Method Article

Um fluxo de trabalho integrado de identificação e quantificação no metabolome não-alvo baseado em controle FDR

DOI:

10.3791/63625

⸱

September 20th, 2022

 ,  ,  , 
1Key Laboratory of Functional Protein Research of Guangdong Higher Education Institutes and MOE Key Laboratory of Tumor Molecular Biology, Institute of Life and Health Engineering, College of Life Science and Technology, Jinan University, 2Chi-Biotech Co. Ltd.

* These authors contributed equally

In This Article

Summary

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Construímos um fluxo de trabalho metabolômico não-acompanhado que integrou XY-Meta e metaX juntos. Neste protocolo, exibimos como usar o XY-Meta para gerar uma biblioteca espectral chamariz a partir da referência de espectro de acesso aberto e, em seguida, executamos o controle FDR e usamos o metaX para quantificar os metabólitos depois de identificar o espectro metabolômico.

Abstract

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Técnicas de metabolômica não-alvo estão sendo amplamente utilizadas nos últimos anos. No entanto, o rápido aumento do rendimento e o número de amostras criam uma enorme quantidade de espectros, estabelecendo desafios para o controle de qualidade do espectrometria de massa. Para reduzir os falsos positivos, é necessário um controle de qualidade da taxa de descoberta falsa (FDR). Recentemente, desenvolvemos um software para controle FDR de identificação metabolome não direcionada que é baseado em uma estratégia de isca alvo chamada XY-Meta. Aqui, demonstramos um pipeline de análise completo que integra XY-Meta e metaX juntos. Este protocolo mostra como usar o XY-meta para gerar um banco de dados de isca a partir de um banco de dados de referência existente e executar o controle FDR usando a estratégia Target-Decoy para identificação metabolome em larga escala em um conjunto de dados de acesso aberto. A análise diferencial e a anotação dos metabólitos foram realizadas após a execução do metaX para picos metabólitos de detecção e quantitação. Para ajudar mais pesquisadores, também desenvolvemos uma plataforma de análise baseada em nuvem para essas análises, sem a necessidade de habilidades bioinformáticas ou qualquer linguagem de computador.

Introduction

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Os metabólitos desempenham papéis importantes nos processos biológicos. Metabólitos são frequentemente reguladores de vários processos como transferência de energia, regulamentos hormonais, regulação de neurotransmissores, comunicações celulares e modificações pós-translacionais de proteínas, etc 1,2,3,4. Metabolômica não-alvo fornece uma visão global de numerosos metabólitos 5,6. Com os avanços nas tecnologias de espectrometria de massa e cromatografia, o rendimento dos espectros metabolome MS/MS está aumentando rapidamente nos últimos anos 7,8,9,10,11. Para identificar metabólitos desses enormes conjuntos de dados, vários softwares de anotação foram desenvolvidos11, como MZmine12, MS-FINDER13, CFM-ID14, MetFrag15 e SLAW16. No entanto, essas identificações muitas vezes contêm muitos falsos positivos. As razões incluem: (1) Os espectros MS/MS contêm ruído aleatório, o que pode enganar a correspondência de pico. (2) Isômeros e diferenças nas energias de fragmentação causam múltiplas impressões digitais de espectro e, assim, aumentam o volume da biblioteca de referência. (3) A qualidade das bibliotecas de referência varia. É necessário um padrão adequado para construir uma boa biblioteca espectral de referência. Portanto, um controle sistemático de falsas taxas de descoberta (FDR) para metabolômica não-alvo é essencial para a pesquisa de metabolome funcional 7,8,9,17.

Tanto a abordagem empírica de Bayes quanto a estratégia target-decoy resolveram o problema de controle FDR em geral. Kerstin Scheubert et al. mostraram que a estratégia target-decoy no banco de dados de isca gerada a partir do método baseado em árvores de fragmentação é o melhor método para o controle FDR9. Xusheng Wang et al. projetaram um método para a geração de isca com base na regra do octeto em química e melhoraram a precisão da estimativa de FDR17. A biblioteca espectral para geração de banco de dados de isca foi demonstrada para melhor desempenho18. Aqui, melhoramos o método baseado em biblioteca espectral e desenvolvemos um software chamado XY-Meta19 que pode melhorar ainda mais a precisão da estimativa do FDR. Ele usa a biblioteca espectral de referência existente para gerar uma biblioteca de isca para o controle FDR sob o esquema Target-Decoy. XY-Meta suporta seus próprios algoritmos de correspondência de espectros e similaridade cossino. Permite modos convencionais de pesquisa e pesquisa iterativa. Na etapa de avaliação do FDR, ele suporta o modo concateado Target-Decoy e o modo separado. Para uma melhor flexibilidade, o XY-Meta aceita bibliotecas de isca externas.

