Denervação renal melhorada Hipertensão Mitigada Induzida por Infusão de Angiotensina II

Resumo

Aqui, apresentamos um protocolo para denervação simpática renal (RDN) em camundongos com hipertensão induzida por infusão de Angiotensina II. O procedimento é repetível, conveniente e permite estudar os mecanismos regulatórios da RDN na hipertensão e hipertrofia cardíaca.

Resumo

Os benefícios da denervação simpática renal (RDN) sobre a pressão arterial foram comprovados em um grande número de ensaios clínicos nos últimos anos. No entanto, o mecanismo regulador da RDN na hipertensão permanece indefinido. Assim, é essencial estabelecer um modelo RDN mais simples em camundongos. Neste estudo, minibombas osmóticas cheias de angiotensina II foram implantadas em camundongos C57BL/6 de 14 semanas de idade. Uma semana após o implante da bomba mini-osmótica, um procedimento RDN modificado foi realizado nas artérias renais bilaterais dos camundongos usando fenol. Camundongos pareados por idade-sexo receberam soro fisiológico e serviram como grupo simulado. A pressão arterial foi medida no início do estudo e a cada semana subsequentemente durante 21 dias. Em seguida, artéria renal, aorta abdominal e coração foram coletados para exame histológico com coloração H&E e Masson. Neste estudo, apresentamos um modelo de RDN simples, prático, repetível e padronizado, que pode controlar a hipertensão e aliviar a hipertrofia cardíaca. A técnica pode desnervar os nervos simpáticos renais periféricos sem danos na artéria renal. Em comparação com os modelos anteriores, o RDN modificado facilita o estudo da patobiologia e fisiopatologia da hipertensão.

Introdução

A hipertensão é uma importante doença cardiovascular crônica em todo o mundo. A hipertensão não controlada pode danificar órgãos-alvo e contribuir para insuficiência cardíaca, acidente vascular cerebral e doenças renais crônicas ^1,2,3. A prevalência de hipertensão aumentou de 20% para 31% entre 1991 e 2007 na China. O número de adultos com hipertensão na China pode dobrar após uma recente revisão dos critérios diagnósticos para hipertensão (130/80 mmHg)⁴. A hipertensão pode ser controlada por medicamentos, no entanto, aproximadamente 20% dos pacientes são incapazes de controlar sua hipertensão, mesmo quando recebem pelo menos três medicamentos anti-hipertensivos (incluindo um diurético) na dose máxima tolerada, o que pode levar ao desenvolvimento de hipertensão resistente a medicamentos⁵.

A denervação simpática renal (RDN) provou ser um tratamento potencial para a hipertensão. Em 2009, Krum e seus colegas relataram tratamento de hipertensão resistente usando RDN pela primeira vez. Verificou-se que a ablação percutânea da artéria renal pode efetivamente causar redução persistente da pressão arterial em pacientes⁶. No entanto, o fracasso do estudo Symplicity Hypertension 3 (HTN-3) impediu a aplicação do RDN⁷, transformando o RDN em uma terapia controversa. No entanto, a perspectiva de RDN ainda não foi descartada. Ensaios clínicos recentes, incluindo RADIANCE-HTN SOLO, SPYRAL HTN-OFF MED/ON MED e SPYRAL HTN-OFF MED Pivotal confirmaram a eficácia do RDN na hipertensão 8,9,10,11,12. Assim, pesquisas mecanicistas mais detalhadas precisam ser realizadas para explorar os efeitos da RDN.

O objetivo geral deste estudo é demonstrar como a RDN em camundongos pode ser modificada para produzir uma cirurgia mais simples e estável. Um grande número de experimentos tem estudado várias abordagens da RDN, como crioablação intravascular, ultrassonografia extracorpórea e aplicação local de uma substância química ou neurotoxina em diferentes modelos animais 13,14,15,16,17. O modelo RDN gerado por ablação química com fenol é um modelo experimental bem estabelecido para estudar a patogênese da ativação simpática na hipertensão. Este modelo é gerado pela corrosão química dos nervos simpáticos renais com solução de fenol/etanol a 10% utilizando um cotonete¹⁸. Por um lado, o RDN convencional potencialmente inibe a atividade simpática renal, o que diminui a secreção de renina e a reabsorção de sódio e aumenta o fluxo sanguíneo renal. Por outro lado, suprime o sistema renina-angiotensina-aldosterona¹⁹. Assim, RDN tem um efeito benéfico sobre a hipertensão. No entanto, o modelo RDN gerado pela ablação química carece de critérios de ablação e tempo de ablação e os detalhes do procedimento experimental ainda não estão claros. Além disso, não há relatórios técnicos disponíveis. Neste relato, descrevemos um protocolo cirúrgico para a geração de modelo RDN com fenol utilizando papel de pesagem na hipertensão induzida por Angiotensina II (Ang II) em camundongos C57BL/6. Envolvemos a artéria renal com papel de pesagem contendo fenol e unificamos o tempo de ablação, o que ajuda a estabelecer um modelo RDN mais reprodutível e confiável. Este modelo experimental tem como objetivo avaliar o efeito da RDN sobre a hipertensão.

