Summary
Denne artikel præsenterer integrationen af et spektralfokuseringsmodul og en dual-output pulslaser, der muliggør hurtig hyperspektral billeddannelse af guldnanopartikler og kræftceller. Dette arbejde har til formål at demonstrere detaljerne i multimodale ikke-lineære optiske teknikker på et standard laserscanningsmikroskop.
Abstract
Sondering af guldnanopartikler (AuNP'er) i levende systemer er afgørende for at afsløre samspillet mellem AuNP'er og biologiske væv. Ved at integrere ikke-lineære optiske signaler såsom stimuleret Raman-spredning (SRS), to-foton-exciteret fluorescens (TPEF) og forbigående absorption (TA) i en billeddannelsesplatform kan den desuden bruges til at afsløre biomolekylær kontrast mellem cellulære strukturer og AuNP'er på en multimodal måde. Denne artikel præsenterer en multimodal ikke-lineær optisk mikroskopi og anvender den til at udføre kemisk specifik billeddannelse af AuNP'er i kræftceller. Denne billeddannelsesplatform giver en ny tilgang til udvikling af mere effektive funktionaliserede AuNP'er og bestemmelse af, om de er inden for vaskulaturer omkring tumor-, pericellulære eller cellulære rum.
Introduction
Guldnanopartikler (AuNP'er) har vist stort potentiale som biokompatible billeddannende sonder, for eksempel som effektive overfladeforstærkede Raman-spektroskopi (SERS) substrater i forskellige biomedicinske applikationer. Større anvendelser omfatter områder som biosensing, bioimaging, overfladeforbedrede spektroskopier og fototermisk terapi til kræftbehandling1. Desuden er sondering af AuNP'er i levende systemer afgørende for at vurdere og forstå samspillet mellem AuNP'er og biologiske systemer. Der er forskellige analytiske teknikker, herunder Fourier transform infrarød (FTIR) spektroskopi2, laserablation induktivt koblet massespektrometri (LA-ICP-MS)3 og magnetisk resonansbilleddannelse (MRI)4, der med succes er blevet brugt til at undersøge fordelingen af AuNP'er i væv. Ikke desto mindre lider disse metoder af flere ulemper, såsom at være tidskrævende og involvere kompleks prøveforberedelse3, der kræver lange anskaffelsestider, eller manglen på submikron rumlig opløsning 2,4.
Sammenlignet med konventionelle billeddannelsesteknikker giver ikke-lineær optisk mikroskopi flere fordele ved sondering af levende celler og AuNP'er: Den ikke-lineære optiske mikroskopi opnår dybere billeddybde og giver iboende 3D optisk sektionsfunktion ved brug af nær-IR ultrahurtige lasere. Med den betydelige forbedring af billeddannelseshastighed og detektionsfølsomhed er to-foton exciteret fluorescens (TPEF) 5,6,7 og anden harmoniske generation (SHG)8,9,10 mikroskopi blevet demonstreret for yderligere at forbedre ikke-invasiv billeddannelse af endogene biomolekyler i levende celler og væv. Desuden er det ved hjælp af nye pumpesonde ikke-lineære optiske teknikker såsom forbigående absorption (TA) 11,12,13,14 og stimuleret Raman-spredning (SRS)15,16,17,18 muligt at udlede etiketfri biokemisk kontrast mellem cellulære strukturer og AuNP'er. Visualisering af AuNP'er uden brug af ydre etiketter er af stor betydning, da kemiske forstyrrelser af nanopartiklerne vil ændre deres fysiske egenskaber og dermed deres optagelse i celler.
Denne protokol præsenterer implementeringen af et SF-TRU-modul (Spectral Focusing Timing and Recombination Unit) til en pulslaser med dobbelt bølgelængde, der muliggør hurtig multimodal billeddannelse af AuNP'er og kræftceller. Dette arbejde har til formål at demonstrere detaljerne i integrerede TPEF-, TA- og SRS-teknikker på et laserscanningsmikroskop.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Tænding af lasersystemet
- Tænd for sikringssystemet, og vælg armlaser, før du starter systemet.
- Tænd pc'en med softwaren til at styre femtosekundlaseren med dobbelt udgang.
