A desregulação proteômica desempenha um papel importante na disseminação de gliomas difusos infiltrantes, mas várias proteínas relevantes permanecem não identificadas. O processamento espacial digital (DSP) oferece uma abordagem eficiente e de alto rendimento para caracterizar a expressão diferencial de proteínas candidatas que podem contribuir para a invasão e migração de gliomas infiltrativos.
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Artigo de método
Perfil Espacial Digital para Caracterização do Microambiente em Glioma Infiltrante Difuso do Tipo Adulto
Neste artigo
Resumo
Resumo
Gliomas de infiltração difusa estão associados a alta morbidade e mortalidade devido à natureza infiltrativa da disseminação tumoral. São tumores morfologicamente complexos, com alto grau de variabilidade proteômica tanto no próprio tumor quanto em seu microambiente heterogêneo. O potencial maligno desses tumores é reforçado pela desregulação de proteínas envolvidas em várias vias-chave, incluindo processos que mantêm a estabilidade celular e preservam a integridade estrutural do microambiente. Embora tenha havido numerosas análises de glioma a granel e unicelular, há uma relativa escassez de estratificação espacial desses dados proteômicos. A compreensão das diferenças na distribuição espacial de fatores tumorigênicos e populações de células imunes entre o tumor intrínseco, a borda invasiva e o microambiente oferece informações valiosas sobre os mecanismos subjacentes à proliferação e propagação do tumor. O perfil espacial digital (DSP) representa uma tecnologia poderosa que pode formar a base para essas importantes análises multicamadas.
O DSP é um método que quantifica eficientemente a expressão de proteínas dentro de regiões espaciais especificadas pelo usuário em uma amostra de tecido. O DSP é ideal para estudar a expressão diferencial de múltiplas proteínas dentro e entre regiões de distinção, permitindo múltiplos níveis de análise quantitativa e qualitativa. O protocolo DSP é sistemático e fácil de usar, permitindo a análise espacial personalizada de dados proteômicos. Neste experimento, microarranjos teciduais são construídos a partir de biópsias de núcleo de glioblastoma arquivadas. Em seguida, um painel de anticorpos é selecionado, visando proteínas de interesse dentro da amostra. Os anticorpos, que são pré-conjugados a oligonucleotídeos de DNA UV-fotoclevíveis, são então incubados com a amostra de tecido durante a noite. Sob a visualização por microscopia de fluorescência dos anticorpos, as regiões de interesse (ROIs) dentro das quais quantificar a expressão proteica são definidas com as amostras. A luz UV é então direcionada para cada ROI, clivando os oligonucleotídeos do DNA. Os oligonucleotídeos são microaspirados e contados dentro de cada ROI, quantificando a proteína correspondente em uma base espacial.
Introdução
Gliomas de infiltração difusa são o tipo mais comum de tumor cerebral maligno em adultos e são invariavelmente letais. A propensão para as células do glioma migrarem extensivamente no cérebro é um grande desafio terapêutico. O mecanismo pelo qual eles se espalham envolve migração dirigida e invasão descontrolada. Demonstrou-se que as células invasivas do glioma exibem tropismo e migração ao longo dos tratos da substância branca1, com pesquisas recentes implicando a desmielinização desses tratos como uma característica ativa e protumorigênica2. A invasão é mediada por uma transição epitelial-mesenquimal, na qual as célula....
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Protocolo
O protocolo descrito abaixo segue as diretrizes do Comitê de Ética em Pesquisa com Seres Humanos de Dartmouth-Hitchcock. O consentimento informado foi obtido dos pacientes cujas amostras de tecido foram incluídas neste estudo. Consulte a seção Tabela de Materiais para obter detalhes relacionados a todos os materiais, reagentes, equipamentos e softwares usados neste protocolo.
1. Preparação de slides17
- Recupere ou prepare tecido fixado em formalina e incorporado em parafina de gliomas difusamente infiltrados do tipo adulto humano.
NOTA: Neste experimento, foram utilizados....