A detecção e quantificação de picos de metabólitos também é um passo importante da análise metabolome não alvo. A detecção de picos é o principal método de identificação metabolome. Em geral, a precisão da detecção de pico de metabólitos foi afetada por múltiplos fatores, como sinais sonoros de espectrometria de massa, baixa abundância de metabólitos, contaminantes e produtos de degradação de metabólitos20. Quando o número de amostras é muito grande ou a coluna de cromatografia líquida foi substituída em experimentos de metabolome não-alvo, podem aparecer efeitos notáveis em lote, o que é um grande desafio para a quantitação metabolome 21,22,23. Atualmente, softwares como XCMS24, Workflow4Metabolomic25, iMet-Q26 e metaX19 podem realizar detecção de pico e quantitação de metabolome não-alvo, mas sugerimos que o pipeline de metaX é mais completo e fácil de usar. Aqui, demonstramos o processo de identificação e controle de FDR para um conjunto de dados disponível publicamente msv000084112 usando XY-Meta, e o pico de detecção e quantificação de metabólitos usando metaX. Este fluxo de trabalho requer apenas dois grupos, e cada grupo precisa de pelo menos duas amostras. Os dados de espectro de MS/MS são necessários, independentemente da plataforma de espectrômetro de massa, modo de ionização, modo de carga e tipo de amostra, e podem suportar a normalização baseada em amostras e a normalização baseada em picos. Seguindo este exemplo, os pesquisadores podem realizar a identificação e quantificação metabolômica de forma fácil de lidar. O uso deste pipeline requer capacidade de programação R. Para ajudar o pesquisador sem qualquer conhecimento de programação, também desenvolvemos uma plataforma de análise em nuvem para análise metabolômica. Demonstramos essa plataforma de análise de nuvem em Material Suplementar 5.

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Protocol

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1. Prepare os conjuntos de dados metabolômicos para análise

NOTA: Nesta demonstração, usamos conjuntos de dados metabolômicos sem amostra de QC. São necessários dados para grupos de casos e controle. Para demonstração, usamos um conjunto de dados público no banco de dados GNPS27.

  1. Vá para a página https://gnps.ucsd.edu/ProteoSAFe/static/gnps-splash.jsp. Clique em Procurar Conjuntos de dados.
  2. Pesquise a palavra-chave "msv000084112" na coluna Título . Clique no número de identificação do conjunto de dados para obter detalhes e baixe o conjunto de dados usando FTP.
  3. Coloque os dados brutos na pasta /msv000084112.
    NOTA: Este conjunto de dados foi adquirido usando C18 RP-UHPLC na plataforma Q Exactive no modo positivo. Representa uma coorte com uma doença não caracterizada do metabolismo de dados de amostras de urina, incluindo 33 amostras de pessoas saudáveis, 12 amostras em branco, duas amostras de mistura e 82 amostras de pacientes28 (Material Suplementar 8). Para demonstrar o fluxo de trabalho, escolhemos aleatoriamente seis amostras de pessoas saudáveis (NH) como grupo controle e seis amostras com a doença (NT) como um grupo de casos para realizar o fluxo de trabalho.

2. Conversão de formato de dados

NOTA: Se o conjunto de dados é o dados bruto gerados diretamente do espectrômetro de massa, geralmente está no formato .raw, .wiff ou .cdf. Eles devem ser convertidos em formatos mzXML e mgf. Aqui, usamos a ferramenta msconvert no pacote ProteoWizard29 para fazer a conversão de formato.

  1. Baixe o ProteoWizard de https://proteowizard.sourceforge.io/download.html e instale-o.
  2. Converta o formato de dados usando msconvert.exe sob o caminho de instalação ProteoWizard.
    1. Converta os dados brutos em formato mzXML e armazene-os em /mzXML folder:/msconvert.exe /raw/*.raw -o /raw/mzXML/ --filter "peakPicking true [1,2]" -filtro "zeroSamples removeExtra " -mzML --zlib --mz64 --filtro "msLevel 1-2" --filtro "titleMaker ... ".
    2. Converta os dados bruto/mzXML em formato mgf e armazene-os em /mgf folder:/msconvert.exe /msv000084112/*.raw -o /msv000084112/mgf/ --filter "peakPicking true [1,2 ]" -Filtro "zeroSamples removeExtra" --mgf --mz64 --filtro "msLevel 1-2" --filtro "titleMaker ... ".

3. Prepare a biblioteca espectral de referência para os metabólitos

NOTA: XY-meta suporta as bibliotecas espectrais de referência apenas no formato mgf.