- Indlæs softwaren til femtosekundlaseren med dobbelt udgang; Denne software gør det muligt at tænde og slukke for laseren og styrer direkte bølgelængden af pumpestrålen.
- Tænd for laseremissionen ved at holde tænd/sluk-ikonet nede for at tælle 3.
- Vent, indtil laseren er varmet op, og det laserklare lys lyser grønt i softwaren.
- Pumpestrålens bølgelængde styres direkte gennem softwaren; Dette kan variere fra 680-1.300 nm. For cellulær billeddannelse i C-H Raman-vibrationsområdet skal du vælge 802 nm.
- Åbn skodderne på den justerbare pumpestråle og 1.045 nm Stokes-strålen ved at holde blændebillederne nede i 3 s.
FORSIGTIG: Lasersikkerhedsvejledning Femtosekundlaseren med dobbelt udgang er en klasse IV infrarød pulserende laser og kan forårsage permanent skade på synet. Derfor skal alle lokale regler for lasersikkerhed følges, mens denne procedure udføres: (i) Kun autoriserede brugere, der har modtaget lasersikkerhedsuddannelse, kan udføre proceduren. (ii) Adgang til laboratoriet sker via swipe-kortadgang med en lås på rumdøren. iii) For det meste af operationen er laserstrålerne helt lukket. (iv) Når laserstrålen er eksponeret, skal lasersikkerhedsbriller bæres (brug LG9 lasersikkerhedsbriller, som giver OD 7+ blokering af både pumpen og Stokes stråler).
2. Tænding af spektralfokuseringstimingen og rekombinationsenheden (SF-TRU)
- Indlæs ATM-softwaren på den samme pc med lasersoftwaren, som styrer forsinkelsestrinnene og laserdæmperne i SF-TRU-enheden.
BEMÆRK: Denne enhed er ansvarlig for at sikre, at pumpen og Stokes-bjælkerne overlapper rumligt, styrer spredningen i pumpen og Stokes-bjælkerne og styrer tidsforsinkelsen mellem pumpen og Stokes-bjælkerne. Polariseringen af både pumpe- og Stokes-bjælker er lodret. Bemærk, at hver stråle er udstyret med en halvbølgeplade til uafhængigt at kontrollere polariseringer, inden de forlader SF-TRU. - Sørg for, at både pumpen og Stokes-laserne dæmpes til <10% (pumpe) og <15% (Stokes-stråler). Hvis strålerne ikke dæmpes, kan laserkraften forårsage skade på systemet og brænde biologiske prøver.
- For cellulær billeddannelse skal du indstille de optimale laserindstillinger til 6% (pumpe) og 10% (Stokes), svarende til 12 mW og 30 mW ved prøven.
- SF-TRU har to indstillinger: femtosekund (fs) tilstand og picosecond (ps) tilstand.
- For fs-tilstand skal du skubbe knapperne på hver side af kassen ind (dette fjerner dispersionsristene fra strålebanen).
- For ps-tilstand skal du trække knapperne ud på hver side af kassen (dette placerer dispersionsristene i strålebanen).
- For hyperspektral billeddannelse skal du vælge ps-tilstand.
- Sørg for, at forsinkelsestrinnet er i den korrekte position, så pumpen og Stokes-bjælkerne midlertidigt overlapper C-H-billeddannelsen på dette system.
- Sørg for, at pumpens og Stokes-strålens spredningsindstillinger er korrekte; for en 802 nm pumpe er dette 5 mm for pumpebjælken og 30 mm for Stokes-bjælken.
3. Modulering af Stokes-strålen til SRS-billeddannelse
- For SRS-detektion skal du modulere intensiteten af Stokes-strålen.
- Tænd for signalgeneratoren til strålemoduleringen.
- Husk tidligere indstillinger, som er som følger:
UDGANG 1: Kvadratisk bølge: Frekvens = 19,5 MHz, amplitude = 1,4 V.
UDGANG 2: Kvadratisk bølge: Frekvens = 19,5 MHz, amplitude = 300 mV. - Tænd for udgang 1 og 2.
- Tilslut Udgang 1 til en forstærker til EOM i SF-TRU-boksen via et BNC-kabel.
- Tilslut Output 2 til låseforstærkeren, der bruges til SRS-detektion via et BNC-kabel.
