Summary
Denna artikel presenterar integrationen av en spektralfokuseringsmodul och en pulslaser med dubbla utgångar, vilket möjliggör snabb hyperspektral avbildning av guldnanopartiklar och cancerceller. Detta arbete syftar till att demonstrera detaljerna i multimodala olinjära optiska tekniker på ett standardlaserscanningsmikroskop.
Abstract
Att undersöka guldnanopartiklar (AuNPs) i levande system är viktigt för att avslöja interaktionen mellan AuNPs och biologiska vävnader. Dessutom, genom att integrera olinjära optiska signaler såsom stimulerad Raman-spridning (SRS), tvåfotonexciterad fluorescens (TPEF) och övergående absorption (TA) i en bildplattform, kan den användas för att avslöja biomolekylär kontrast av cellulära strukturer och AuNPs på ett multimodalt sätt. Denna artikel presenterar en multimodal olinjär optisk mikroskopi och tillämpar den för att utföra kemiskt specifik avbildning av AuNPs i cancerceller. Denna bildplattform ger ett nytt tillvägagångssätt för att utveckla effektivare funktionaliserade AuNPs och avgöra om de befinner sig inom vaskulaturer som omger tumören, pericellulära eller cellulära utrymmen.
Introduction
Guldnanopartiklar (AuNPs) har visat stor potential som biokompatibla avbildningssonder, till exempel som effektiva ytförstärkta Raman-spektroskopi (SERS) substrat i olika biomedicinska applikationer. Större tillämpningar inkluderar områden som biosensing, bioimaging, ytförbättrade spektroskopier och fototermisk terapi för cancerbehandling1. Dessutom är det avgörande att undersöka AuNPs i levande system för att bedöma och förstå interaktionen mellan AuNPs och biologiska system. Det finns olika analytiska tekniker, inklusive Fourier transform infraröd (FTIR) spektroskopi2, laserablation induktivt kopplad masspektrometri (LA-ICP-MS)3 och magnetisk resonanstomografi (MRI)4 som framgångsrikt har använts för att undersöka fördelningen av AuNP i vävnader. Icke desto mindre lider dessa metoder av flera nackdelar som att de är tidskrävande och involverar komplex provberedning3, vilket kräver långa förvärvstider eller bristen på submikron rumslig upplösning 2,4.
Jämfört med konventionella bildtekniker erbjuder olinjär optisk mikroskopi flera fördelar för att undersöka levande celler och AuNP: Den olinjära optiska mikroskopin uppnår djupare bilddjup och ger inneboende 3D-optisk sektionskapacitet med användning av nästan IR ultrasnabba lasrar. Med den signifikanta förbättringen av bildhastighet och detektionskänslighet har tvåfotonexciterad fluorescens (TPEF) 5,6,7 och andra harmonisk generation (SHG) 8,9,10 mikroskopi visat sig ytterligare förbättra icke-invasiv avbildning av endogena biomolekyler i levande celler och vävnader. Dessutom, med hjälp av nya pump-sond olinjära optiska tekniker såsom transient absorption (TA) 11,12,13,14 och stimulerad Raman-spridning (SRS) 15,16,17,18, är det möjligt att härleda etikettfri biokemisk kontrast av cellulära strukturer och AuNPs. Att visualisera AuNPs utan användning av yttre etiketter är av stor betydelse eftersom kemiska störningar av nanopartiklarna kommer att modifiera deras fysikaliska egenskaper och därmed deras upptag i celler.
Detta protokoll presenterar implementeringen av en SF-TRU-modul (Spectral Focusing Timing and Recombination Unit) för en pulslaser med dubbla våglängder, vilket möjliggör snabb multimodal avbildning av AuNPs och cancerceller. Detta arbete syftar till att demonstrera detaljerna i integrerade TPEF-, TA- och SRS-tekniker på ett laserskanningsmikroskop.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Slå på lasersystemet
- Slå på förreglingssystemet och välj armlaser innan du startar systemet.
- Slå på datorn med programvaran för att styra femtosekundlasern med dubbla utgångar.