  1. Vá para a página https://gnps.ucsd.edu/ProteoSAFe/libraries.jsp. Pesquise a palavra-chave "NIST" para encontrar o item. Clique em Exibir para obter os detalhes e baixe a biblioteca.
    NOTA: As Bibliotecas Espectrais Públicas do GNPS coletaram muitas bibliotecas metabólicas, dispostas em modos de tipo, origem, espécies e coleta. Embora apenas uma pequena fração dessas bibliotecas sejam geradas usando materiais padrão, elas geralmente são suficientes para a pesquisa mais fundamental.
  2. Coloque a biblioteca baixada GNPS-NIST14-MATCHES.mgf na pasta /banco de dados.

4. Identificação de metabólitos e controle de FDR

  1. Baixe o XY-meta (versão do Windows). Encontre o parâmetro de configuração do parâmetro de configuração.padrão na pasta /XY-Meta-Win/config/. Alterar seu conteúdo de acordo com Material Suplementar 1.
    NOTA: Na solução, metabólitos frequentemente formam adutos com ânions ou ânations, o que leva a uma mudança em massa de íons-mãe. Portanto, é necessário definir os tipos de adutos. Fornecemos listas de adutos para coluna de troca de íons e colunas analíticas reversas em modo de carga positiva e modo de carga negativa na pasta /aduct. Os usuários também podem editar sua própria lista de adutos de acordo com seu projeto de pesquisa. A lista de adutos deve estar no mesmo formato da lista fornecida.
  2. Realize a identificação metabólica e o controle FDR usando XY-Meta:XY-Meta.exe -S /XY-Meta-Win/config/parameter.default -D /msv000084112/ pos_wt-1_a.mgf -R /banco de dados/GNPS-NIST14-MATCHES.mgf.
    NOTA: XY-Meta não suporta curingas em parâmetros. Portanto, um único comando deve ser usado para processar cada arquivo mgf. Para um grande número de arquivos, um arquivo em lote é recomendado.

5. Análise diferencial

NOTA: metaX é um pacote R de código aberto. Por favor, instale-o de acordo com o guia em https://github.com/wenbostar/metaX. 8GB de RAM é necessário para esta análise.

  1. Editar um arquivo sampleList.txt para especificar a amostra e seus dados de MS correspondentes. Consulte o Material Complementar 2.
    NOTA: metaX suporta análise quantitativa para os conjuntos de dados com amostras de QC. Ao usar amostras de QC, por favor, modifique a propriedade da classe para na para amostras de QC.
  2. Criar/pasta de saída para armazenar os resultados da análise quantitativa. Use R para executar o script em Material Suplementar 3 para usar metaX para quantificar os grupos MOCK e WT.
    NOTA: Antes de executar o script em Material Suplementar 3, modifique os caminhos no script para os caminhos locais reais.

6. Integração dos resultados qualitativos e quantitativos

  1. Execute o script R em Material Suplementar 4 para anotar os picos em análise qualitativa e quantitativa utilizando identificações metabólicas.
    NOTA: Antes de executar o script em Material Suplementar 4, por favor, modifique os caminhos no script para seus caminhos locais reais.

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Results

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Os dados brutos de msv000084112 foram convertidos por msconvert.exe e arquivos MGF (Material Suplementar S6).

XY-Meta gerou arquivo GNPS-NIST14-MATCHES_Decoy.mgf em /pasta de banco de dados. Esta é a biblioteca de isca gerada a partir da biblioteca espectral de referência original GNPS-NIST14-MATCHES.mgf. Esta biblioteca de isca pode ser reutilizada. Ao reutilizar esta biblioteca de isca, o usuário deve definir o decoy_pattern como 1 em arquivo parameter.default e definir o ch...

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Discussion

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O controle fdr de metabólitos não-alvo tem sido um grande desafio. Aqui, demonstramos um pipeline completo de análise metabolômica não-alvo em larga escala (qualitativa e quantitativa) com controle FDR. Isso reduz efetivamente os falsos positivos, que são muito comuns na análise de ESM.

Preparar uma biblioteca espectral de referência apropriada para o seu estudo é um ponto-chave. Uma identificação de MS/MS bem-sucedida e sensível requer não apenas algoritmos adequados de correspondência, mas t...

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Disclosures

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Sem conflitos de interesse.

Acknowledgements

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Este trabalho é apoiado pelo Programa Nacional de Pesquisa e Desenvolvimento de Chaves (2018YFC0910200/2017YFA0505001) e pelo Programa de P&D De Chaves de Guangdong (2019B0226001).

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Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
GNPSde código aberton / ahttps://gnps.ucsd.edu/ProteoSAFe/static/gnps-splash.jsp
XY-Metacódigo aberton / ahttps://github.com/DLI-ShenZhen/XY-Meta
metaXde código aberton / ahttps://github.com/wenbostar/metaX
ProteoWizardDownload grátis3.0.22116.18c918b-x86_64https://proteowizard.sourceforge.io/download.html
CHI. Download grátis do clientendp48-x86-x64-allos-enuhttp://www.chi-biotech.com/technology.html?ty=ypt

References

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