- Tænd for strømforsyningen til forstærkeren på portalen.
4. Tænd for låseforstærkeren
- Til SRS-billeddannelse skal du bruge SRS-detektionsmodulet, der består af en fotodiode med stort område og en specialbygget låseforstærker.
- Tænd for strømforsyningen til låseforstærkeren på portalen.
- Indlæs softwaren til låseforstærkeren "SRS detection Module" på pc'en.
- I softwaren skal du vælge følgende indstillinger: Phase = 0°, Offset = -80 mW, Gain = 58 dB.
- Vælg låseforstærkerens integrationstidskonstant i softwaren: til cellebilleddannelse giver tidskonstanten på 2 μs billeder af god kvalitet.
5. Betjening på laserscanningsmikroskopet
- Tænd for stik på alt udstyr undtagen fjernbetjeningsboksen. Vent, indtil standby er tændt på kontrolboksen placeret øverst på portalen.
- Tænd for fjernbetjeningsboksen på portalen, og tænd for bagsiden af kassen. Vent, indtil fjernlyset bliver blåt (på kontrolboksen), og tryk på Start Operation.
- Tænd pc'en på laserscanningsmikroskopet.
- Kør den konfokale mikroskopsoftware.
- Kontroller mikroskopets lyssti via computersoftwaren.
BEMÆRK: Der er foretaget nogle ændringer i mikroskopet for at gøre det egnet til SRS-billeddannelse: (i) I strålebanen er der tilføjet et 775 nm kort pas til filterhjulet, hvor laserstrålerne kommer ind i scanningsenheden, dette kan vælges under fanen Lightpath i computersoftwaren. (ii) I stedet for at bruge det konfokale mikroskops indbyggede PMT'er til detektion, er der tilføjet en skræddersyet detektor til den transmitterede lysvej, som muliggør både SRS- og CARS-detektion. (iii) Udgangene fra disse detektorer er forbundet til analogboksen på portalen. CARS-signal fra PMT er forbundet via et BNC-kabel til CD1, og SRS-signalet fra låseforstærkeren er forbundet via et BNC-kabel til CD2. - Styr fokus via berøringsskærmen eller fjernbetjeningsknapperne eller computersoftwaren.
- Vælg de ønskede billedindstillinger i softwaren; Dette inkluderer zoom, billedstørrelsen i pixels og pixelopholdstid.
- Sørg for, at billedbehandlingshastigheden (pixelopholdstid) er større end den integrationstid, der er indstillet i låseforstærkersoftwaren.
BEMÆRK: ET NA 1.2 vandnedsænkningsmål blev brugt til billeddannelse.
6. Montering af en prøve i mikroskopfasen
- Forbered celleprøverne til billeddannelse som følger.
- Kultur 4T1 mus brystcarcinomceller i RPMI-1640 suppleret med 10% føtalt kvægserum (FBS). Skift mediet hver 2. dag og passage cellerne ved 70% -80% sammenløb.
BEMÆRK: Passager 8-10 blev brugt i løbet af de eksperimenter, der er beskrevet her. - Til billeddannelsesforsøg inkuberes 1 x 10 5 celler på firkantede dækslips i 24 timer ved 37 °C,5 % CO2. Derefter vaskes cellerne med forvarmet fosfatbufferet saltvand (PBS) og inkuberes med guldnanopartikler (1:100 fortynding i cellekulturmedium, stamkoncentration: 2,3 x 10 10 partikler / ml, diameter:60 nm) i 4 timer.
- Før billeddannelse vaskes cellerne med iskold PBS og fastgøres med 4% paraformaldehyd i PBS i 15 minutter ved stuetemperatur (RT). Vask cellerne med PBS 3x, og monter derefter mellem to dækssedler til billeddannelse.
- Kultur 4T1 mus brystcarcinomceller i RPMI-1640 suppleret med 10% føtalt kvægserum (FBS). Skift mediet hver 2. dag og passage cellerne ved 70% -80% sammenløb.
- Anbring en dråbe destilleret vand oven på vandnedsænkningsmålet, der fokuserer laserstrålerne ind i prøven mellem målet og prøven. Placer derefter prøven på mikroskoptrinnet.