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Resultados
A Figura 4 mostra os resultados representativos de um experimento de DSP realizado em amostras de glioblastoma. Um mapa de calor é apresentado, ilustrando um dos métodos pelos quais capturar dados visualmente usando o software DSP. As linhas representam alvos proteicos e cada coluna corresponde a uma região de interesse. Um intervalo de cores de azul a vermelho denota expressão baixa a alta, respectivamente. A variabilidade da cor dentro de uma linha reflete a heterogeneidade da proteína reg.......
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Discussão
Dada a diversidade de proteínas que poderiam potencialmente influenciar a agressividade dos gliomas e a noção de que várias dessas proteínas permanecem desconhecidas, um método de quantificação de proteínas de alto rendimento é uma abordagem tecnológica ideal. Além disso, dado que os dados espaciais em amostras oncológicas muitas vezes se correlacionam com a expressão diferencial18, a incorporação do perfil espacial na abordagem de quantificação de proteínas permite uma análise mais eficaz.
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Divulgações
Os autores não têm conflitos de interesse a divulgar.
Agradecimentos
Os autores reconhecem o apoio do Laboratório de Genômica Clínica e Tecnologia Avançada do Departamento de Patologia e Medicina Laboratorial do Dartmouth Hitchcock Health System. Os autores também reconhecem o Recurso Compartilhado de Patologia no Dartmouth Cancer Center com o NCI Cancer Center Support Grant 5P30 CA023108-37.
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Materiais
| Nome | Empresa | Número de catálogo | Comentários |
|---|---|---|---|
| Sistema de Detecção de Pesquisa BOND | Leica Biosystems, Wetzlar, Alemanha | DS9455 | Sistema de detecção aberto contendo recipientes abertos em uma bandeja de reagentes |
| BOND Wash | Leica Biosystems, Wetzlar, Alemanha | AR950 | Solução tampão concentrada 10X para lavagem de tecido fixo |
| Tampão W | NanoString, Seattle, WA | empresa de contato | reagente de bloqueio |
| Cy3 | Abcam, Cambridge, Reino Unido | AB188287 | Kit de conjugação de anticorpos fluorescentes Cy3 |
| GeoMx Digital Spatial Profiler (DSP) | NanoString, Seattle, WA | empresa de contato | Sistema para geração de imagens e caracterização de alvos de proteínas e RNA |
| GeoMx DSP Instrument BufferKit | NanoString, Seattle, WA | Kit de buffer de 100471 | para GeoMX DSP (incluindo tampões para processamento e preparação de amostras) |
| GeoMx Hyb Code Pack_Protein | NanoString, Seattle, WA | 121300401 | Controles para executar experiências GeoMX DSP |
| Painel de células imunes GeoMx (Imm Cell Pro_Hs) | NanoString, Seattle, WA | Módulo de | proteína 121300101 com alvos para células imunes humanas e alvos imuno-oncológicos |
| Painel Pan-Tumor GeoMx (Pan-Tumor_Hs) | NanoString, Seattle, WA | 121300105 | Módulo de proteína com alvos para vários tipos de tumores humanos e para marcadores de transição epitelial-mesenquimal |
| GeoMx Protein Slide Prep FFPE | NanoString, Seattle, WA | 121300308 | Reagentes de preparação de amostras para análise de proteínas GeoMX DSP |
| LEICA Bond RX | Leica Biosystems, Wetzlar, Alemanha | empresa de contato | coloração IHC totalmente automatizado |
| - 12 reações | NanoString, Seattle, WA | 100052 | Materiais e reagentes para uso com o sistema de análise nCounter |
| Sistema de análise nCounter | NanoString, Seattle, WA | Empresa de contato | automatizado para quantificação de expressão alvo multiplex (para ser usado com GeoMx DSP)TMA |
| Master II | 3DHistech Ltd., Budapeste, Hungria | Para criar o bloco de microarray de tecido |
Referências
- Pedersen, P. H., et al. Migratory patterns of lac-z transfected human glioma cells in the rat brain. International Journal of Cancer. 62 (6), 767-771 (1995).
- Wang, J., et al. Invasion of white ....
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Reimpressões e permissões