- Ladda programvaran för femtosekundlasern med dubbla utgångar; Denna programvara gör att lasern kan slås på och av och direkt styr pumpstrålens våglängd.
- Slå på laseremissionen genom att hålla ned strömikonen för att räkna med 3.
- Vänta tills lasern har värmts upp och det laserklara ljuset lyser grönt i programvaran.
- Pumpstrålens våglängd styrs direkt genom programvaran; Detta kan sträcka sig från 680-1,300 nm. För cellulär avbildning i C-H Raman-vibrationsområdet, välj 802 nm.
- Öppna fönsterluckorna på den avstämbara pumpbalken och 1 045 nm Stokes-balken genom att hålla ned bländarbilderna i 3 s.
VARNING: Lasersäkerhetsvägledning femtosekundlasern med dubbla utgångar är en klass IV infraröd pulserad laser och kan orsaka permanent synskada. Därför måste alla lokala regler för lasersäkerhet följas när du utför denna procedur: (i) Endast auktoriserade användare som har fått lasersäkerhetsutbildning kan utföra proceduren. (ii) Inträde till labbet sker via svepkortsåtkomst med ett lås på rumsdörren. iii) Under större delen av verksamheten är laserstrålarna helt slutna. (iv) När laserstrålen exponeras måste lasersäkerhetsglasögon bäras (använd LG9 lasersäkerhetsglasögon, som ger OD 7+ blockering av både pumpen och Stokes-strålarna).
2. Slå på spektralfokuseringstidpunkten och rekombinationsenheten (SF-TRU)
- Ladda ATM-programvaran på samma dator med laserprogramvaran, som styr fördröjningsstegen och laserdämparna i SF-TRU-enheten.
OBS: Denna enhet är ansvarig för att se till att pump- och Stokes-balkarna är rumsligt överlappade, kontrollera dispersionen i pump- och Stokes-balkarna och kontrollera tidsfördröjningen mellan pumpen och Stokes-balkarna. Polarisationen av både pump- och Stokes-balkar är vertikal. Observera att varje stråle är utrustad med en halvvågsplatta för att oberoende styra polarisationer innan den lämnar SF-TRU. - Se till att både pumpen och Stokes lasrar är dämpade till <10% (pump) och <15% (Stokes strålar). Om strålar inte dämpas kan laserkraften orsaka skador på systemet och kommer att bränna biologiska prover.
- För cellulär avbildning, ställ in de optimala laserinställningarna på 6% (pump) och 10% (Stokes), vilket motsvarar 12 mW och 30 mW vid provet.
- SF-TRU har två inställningar: femtosekund (fs) läge och picosekund (ps) läge.
- För fs-läge, tryck in vreden på vardera sidan av lådan (detta tar bort dispersionsgallren från strålbanan).
- För ps-läge, dra ut vreden på vardera sidan av lådan (detta placerar dispersionsgallren i strålbanan).
- För hyperspektral avbildning väljer du ps-läget.
- Se till att fördröjningssteget är i rätt läge för att pump- och Stokes-balkarna ska överlappas tidsmässigt för C-H-avbildning på detta system.
- Se till att spridningsinställningarna för pumpen och Stokes-strålen är korrekta; för en 802 nm pump är detta 5 mm för pumpbalken och 30 mm för Stokesbalken.
3. Modulering av Stokes-strålen för SRS-avbildning
- För SRS-detektering, modulera intensiteten hos Stokes-strålen.
- Slå på signalgeneratorn för strålmodulering.
- Minns tidigare inställningar, som är följande:
UTGÅNG 1: Fyrkantig våg: Frekvens = 19,5 MHz, Amplitud = 1,4 V.
UTGÅNG 2: Fyrkantsvåg: Frekvens = 19,5 MHz, Amplitud = 300 mV. - Slå på utgångarna 1 och 2.
- Anslut utgång 1 till en förstärkare för EOM i SF-TRU-lådan via en BNC-kabel.
- Anslut utgång 2 till inlåsningsförstärkaren som används för SRS-detektering via en BNC-kabel.
- Slå på strömförsörjningen till förstärkaren på portalen.