- En kondensator med NA 1.4 opsamler det fremadsprungne lys. Påfør en dråbe vand mellem kondensatoren og prøven til billeddannelse. Kondensatorens højde justeres til ca. 1 mm over prøveemnet for at opsamle den maksimale mængde lys.
- SRS-detektoren er på et bevægeligt beslag, som gør det muligt at glide ind og ud af opsamlingens optiske vej. For at fokusere på prøven ved hjælp af hvidt lys skal du flytte SRS-detektoren ud af strålebanen.
- Placer detektoren tilbage i strålebanen, klar til SRS-billeddannelse.
7. Ændring af Raman-skiftet og indsamling af en hyperspektral datastak
BEMÆRK: Raman-skiftet, hvor billeddannelsen finder sted, afhænger af forsinkelsestrinpositionen i SF-TRU-boksen og bølgelængden af pumpestrålen fra lasersystemet.
- For store ændringer i Raman-skiftet skal du ændre laserbølgelængden. For eksempel til billeddannelse af CH-vibrationer mellem 2.800-3.100 cm-1 skal du vælge 802 nm, mens du for billeddannelse omkring 1.600 cm-1 for amid I-toppen vælger pumpestrålen ved 898 nm. Juster dette via softwaren.
- For at opnå små justeringer i Raman-skiftet skal du scanne forsinkelsesfasen i SF-TRU-enheden.
- SF-TRU giver forsinkelsestrinpositioner i millimeter (mm). For at konvertere forsinkelsestrinpositionen fra mm til cm-1 skal du udføre kalibreringshyperspektralscanningen ved hjælp af en prøve af polystyrenperler og sammenligne de toppositioner, der findes i kalibreringsscanningen, med dem, der er taget på en spontan Raman-opsætning. Dette vil give en lineær ligning, som konverterer forsinkelsestrinpositionen i mm til Raman-skift i cm-1.
- For at generere en hyperspektral scanning skal du tage en tidsserie af billeder på forskellige forsinkelsestrinpositioner.
- For at synkronisere billedoptagelse og bevægelse af forsinkelsesfasen skal du bruge den analoge enhed til at sende og modtage TTL-signaler til og fra SF-TRU-systemet.
BEMÆRK: For at gøre dette har den analoge boks følgende forbindelser: (i) TRIG OUT VD1 - dette er forbundet til SF-TRU via en BNC og sender et TTL-signal for at fortælle forsinkelsestrinnet at flytte +1 trin. (ii) TRIG I 1 - her modtages et signal via BNC, når forsinkelsestrinnet er færdig med sin bevægelse, og dette bruges til at udløse det næste billede i tidsserien. - For det hyperspektrale datasæt skal du vælge følgende indstillinger i konfokalmikroskopsoftwaren:
- På fanen Trigger skal du vælge Start med TTL-udløser (ON) og Trigger (hver ramme).
- Under fanen Serie skal du indstille tidsserien ON og z-serien OFF.
- Indstil antallet af rammer i tidsserien, så det svarer til antallet af trin i ATM-softwaren (101 trin bruges her).
- I ATM-softwaren skal du gå til fanen Kør .
- Indstil forsinkelsestrinpositionerne i millimeter til start og stop af den hyperspektrale scanning. For CH-område med højt bølgetal skal du bruge startpositionen = 90,25 mm og stoppositionen = 92,25 mm.
- Sørg for, at antallet af trin svarer til antallet af rammer i konfokalmikroskopsoftwaren.
- Når du har kontrolleret de korrekte indstillinger, skal du først starte den hyperspektrale stak i konfokalmikroskopsoftwaren. Gå til Anskaf og klik på Start scanning. Klik derefter på Start i ATM-softwaren. Dette starter samlingen af en række billeder med trinvise stigninger i forsinkelsestrinpositionen mellem de valgte start- og stoppositioner
- Eksporter den hyperspektrale billedserie som en multi-frame .tif-fil, og brug en passende softwarepakke til at udføre kalibreringen.
- Når kalibreringen er afsluttet, skal du bruge den lineære kalibreringsligning til at konvertere forsinkelsestrinpositionen til Raman-skiftene.
- For at skifte mellem billeddannelse i CH-vibrationsområdet (2.800-3.100 cm-1) til amide I-vibrationsområdet 1.500-1.700 cm-1) skal du gøre følgende.
