesiar o camundongo com uma injeção intraperitoneal de 50 mg/kg de pentobarbital de sódio.
  3. Coloque o supino animal na almofada e entuba para ventilação artificial seguindo as etapas 1.5.2-1.5.3.
  4. Abra o peito com uma tesoura cirúrgica conforme descrito na etapa 4.5 e exponha o coração.
  5. Faça um entalhe de 3 mm com uma tesoura oftálmica na átrida direita e perfunda o coração com 5 mL de soro fisiológico normal através do ápice cardíaco com um injetor.
  6. Bloqueie o sangue da aorta com um grampo aórtico e perfume 0,1 mL de nitroglicerina (1 mg/mL) através do ápice cardíaco com um injetor para dilatar a artéria coronária.
  7. Prepare o reagente de elenco misturando os ingredientes no kit de acordo com as instruções do fabricante (ver Tabela de Materiais).
    NOTA: Recomenda-se preparar o reagente fundido e a perfusão com soro fisiológico normal e nitroglicerina simultaneamente para evitar o fechamento microvascular.
  8. Perfunda o coração com 1 mL de reagente fundido através do ápice cardíaco e espere por 2-3 h.
  9. Corroa o coração com hidróxido de sódio de 50% por 2-3 dias e remova o tecido muscular ou tecido conjuntivo enxaguando com soro fisiológico normal.
  10. Tire fotos debaixo de uma câmera.
    ATENÇÃO: O reagente fundido é prejudicial aos olhos, pele e trato respiratório. Hidróxido de sódio é corrosivo. Usar luvas de proteção, óculos e um jaleco é necessário. O reagente do elenco deve ser preparado em um capô de fumaça.

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Resultados

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Neste estudo, os camundongos foram aleatoriamente atribuídos ao grupo RVI (n = 11) ou operação falsa (n = 11). O molde coronário em 2 corações normais de rato é mostrado na Figura 1A. Em resposta à ligadura da RCA, a elevação do segmento ST foi observada no chumbo III do ECG (Figura 1B). Além disso, 2,3,5-triphenyl tetrazolium cloreto (TTC) manchas mostraram que a área de infarto representa 45% da parede livre de RV às 24 horas após o pós-operatório (

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Discussão

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Sicard e colegas da França relataram pela primeira vez um modelo de rato de RVI em 2019, que descreveu o processo cirúrgico e focou na interação entre LV e RV após rvi9. No entanto, até o momento, nenhum estudo relatou o uso desse modelo para estudos posteriores. Um procedimento mais detalhado seria útil para os pesquisadores usarem o modelo de mouse de RVI para investigação. Em contraste com o relatório de Sicard et al.9, fornecemos informações passo a passo para geração d...

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Divulgações

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Os autores não têm nada a revelar.

Agradecimentos

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Este trabalho foi apoiado por bolsas da Fundação Nacional de Ciência Natural da China (82073851 ao Sol) e da Fundação Nacional de Pós-Doutorado da China (2021M690074 para Lin).

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Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo
NomeEmpresaNúmero de catálogoComentários
cloreto de 2,3,5-trifeniltetrazólioSigmaT8877para coloração TTC
Mini ventilador animalHavardTipo 845para ventilação artificial
Sistema de ultrassom animal VEVO2100Medição de VEVO2100 sônico visualpara velocidade de fluxo Doppler e placa AS
Batson ' s #17 Kit de Corrosão AnatômicaPolyscience Inc7349Para fundição de vasculatura
buprenorfinaIsoreag1134630-70-8Para reduzir a dor de camundongos após a cirurgia
Camundongos C57BL/6J + D29A1A2:D27Centro Animal da Universidade Médica do Sul-Para a geração de modelo de RVI de camundongo
CâmeraSangnondPara tirar fotografia
Luz fria iluminadorOlympusILD-2Light para operação
eletrocardiógrafoADI InstrumentoADAS1000Para gravação de eletrocardiograma
creme de depilaçãoReckitt BenchiserRQ / B 33 Tipo 2Remover pêlos de rato
Almofada de calor - sistema cirúrgico termostático (ALC-HTP-S1)SHANGHAI ALCOTT BIOTECH COALC-HTP-S1Aquecimento
Hematoxilina-eosina coranteLeageneDH0003Coloração de hematoxilina-eosina
Sal de sódio de heparinaMacklinH837056Para heparização
IsofluranoRWD ciências da vidaR510-22Anestesia inalante
EspátulaFunciona como laringoscópio
CânulaPara intubação
Matrx VIP 3000 Vaporizador de isofuranoMidmark CorporationVIP 3000Anestesia
Sutura de nylon médica (5-0)Ningbo Medical Needle Co.5-0para o peito fechar
pinças de cotovelo microcirúrgicasRWD ciências da vidaF11021-11Para cirurgia
Tesoura microcirúrgicaNAPOXMB-54-1Para arteriotomia
Millar CatheterAD Instruments, Shanghai1.0FMedição do gradiente de pressão
Sonda ultrassônica MS400DVisual SonicMS400DMedição para fluxo Doppler velocidade e como
o fórcepsvisualF31006-12para a
nitroglicerinada cirurgia MEDICINA COYIMIN para dilatar a ciência
S11022-14da tesouraRWD da artériapara a cirurgia
Sal de sódio de PentobarbitalMerck25MGAnesthetization
PowerLab Multi-direcional Sistema de Registro FisiológicoAD Instruments, Xangai4/35Gravação de pressão
Balança eletrônica de precisãoDenver InstrumentTB-114Balança
de pesagem Sutura de seda (8-0)Ningbo Medical Needle Co.6-0ligadura da artéria coronária
Equipamento de microcirurgia para pequenos animaisNapoxMA-65Instrumentos cirúrgicos
pinça de tecidoVisual SonicF-12007-10para tesoura de tecido
cirúrgico Visual SonicS13052-12Peito aberto para medição hemodinâmica
Transmissão GelGuang Gong pai250MLpreparação para Grampos vasculares da medida da ecocardiografia
Sonic visualR31005-06para obstruir o sangue da aorta
feita em laboratório traqueal feita em laboratório da agulha da placa DE BEIJING da vida coronária coronária

Referências

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