4. Slå på inlåsningsförstärkaren
- För SRS-avbildning, använd SRS-detekteringsmodulen som består av en fotodiod med stor yta och en specialbyggd inlåsningsförstärkare.
- Slå på strömförsörjningen till inlåsningsförstärkaren på portalen.
- Ladda programvaran för inlåsningsförstärkaren "SRS detection Module" på datorn.
- I programvaran valde du följande inställningar: Fas = 0 °, Offset = -80 mW, Gain = 58 dB.
- Välj inlåsningsförstärkarens integrationstidskonstant i programvaran: för cellavbildning ger tidskonstanten på 2 μs bilder av god kvalitet.
5. Fungerar på laserskanningsmikroskopet
- Slå på pluggar på all utrustning utom fjärrkontrollen. Vänta tills vänteläge lyser på kontrollboxen på toppen av portalen.
- Slå på fjärrkontrollboxen på portalen och slå på baksidan av lådan. Vänta tills fjärrlampan blir blå (på kontrollrutan) och tryck på Starta drift.
- Slå på datorn i laserskanningsmikroskopet.
- Kör konfokalmikroskopprogramvaran.
- Kontrollera mikroskopets ljusväg via datorprogramvaran.
OBS: Vissa modifieringar har gjorts i mikroskopet för att göra det lämpligt för SRS-avbildning: (i) I strålbanan har ett 775 nm kort pass lagts till filterhjulet där laserstrålarna kommer in i skanningsenheten, detta kan väljas på fliken Lightpath i datorprogramvaran. (ii) Istället för att använda konfokalmikroskopets inbyggda PMT för detektion har en skräddarsydd detektor lagts till den överförda ljusvägen, vilket möjliggör både SRS- och CARS-detektering. (iii) Utgångarna från dessa detektorer är anslutna till den analoga lådan på portalen. CARS-signalen från PMT ansluts via en BNC-kabel till CD1 och SRS-signalen från inlåsningsförstärkaren ansluts via en BNC-kabel till CD2. - Styr fokus via pekskärmen eller fjärrkontrollens vred eller datorprogramvaran.
- Välj önskade bildinställningar i programvaran; Detta inkluderar zoom, bildstorleken i pixlar och pixeluppehållstid.
- Se till att bildhastigheten (pixeluppehållstiden) är större än den integrationstid som ställts in i inlåsningsförstärkarprogramvaran.
OBS: Ett NA 1.2-vattenfördjupningsmål användes för avbildning.
6. Montering av ett prov i mikroskopsteget
- Förbered cellproverna för avbildning enligt följande.
- Kultur 4T1 mus bröstkarcinomceller i RPMI-1640 kompletterat med 10% Fetal Bovine Serum (FBS). Byt medium var 2: e dag och passera cellerna vid 70%-80% sammanflöde.
OBS: Avsnitten 8–10 användes under hela experimenten som beskrivs här. - För avbildningsexperiment, inkubera 1 x 10 5 celler på fyrkantiga täckglas i 24 timmar vid 37 ° C,5 % CO2. Tvätta sedan cellerna med förvärmd fosfatbuffrad saltlösning (PBS) och inkubera med guldnanopartiklar (1:100 utspädning i cellodlingsmedium, stamkoncentration: 2,3 x 10 10 partiklar/ml, diameter:60 nm) i 4 timmar.
- Tvätta cellerna med iskall PBS före avbildning och fixera dem med 4% paraformaldehyd i PBS i 15 minuter vid rumstemperatur (RT). Tvätta cellerna med PBS 3x och montera sedan mellan två täckglas för avbildning.
- Kultur 4T1 mus bröstkarcinomceller i RPMI-1640 kompletterat med 10% Fetal Bovine Serum (FBS). Byt medium var 2: e dag och passera cellerna vid 70%-80% sammanflöde.
- Placera en droppe destillerat vatten ovanpå målet för nedsänkning av vattnet som fokuserar laserstrålarna in i provet mellan målet och provet. Placera sedan provet på mikroskopsteget.
- En kondensor med NA 1.4 samlar upp det framåtriktade förökade ljuset. Applicera en droppe vatten mellan kondensorn och provet för avbildning. Justera kondensorns höjd till cirka 1 mm över provet för att samla upp maximal mängd ljus.