- Skift pumpebølgelængden i lasersoftwaren fra 802 nm til 898 nm.
- Skift Stokes dispersionsindstilling i ATM-softwaren fra 30 mm til 5 mm.
- Foretag en lille justering af spejlet i pumpestrålens spredningsvej inde i SF-TRU-boksen. Dette gøres ved at justere den nederste knap på spejlbeslaget, som ændrer spejlvinklen med en trinvis mængde.
- Når du udfører en hyperspektral scanning over amid I-regionen, skal du indstille start- og stoppositionerne i ATM-softwaren til henholdsvis 89 og 91 mm
FORSIGTIG: Lasersikkerhedsbriller skal bæres til dette trin, da laserstrålen vil blive udsat.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
SF-TRU-modulet (Spectral Focusing Timing and Recombination Unit) introduceres mellem femtosekundlaseren med dobbelt udgang og det modificerede laserscanningsmikroskop. Det justerbare ultrahurtige lasersystem, der anvendes i denne undersøgelse, har to udgangsporte, der leverer en stråle ved en fast bølgelængde på 1.045 nm og den anden stråle justerbar i området 680-1.300 nm. Et detaljeret skema over SF-TRU-modulet og multimodal billedbehandlingsplatform er afbildet i figur 1. SF-TRU er ansat til at kvidre to femtosekund laserstråler til picosekundimpulser og overlapper to stråler rumligt og tidsmæssigt. Hyperspektral stimuleret Raman-spredning (SRS) billeddannelse udføres ved at scanne forsinkelsen mellem picosecond-pumpen og Stokes-impulser.
Alle prøverne belyses af pulserende lasere gennem et højt numerisk blænde (NA) mål på et modificeret omvendt mikroskop. SRS- og TPEF-signalerne opsamles i fremadgående retning med en høj NA-kondensator. Til SRS-mikroskopi anvendes de justerbare (680-1.300 nm) og faste (1.045 nm) laserudgange som henholdsvis pumpen og Stokes-strålerne. Kombinationen af en fotodiode med stort område og indlåsningsforstærker bruges til at udføre SRS-billeddannelse, mens Stokes-strålen er blokeret med to filtre (890/210 båndpas og 950 nm kortpasfiltre). En vigtig fordel ved SRS-tilgangen med spektralfokusering i forhold til de picosekundlaserbaserede systemer er evnen til at indstille Raman-skiftet af interesse ved blot at kontrollere tidsforsinkelsen mellem den kvidrede pumpe og Stokes-impulser. Denne tilgang muliggør hurtig sondering af Raman-skift inden for et område på flere hundrede bølgenumre uden at ændre pumpen og Stokes-bølgelængderne, hvilket muliggør meget hurtigere hyperspektral billeddannelse.
For at validere udførelsen af spektralopløsning og kemisk selektivitet afbildes prøven af polystyren (PS) mikrosfærer først (figur 2). Lasereffekterne ved prøven (efter 60x NA 1.2 vandnedsænkningsmål) er 10 mW for 1.045 nm Stokes-strålen og 20 mW for 802 nm pumpestrålen. SRS-spektret kan udvindes ved hver pixel i rammerne. Figur 2B viser det hyperspektrale SRS-spektrum af PS-perler. Til sammenligning er det spontane Raman-spektrum af PS-perler vist i figur 2A. SRS og spontane Raman-spektre af PS-mikrosfærer er næsten identiske bortset fra relative intensitetsforskelle på siderne. Disse spektroskopiske målinger gør det muligt at konvertere optisk forsinkelseslinjetrin (mm) til Raman-bølgetal (cm-1) til SRS-billeddannelse.
Da Raman-spektrene af større biomolekyler i carbon-hydrogen-strækningsvibrationsbåndet ligger i området 2.800-3.050 cm-1, udføres SRS-billeddannelsen af 4T1-kræftceller ved 2.852 cm-1 (lipid), 2.930 cm-1 (protein), 2.968 cm-1 (DNA) og overlejringsbillederne som vist i figur 3. SRS-billeder af forskellige Raman-bånd erhverves med en pixelopholdstid på 4 μs ved en rammestørrelse på 512 x 512 pixels.