- SRS-detektorn är på ett rörligt fäste, vilket gör att den kan glida in och ut från samlingens optiska väg. För att fokusera på provet med vitt ljus, flytta SRS-detektorn ut ur strålbanan.
- Placera detektorn tillbaka i strålbanan, redo för SRS-avbildning.
7. Ändra Raman-skiftet och samla in en hyperspektral datastack
OBS: Raman-skiftet vid vilket avbildningen äger rum är beroende av fördröjningsstegets läge i SF-TRU-lådan och våglängden för pumpstrålen från lasersystemet.
- För stora förändringar i Raman-skiftet, ändra laservåglängden. Till exempel, för avbildning av CH-vibrationer mellan 2 800–3 100 cm-1, välj 802 nm, medan du väljer pumpstrålen vid 898 nm för avbildning runt 1 600 cm-1 för amide I-toppen . Justera detta via programvaran.
- För att uppnå små justeringar i Raman-skiftet, skanna fördröjningssteget i SF-TRU-enheten.
- SF-TRU ger fördröjningsstegspositioner i millimeter (mm). För att konvertera fördröjningsstegspositionen från mm till cm-1, utför kalibreringens hyperspektrala skanning med hjälp av ett prov av polystyrenpärlor och jämför topppositionerna som finns i kalibreringsskanningen med de som tagits på en spontan Raman-inställning. Detta kommer att ge en linjär ekvation, som omvandlar fördröjningsstegspositionen i mm till Raman-skift i cm-1.
- För att generera en hyperspektral skanning, ta en tidsserie med bilder vid olika fördröjningsstegpositioner.
- För att synkronisera bildförvärv och rörelse av fördröjningssteget, använd den analoga enheten för att skicka och ta emot TTL-signaler till och från SF-TRU-systemet.
OBS: För att göra detta har den analoga rutan följande anslutningar: (i) TRIG OUT VD1 - detta är anslutet till SF-TRU via en BNC och skickar en TTL-signal för att berätta för fördröjningssteget att flytta +1 steg. (ii) TRIG I 1 - här tas en signal emot via BNC när fördröjningssteget har avslutat sin rörelse, och detta används för att utlösa nästa bild i tidsserien. - För hyperspektral datauppsättning väljer du följande inställningar i konfokalmikroskopprogramvaran:
- På fliken Utlösare väljer du Börja med TTL-utlösare (ON) och Utlösare (varje bildruta).
- På fliken Serier anger du tidsserien ON och z-serien OFF.
- Ställ in antalet ramar i tidsserien för att matcha antalet steg i ATM-programvaran (101 steg används här).
- I ATM-programvaran, gå till fliken Kör .
- Ställ in fördröjningsstegspositionerna i millimeter för start och stopp av hyperspektralskanningen. För CH-högvågnummerregion, använd startpositionen = 90,25 mm och stopppositionen = 92,25 mm.
- Se till att antalet steg matchar antalet bildrutor i konfokalmikroskopprogramvaran.
- Efter att ha kontrollerat rätt inställningar, starta hyperspektralstacken i konfokalmikroskopprogramvaran först. Gå till Förvärva och klicka på Starta skanning. Klicka sedan på Start i ATM-programvaran. Detta initierar insamlingen av en serie bilder, med stegvisa ökningar av fördröjningsstegspositionen mellan de valda start- och stopppositionerna
- Exportera den hyperspektrala bildserien som en .tif-fil med flera ramar och använd ett lämpligt programvarupaket för att utföra kalibreringen.
- När kalibreringen är klar använder du den linjära kalibreringsekvationen för att konvertera fördröjningsstegets position till Raman-skiften.
- För att växla mellan avbildning i CH-vibrationsområdet (2 800–3 100 cm-1) till amid I-vibrationsområdet 1 500–1 700 cm-1), gör följande.
- Ändra pumpvåglängden i laserprogramvaran från 802 nm till 898 nm.
- Ändra Stokes dispersionsinställning i ATM-programvaran från 30 mm till 5 mm.