Endelig er denne metode yderligere udvidet til multimodal billeddannelse af 4T1 kræftceller doseret med guldnanopartikler (AuNP'er), hvilket giver os mulighed for at afbilde AuNP'ernes fordelinger i kræftceller mere præcist. De erhvervede SRS (CH2 og CH3 kanaler), TPEF (LysoTracker fluorescerende sonder) og TA (off-resonans SRS-kanal) billeder er afbildet i figur 4.
Figur 1: Skematisk af den hyperspektrale multimodale billeddannelsesplatform. Illustration af multimodal ikke-lineær optisk mikroskopi. DM, dikroisk spejl; DS, forsinkelsesfase; EOM, elektrooptisk modulator; FG, funktionsgenerator; FL, filter; G, gitter; LIA, låseforstærker; M, spejl; OBJ, mål; PD, fotodiode; PMT, fotomultiplier rør; SF-TRU, spektralfokuseringstiming og rekombinationsenhed. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 2: Spektre af polystyren (PS) mikrosfærer. Det spontane (A) Raman-spektrum af PS-mikrosfærer viser god overensstemmelse med det (B) hyperspektrale SRS-spektrum. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 3: Spektroskopisk SRS-billeddannelse af 4T1 kræftceller. SRS-billeder på 2.852 cm−1, 2.930 cm−1, 2.968 cm−1 og overlejringsbillede. Skala bar: 10 μm. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 4: Multimodal billeddannelse af guldnanopartikler optagelse af 4T1 kræftceller. Hyperspektrale SRS-billeder ved 2.852 cm−1 (CH2), 2.928 cm−1 (CH3), 3.080 cm−1 (off-resonans, kun TA-signal tilbage), TPEF og overlaybillede. Skala bar: 10 μm. Klik her for at se en større version af denne figur.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Denne undersøgelse har præsenteret kombinationen af SF-TRU-modul og ultrahurtigt dual-output lasersystem demonstreret sine anvendelser til multimodal mikrospektroskopi. Med sin evne til at undersøge guldnanopartiklers (AuNPs') optagelse af kræftceller kan den multimodale billeddannelsesplatform visualisere de cellulære reaktioner på hypertermiske kræftbehandlinger, når laserstråler absorberes af AuNP'er.
Desuden opnås hurtig kemisk specifik billeddannelse og høj spektralopløsning ved at anvende spektralfokuseringsteknikken ved hjælp af to sæt gitterpar til at styre kvidren i hver laserstråle. Sammenlignet med brugen af glasstænger med fast længde til kvidren gør gitterpar det muligt at matche spektralopløsningen og linjebredderne på Raman-linjerne af interesse19.
Desuden kan dette system let skiftes fra femtosekund til kvidrede picosekundregimer ved at bruge specialdesignede manuelle skydere til at fjerne ristene fra strålebanerne uden at påvirke justeringen inde i mikroskopet. For at opnå høj følsomhed og spektralopløsning implementeres SRS typisk ved hjælp af smalbåndets picosekundpumpe og Stokes-impulser. Picosekundlasere er imidlertid ikke tilstrækkelige til multiphoton excitation, der kræver højere spidseffektniveauer, som kan opnås med femtosekundlasere. De multimodale muligheder gør det muligt at bruge metoden til en række forskellige applikationer såsom multiphoton imaging20, sammenhængende Raman-spredning21 og pumpesondespektroskopi.
Der er flere strategier, der kan bruges til yderligere at forbedre ydeevnen for den demonstrerede enhed. For eksempel tilbyder et hurtigere motoriseret forsinkelseslinjetrin og dataindsamlingssoftware en højere billedbehandlingshastighed, hvilket kan øge gennemstrømningen af den multimodale billedbehandlingsplatform. Derudover dækkede den nuværende opsætning ~ 300 cm-1 spektralområde med en spektralopløsning op til 5 cm-1. For yderligere at udvide spektralområdet er et modificeret lasersystem med en bredere spektralbåndbredde blevet anvendt til hyperspektral SRS-mikroskopi22.
Samlet set giver denne multimodale og ikke-invasive billeddannelsesplatform ny indsigt i nanomedicin og åbner en ny vej til multimodal molekylær billeddannelse af celler, biologiske væv og nanopartikler med højt indhold23,24,25.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne erklærer ingen interessekonflikter.