- Gör en liten justering av spegeln i pumpstrålens spridningsväg inuti SF-TRU-lådan. Detta görs genom att justera den nedre ratten på spegelfästet, vilket ändrar spegelvinkeln med en stegvis mängd.
- När du utför en hyperspektral skanning över amid I-regionen, ställ in start- och stopppositionerna i ATM-programvaran till 89 respektive 91 mm
VARNING: Lasersäkerhetsglasögon måste bäras för detta steg eftersom laserstrålen kommer att exponeras.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
SF-TRU-modulen (Spectral Focusing Timing and Recombination Unit) introduceras mellan femtosekundlasern med dubbla utgångar och det modifierade laserscanningsmikroskopet. Det avstämbara ultrasnabba lasersystemet som används i denna studie har två utgångsportar som levererar en stråle med en fast våglängd på 1 045 nm och den andra strålen som är avstämbar i intervallet 680–1 300 nm. En detaljerad schematisk bild av SF-TRU-modulen och multimodal bildplattform visas i figur 1. SF-TRU används för att kvittra två femtosekundlaserstrålar till picosekundpulser och överlappar två strålar rumsligt och tidsmässigt. Hyperspektralstimulerad Raman-spridning (SRS) -avbildning utförs genom att skanna fördröjningen mellan picosekundpumpen och Stokes-pulser.
Alla prover belyses av pulserade lasrar genom ett mål med hög numerisk bländare (NA) på ett modifierat inverterat mikroskop. SRS- och TPEF-signalerna samlas in i framåtriktningen med en hög NA-kondensor. För SRS-mikroskopi används de avstämbara (680–1 300 nm) och fasta (1 045 nm) laserutgångarna som pump respektive Stokes-strålar. Kombinationen av en fotodiod med stor yta och inlåsningsförstärkare används för att utföra SRS-avbildning, medan Stokes-strålen blockeras med två filter (890/210 bandpass och 950 nm kortpassfilter). En viktig fördel med SRS-metoden med spektralfokusering jämfört med de picosekundlaserbaserade systemen är möjligheten att ställa in Raman-skiftet av intresse genom att helt enkelt kontrollera tidsfördröjningen mellan den kvittrade pumpen och Stokes-pulserna. Detta tillvägagångssätt möjliggör snabb sondering av Raman-skift inom ett intervall på flera hundra vågnummer utan att ändra pumpens och Stokes våglängder, vilket möjliggör mycket snabbare hyperspektral avbildning.
För att validera prestanda för spektral upplösning och kemisk selektivitet avbildas provet av polystyren (PS) mikrosfärer först (figur 2). Laserkrafterna vid provet (efter 60x NA 1,2 vattensänkningsmål) är 10 mW för 1 045 nm Stokes-strålen och 20 mW för 802 nm pumpstrålen. SRS-spektrumet kan extraheras vid varje pixel i ramarna. Figur 2B visar det hyperspektrala SRS-spektrumet för PS-pärlor. Som jämförelse visas det spontana Raman-spektrumet av PS-pärlor i figur 2A. SRS- och spontana Raman-spektra för PS-mikrosfärer är nästan identiska förutom relativa intensitetsskillnader vid sidorna. Dessa spektroskopiska mätningar gör det möjligt att konvertera optiskt fördröjningslinjesteg (mm) till Raman-vågnummer (cm-1) för SRS-avbildning.
Eftersom Raman-spektra av stora biomolekyler i det kol-vätesträckande vibrationsbandet ligger i intervallet 2 800–3 050 cm−1, utförs SRS-avbildningen av 4T1-cancerceller vid 2 852 cm−1 (lipid), 2 930 cm−1 (protein), 2 968 cm−1 (DNA) och överlagringsbilderna som visas i figur 3. SRS-bilder av olika Raman-band förvärvas med en pixeluppehållstid på 4 μs vid en ramstorlek på 512 x 512 pixlar.
Slutligen har denna metod ytterligare utvidgats till multimodal avbildning av 4T1-cancerceller doserade med guldnanopartiklar (AuNPs), vilket gör att vi kan avbilda AuNPs fördelningar i cancerceller mer exakt. De förvärvade SRS-bilderna (CH2 - ochCH3-kanaler ), TPEF (LysoTracker-lysrör) och TA-bilder (SRS-kanal utanför resonans) visas i figur 4.
Figur 1: Schematisk för den hyperspektrala multimodala bildplattformen. Illustration av multimodal olinjär optisk mikroskopi. DM, dikroisk spegel; DS, fördröjningssteg; EOM, elektrooptisk modulator; FG, funktionsgenerator; FL, filter; G, galler; LIA, inlåsningsförstärkare; M, spegel; OBJ, objektiv; PD, fotodiod; PMT, fotomultiplikatorrör; SF-TRU, spektralfokuseringstiming och rekombinationsenhet. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 2: Spektra av polystyren (PS) mikrosfärer. Det spontana (A) Raman-spektrumet av PS-mikrosfärer visar god överensstämmelse med (B) hyperspektralt SRS-spektrum. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 3: Spektroskopisk SRS-avbildning av 4T1-cancerceller. SRS-bilder på 2 852 cm−1, 2 930 cm−1, 2 968 cm−1 och överläggsbild. Skalstreck: 10 μm. Klicka här för att se en större version av denna figur.
Figur 4: Multimodal avbildning av guldnanopartiklars upptag av 4T1-cancerceller. Hyperspektrala SRS-bilder vid 2 852 cm−1 (CH2), 2 928 cm−1 (CH3), 3 080 cm−1 (off-resonans, endast TA-signal kvar), TPEF och överlagringsbild. Skalstreck: 10 μm. Klicka här för att se en större version av denna figur.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Denna studie har presenterat kombinationen av SF-TRU-modul och ultrasnabbt lasersystem med dubbla utgångar som demonstrerade dess tillämpningar för multimodal mikrospektroskopi. Med sin förmåga att undersöka upptaget av guldnanopartiklar (AuNPs) av cancerceller kan den multimodala bildplattformen visualisera de cellulära svaren på hypertermiska cancerbehandlingar när laserstrålar absorberas av AuNPs.
Dessutom uppnås snabb kemiskt specifik avbildning och hög spektral upplösning genom att använda spektralfokuseringstekniken, med hjälp av två uppsättningar gitterpar för att styra kvittren i varje laserstråle. Jämfört med användningen av glasstavar med fast längd för kvitter, tillåter gallerpar att matcha spektralupplösningen och linjebredderna för Raman-linjerna av intresse19.
Dessutom kan detta system enkelt växlas från femtosekund till kvittrade picosekundregimer genom att använda specialdesignade manuella reglage för att ta bort gallren från strålbanorna utan att påverka inriktningen inuti mikroskopet. För att uppnå hög känslighet och spektral upplösning implementeras SRS vanligtvis med hjälp av smalbandspikosekundpumpen och Stokes-pulser. Pikosekundlasrar är dock inte tillräckliga för multifotonexcitation som kräver högre toppeffektnivåer, som kan uppnås med femtosekundlasrar. De multimodala funktionerna gör det möjligt att använda metoden för en mängd olika applikationer som multifotonavbildning20, koherent Raman-spridning21 och pumpsondspektroskopi.
Det finns flera strategier som kan användas för att ytterligare förbättra prestandan hos den demonstrerade enheten. Till exempel erbjuder ett snabbare motoriserat fördröjningslinjesteg och datainsamlingsprogramvara en högre bildhastighet, vilket kan öka genomströmningen för den multimodala bildplattformen. Dessutom täckte den nuvarande installationen ~ 300 cm − 1 spektralområde med en spektral upplösning upp till 5 cm-1. För att ytterligare förstora spektralområdet har ett modifierat lasersystem med bredare spektralbandbredd använts för hyperspektral SRS-mikroskopi22.
Sammantaget ger denna multimodala och icke-invasiva bildplattform nya insikter i nanomedicin och öppnar en ny väg till multimodal molekylär avbildning av celler, biologiska vävnader och nanopartiklar23,24,25.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författarna förklarar inga intressekonflikter.