Acknowledgments
Denne forskning blev støttet af EPSRC Grants: Raman Nanotheranostics (EP/R020965/1) og CONTRAST-facilitet (EP/S009957/1).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| APE SRS Detection Unit | APE (Angewandte Physik & Elektronik GmbH) | APE Lock-in Module | Combined system containing a large area Si photo-diode for detecting the pump beam along with a Lock-In amplifier for detecting the beam modulations |
| Confocal Scanning Unit | Olympus | FV 3000 | Confocal scanning unit used for imaging |
| CML Latex Beads, 4% w/v, 1.0 µm | Invitrogen | C37483 | Polystyrene microspheres |
| Coverslips | Thorlabs | CG15CH2 | 22 mm x 22 mm coverslips for seeding cells |
| FBS | Gibco | 10500-064 | Foetal Bovine Serum (Heat Inactivated) |
| Flouview | Olympus | FV31S-SW | Laser scanning microscope control software |
| Function Generator | BX precision | 40543 | Used to generate square wave function which is fed to EOM in SF-TRU to produce modulations in the stokes beam |
| Gold Nanoparticles | Nanopartz | A11-60 | Spherical gold nanoparticles, 60 nm diameter |
| Input Output Interface | Olympus | FV30 ANALOG | This unit allows voltage readouts from PMT and LockIn to be fed into the confocal scanning software and allows timing pulses to be sent between the olympus microscope and the SF-TRU unit. |
| InSight X3 | Newport | Spectra-Physics | Dual-output femtosecond pulsed laser. Tunable (680–1300 nm) and fixed (1045 nm) laser outputs with the repetition rate of 80 MHz. |
| Microscope Frame | Olympus | IX83 | Inverted microscope |
| Mouse 4T1 cells | ATCC | CRL-2539 | Mouse breast cancer cells |
| NA 1.2 Water Immersion Objective | Olympus | UPLSAPO60XW/IR | The multiphoton 60x Objective has a 0.28 mm working distance. Other similar objectives can be used. |
| NA 1.4 Condenser | Nikon | CSC1003 | Other condensers with NA higher than the excitation objective can also be used. |
| PMT | Hamamatsu | R3896 | PMT used for detecting anti-stokes photos for CARS micrsocopy |
| PMT Connector | Hamamatsu | C13654-01-Y002 | Connector for PMT |
| Power Supply | RS | RSPD-3303 C | Programmable power supply which is used for providing the correct voltage to the PMT |
| RPMI-1640 | Gibco | A10491-01 | Roswell Park Memorial Institute (RPMI) 1640 Medium has since been found suitable for a variety of mammalian cells. |
| SF-TRU | Newport Spectra Physics | SF-TRU | System designed for controlling the time delay and dispersion of the 2 laser outputs and for performing the beam modulations required for SRS |
References
- Tabish, T. A., et al. Smart gold nanostructures for light mediated cancer theranostics: Combining optical diagnostics with photothermal therapy. Advanced Science. 7 (15), Weinheim, Baden-Württemberg, Germany. 1903441 (2020).
- Tian, F., et al. Gold nanostars for efficient in vitro and in vivo real-time SERS detection and drug delivery via plasmonic-tunable Raman/FTIR imaging. Biomaterials. 106, 87-97 (2016).
- Jenkins, S. V., et al. Enhanced photothermal treatment efficacy and normal tissue protection via vascular targeted gold nanocages. Nanotheranostics. 3 (2), 145-155 (2019).
- Huang, J., et al. Rational design and synthesis of gammaFe2 O3 @Au magnetic gold nanoflowers for efficient cancer theranostics. Advanced Materials. 27 (34), Deerfield Beach, Fla. 5049-5056 (2015).
- Dilipkumar, A., et al. Label-free multiphoton endomicroscopy for minimally invasive in vivo imaging. Advanced science. 6 (8), Weinheim, Baden-Württemberg, Germany. 1801735 (2019).
- Wang, C. -C., et al. Differentiation of normal and cancerous lung tissues by multiphoton imaging. Journal of Biomedical Optics. 14 (4), 044034 (2009).