Acknowledgments
Denna forskning stöddes av EPSRC Grants: Raman Nanotheranostics (EP/R020965/1) och CONTRAST facility (EP/S009957/1).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| APE SRS Detection Unit | APE (Angewandte Physik & Elektronik GmbH) | APE Lock-in Module | Combined system containing a large area Si photo-diode for detecting the pump beam along with a Lock-In amplifier for detecting the beam modulations |
| Confocal Scanning Unit | Olympus | FV 3000 | Confocal scanning unit used for imaging |
| CML Latex Beads, 4% w/v, 1.0 µm | Invitrogen | C37483 | Polystyrene microspheres |
| Coverslips | Thorlabs | CG15CH2 | 22 mm x 22 mm coverslips for seeding cells |
| FBS | Gibco | 10500-064 | Foetal Bovine Serum (Heat Inactivated) |
| Flouview | Olympus | FV31S-SW | Laser scanning microscope control software |
| Function Generator | BX precision | 40543 | Used to generate square wave function which is fed to EOM in SF-TRU to produce modulations in the stokes beam |
| Gold Nanoparticles | Nanopartz | A11-60 | Spherical gold nanoparticles, 60 nm diameter |
| Input Output Interface | Olympus | FV30 ANALOG | This unit allows voltage readouts from PMT and LockIn to be fed into the confocal scanning software and allows timing pulses to be sent between the olympus microscope and the SF-TRU unit. |
| InSight X3 | Newport | Spectra-Physics | Dual-output femtosecond pulsed laser. Tunable (680–1300 nm) and fixed (1045 nm) laser outputs with the repetition rate of 80 MHz. |
| Microscope Frame | Olympus | IX83 | Inverted microscope |
| Mouse 4T1 cells | ATCC | CRL-2539 | Mouse breast cancer cells |
| NA 1.2 Water Immersion Objective | Olympus | UPLSAPO60XW/IR | The multiphoton 60x Objective has a 0.28 mm working distance. Other similar objectives can be used. |
| NA 1.4 Condenser | Nikon | CSC1003 | Other condensers with NA higher than the excitation objective can also be used. |
| PMT | Hamamatsu | R3896 | PMT used for detecting anti-stokes photos for CARS micrsocopy |
| PMT Connector | Hamamatsu | C13654-01-Y002 | Connector for PMT |
| Power Supply | RS | RSPD-3303 C | Programmable power supply which is used for providing the correct voltage to the PMT |
| RPMI-1640 | Gibco | A10491-01 | Roswell Park Memorial Institute (RPMI) 1640 Medium has since been found suitable for a variety of mammalian cells. |
| SF-TRU | Newport Spectra Physics | SF-TRU | System designed for controlling the time delay and dispersion of the 2 laser outputs and for performing the beam modulations required for SRS |
References
- Tabish, T. A., et al. Smart gold nanostructures for light mediated cancer theranostics: Combining optical diagnostics with photothermal therapy. Advanced Science. 7 (15), Weinheim, Baden-Württemberg, Germany. 1903441 (2020).
- Tian, F., et al. Gold nanostars for efficient in vitro and in vivo real-time SERS detection and drug delivery via plasmonic-tunable Raman/FTIR imaging. Biomaterials. 106, 87-97 (2016).
- Jenkins, S. V., et al. Enhanced photothermal treatment efficacy and normal tissue protection via vascular targeted gold nanocages. Nanotheranostics. 3 (2), 145-155 (2019).
- Huang, J., et al. Rational design and synthesis of gammaFe2 O3 @Au magnetic gold nanoflowers for efficient cancer theranostics. Advanced Materials. 27 (34), Deerfield Beach, Fla. 5049-5056 (2015).
- Dilipkumar, A., et al. Label-free multiphoton endomicroscopy for minimally invasive in vivo imaging. Advanced science. 6 (8), Weinheim, Baden-Württemberg, Germany. 1801735 (2019).
- Wang, C. -C., et al. Differentiation of normal and cancerous lung tissues by multiphoton imaging. Journal of Biomedical Optics. 14 (4), 044034 (2009).