- Chrabaszcz, K., et al. Comparison of standard and HD FT-IR with multimodal CARS/TPEF/SHG/FLIMS imaging in the detection of the early stage of pulmonary metastasis of murine breast cancer. The Analyst. 145 (14), 4982-4990 (2020).
- Tsai, T. H., et al. Visualizing radiofrequency-skin interaction using multiphoton microscopy in vivo. Journal of Dermatological Science. 65 (2), 95-101 (2012).
- Wang, C. -C., et al. Early development of cutaneous cancer revealed by intravital nonlinear optical microscopy. Applied Physics Letters. 97 (11), 113702 (2010).
- Li, F. -C., et al. Dorsal skin fold chamber for high resolution multiphoton imaging. Optical and Quantum Electronics. 37 (13), 1439-1445 (2005).
- Tong, L., et al. Label-free imaging of semiconducting and metallic carbon nanotubes in cells and mice using transient absorption microscopy. Nature Nanotechnology. 7 (1), 56-61 (2011).
- Chong, S., Min, W., Xie, X. S. Ground-state depletion microscopy: Detection sensitivity of single-molecule optical absorption at room temperature. The Journal of Physical Chemistry Letters. 1 (23), 3316-3322 (2010).
- Chen, T., et al. Transient absorption microscopy of gold nanorods as spectrally orthogonal labels in live cells. Nanoscale. 6 (18), 10536-10539 (2014).
- Liu, J., Irudayaraj, J. M. Non-fluorescent quantification of single mRNA with transient absorption microscopy. Nanoscale. 8 (46), 19242-19248 (2016).
- Freudiger, C. W., et al. Label-free biomedical imaging with high sensitivity by stimulated Raman scattering microscopy. Science. 322 (5909), 1857-1861 (2008).
- Wang, C. -C., et al. In situ chemically specific mapping of agrochemical seed coatings using stimulated Raman scattering microscopy. Journal of Biophotonics. 11 (11), 201800108 (2018).
- Wang, C. -C., Yoong, F. -Y., Penfield, S., Moger, J. Visualization of active ingredients uptake in seed coats with stimulated Raman scattering microscopy. Proceedings SPIE 10069, Multiphoton Microscopy the Biomedical Sciences XVII. , 1006928 (2017).
- Hu, F., Shi, L., Min, W. Biological imaging of chemical bonds by stimulated Raman scattering microscopy. Nature Methods. 16 (9), 830-842 (2019).
- Zeytunyan, A., Baldacchini, T., Zadoyan, R. Module for multiphoton high-resolution hyperspectral imaging and spectroscopy. Proceedings SPIE 10498, Multiphoton Microscopy in the Biomedical Sciences XVIII. , 104980 (2018).
- Wang, C. -C., Wu, R. -J., Lin, S. -J., Chen, Y. -F., Dong, C. -Y. Label-free discrimination of normal and pulmonary cancer tissues using multiphoton fluorescence ratiometric microscopy. Applied Physics Letters. 97 (4), 043706 (2010).
- Wang, C. -C., Chandrappa, D., Smirnoff, N., Moger, J. Monitoring lipid accumulation in the green microalga botryococcus braunii with frequency-modulated stimulated Raman scattering. Proceedings SPIE 9329, Multiphoton Microscopy in the Biomedical Sciences XV. , 9329 (2015).
- Figueroa, B., et al. Broadband hyperspectral stimulated Raman scattering microscopy with a parabolic fiber amplifier source. Biomedical Optics Express. 9 (12), 6116-6131 (2018).
- Cui, L., et al. In situ plasmon-enhanced CARS and TPEF for Gram staining identification of non-fluorescent bacteria. Spectrochimica Acta Part A: Molecular and Biomolecular Spectroscopy. 264, 120283 (2022).
- Ma, J., Sun, M. Nonlinear optical microscopies (NOMs) and plasmon-enhanced NOMs for biology and 2D materials. Nanophotonics. 9 (6), 1341-1358 (2020).
- Sun, L., Chen, Y., Sun, M. Exploring nonemissive excited-state intramolecular proton transfer by plasmon-enhanced hyper-Raman scattering and two-photon excitation fluorescence. The Journal of Physical Chemistry C. 126 (1), 487-492 (2022).