- Chrabaszcz, K., et al. Comparison of standard and HD FT-IR with multimodal CARS/TPEF/SHG/FLIMS imaging in the detection of the early stage of pulmonary metastasis of murine breast cancer. The Analyst. 145 (14), 4982-4990 (2020).
- Tsai, T. H., et al. Visualizing radiofrequency-skin interaction using multiphoton microscopy in vivo. Journal of Dermatological Science. 65 (2), 95-101 (2012).
- Wang, C. -C., et al. Early development of cutaneous cancer revealed by intravital nonlinear optical microscopy. Applied Physics Letters. 97 (11), 113702 (2010).
- Li, F. -C., et al. Dorsal skin fold chamber for high resolution multiphoton imaging. Optical and Quantum Electronics. 37 (13), 1439-1445 (2005).
- Tong, L., et al. Label-free imaging of semiconducting and metallic carbon nanotubes in cells and mice using transient absorption microscopy. Nature Nanotechnology. 7 (1), 56-61 (2011).
- Chong, S., Min, W., Xie, X. S. Ground-state depletion microscopy: Detection sensitivity of single-molecule optical absorption at room temperature. The Journal of Physical Chemistry Letters. 1 (23), 3316-3322 (2010).
- Chen, T., et al. Transient absorption microscopy of gold nanorods as spectrally orthogonal labels in live cells. Nanoscale. 6 (18), 10536-10539 (2014).
- Liu, J., Irudayaraj, J. M. Non-fluorescent quantification of single mRNA with transient absorption microscopy. Nanoscale. 8 (46), 19242-19248 (2016).
- Freudiger, C. W., et al. Label-free biomedical imaging with high sensitivity by stimulated Raman scattering microscopy. Science. 322 (5909), 1857-1861 (2008).
- Wang, C. -C., et al. In situ chemically specific mapping of agrochemical seed coatings using stimulated Raman scattering microscopy. Journal of Biophotonics. 11 (11), 201800108 (2018).
- Wang, C. -C., Yoong, F. -Y., Penfield, S., Moger, J. Visualization of active ingredients uptake in seed coats with stimulated Raman scattering microscopy. Proceedings SPIE 10069, Multiphoton Microscopy the Biomedical Sciences XVII. , 1006928 (2017).
- Hu, F., Shi, L., Min, W. Biological imaging of chemical bonds by stimulated Raman scattering microscopy. Nature Methods. 16 (9), 830-842 (2019).
- Zeytunyan, A., Baldacchini, T., Zadoyan, R. Module for multiphoton high-resolution hyperspectral imaging and spectroscopy. Proceedings SPIE 10498, Multiphoton Microscopy in the Biomedical Sciences XVIII. , 104980 (2018).
- Wang, C. -C., Wu, R. -J., Lin, S. -J., Chen, Y. -F., Dong, C. -Y. Label-free discrimination of normal and pulmonary cancer tissues using multiphoton fluorescence ratiometric microscopy. Applied Physics Letters. 97 (4), 043706 (2010).
- Wang, C. -C., Chandrappa, D., Smirnoff, N., Moger, J. Monitoring lipid accumulation in the green microalga botryococcus braunii with frequency-modulated stimulated Raman scattering. Proceedings SPIE 9329, Multiphoton Microscopy in the Biomedical Sciences XV. , 9329 (2015).
- Figueroa, B., et al. Broadband hyperspectral stimulated Raman scattering microscopy with a parabolic fiber amplifier source. Biomedical Optics Express. 9 (12), 6116-6131 (2018).
- Cui, L., et al. In situ plasmon-enhanced CARS and TPEF for Gram staining identification of non-fluorescent bacteria. Spectrochimica Acta Part A: Molecular and Biomolecular Spectroscopy. 264, 120283 (2022).
- Ma, J., Sun, M. Nonlinear optical microscopies (NOMs) and plasmon-enhanced NOMs for biology and 2D materials. Nanophotonics. 9 (6), 1341-1358 (2020).
- Sun, L., Chen, Y., Sun, M. Exploring nonemissive excited-state intramolecular proton transfer by plasmon-enhanced hyper-Raman scattering and two-photon excitation fluorescence. The Journal of Physical Chemistry C. 126 (1), 487-492 (2022).