Protocolo

Todos os procedimentos experimentais em animais cumpriram o Guia Ético relevante para o Cuidado e Uso de Animais de Laboratório (NIH Publication no. 85-23, revisado em 2011) e foram aprovados pelos comitês de pesquisa animal do Hospital Huadong, afiliado à Universidade de Fudan. Camundongos C57BL/6 machos de quatorze semanas de idade (28-30g) foram divididos aleatoriamente em quatro grupos: grupo Sham, grupo Sham+Ang II, grupo RDN, grupo RDN+Ang II, n = 6 em cada grupo. Todos os animais foram mantidos sob condições específicas fechadas livres de patógenos em uma sala com temperatura controlada a 24 ± 1 °C com um ciclo claro/escuro de 12h e livre acesso à ração padrão de roedores e água ad libitum.

1. Preparação do campo de operação

1. Desinfete a mesa de operação com etanol a 70%. Ajustar a temperatura da almofada de aquecimento para 37 °C.
2. Certifique-se de que todos os instrumentos cirúrgicos são esterilizados antes da cirurgia a 121 °C por 30 min ou por outros métodos. Este procedimento requer uma tesoura microcirúrgica, duas pinças finas e retas, duas pinças curvas finas, pinças hemostáticas, gazes estéreis e papéis de pesagem.

2. Hipertensão induzida por angiotensina II

1. Fornecer meloxicam (0,5 mg/kg, SC) aos camundongos C57BL/6 pouco antes da indução anestésica. Em seguida, anestesiar os camundongos com injeção de pentobarbital sódico conforme descrito anteriormente^20,21. O isoflurano também pode ser usado, se preferir. Confirme a profundidade da anestesia com um reflexo negativo de pinça do dedo do pé.
2. Remova o cabelo nas costas com um barbeador. Aplique pomada veterinária nos olhos para evitar a secura durante a anestesia.
3. Coloque o animal sobre uma mesa de operação na posição dorsal. Esfregue e limpe a área raspada com iodopovidona seguido de três toalhetes com etanol a 70%.
4. Faça uma incisão de 1 cm usando uma lâmina de bisturi estéril, perpendicular à cauda, atrás da orelha sobre a omoplata da perna dianteira.
5. Utilizar um hemostato estéril para fazer um túnel subcutâneo sob a pele e criar uma bolsa para a bomba²². Insira uma bomba osmótica cheia de angiotensina II (1.000 ng/kg/min) no bolso suavemente. Certifique-se de que há espaço livre suficiente para suturar a ferida sem esticar a pele.
6. Suture o músculo com suturas de Vicryl 6-0 interrompidas e feche a pele com suturas de nylon 4-0 interrompidas. Swab e limpar o local da ferida com povidona-iodo. Realizar a mesma cirurgia com igual volume de soro fisiológico para o grupo controle.
7. Coloque todos os instrumentos cirúrgicos em um esterilizador por 10 s e substitua as luvas estéreis entre as cirurgias. Monitore todos os ratos até que estejam totalmente recuperados.
8. Monitore de perto e observe a cicatrização de feridas em camundongos pelo menos duas vezes por dia durante a primeira semana e uma vez por dia posteriormente, incluindo vermelhidão, inchaço e infecção. Efectuar a dissecção imediatamente se os ratinhos morrerem durante a perfusão de Ang II.
9. Medir a pressão arterial no início do estudo e todas as semanas após a perfusão de Ang II com o método de pletismografia do manguito caudal²³ em ratinhos conscientes. Certifique-se de que os experimentos de medição da pressão arterial sejam conduzidos em uma área silenciosa, a 22 ± 2 °C, onde os camundongos sejam aclimatados por 1 h antes do início do experimento. Habituar camundongos por pelo menos 5 dias consecutivos antes das medidas basais da pressão arterial^23,24.

3. Denervação renal bilateral

1. Selecione os camundongos com pressão arterial (PA) elevada ≥140/90mmHg ou aumento de 25% na PA sistólica/PA diastólica, 1 semana após a infusão de Ang II.
2. Registrar o peso do animal antes da cirurgia e escolher animais com peso mínimo de 24 g para cirurgia de desnervação renal.
3. Anestesiar os ratos usando pentobarbital sódico. Confirme a profundidade da anestesia com um reflexo negativo de pinça do dedo do pé.
4. Remova o cabelo no abdômen com um barbeador. Realize este procedimento com cuidado e minuciosamente para evitar qualquer contaminação cirúrgica.
5. Coloque os ratos na mesa de operação, mantendo o abdômen para cima e fixe seus membros com fita adesiva. Desinfetar a pele abdominal com iodopovidona seguido de três toalhetes com etanol a 70%.
6. Faça uma incisão abdominal ventral de 2 cm na linha média usando uma lâmina de bisturi. Puxe o intestino para trás com gaze embebida em solução salina de 37 °C para expor a artéria renal esquerda. Cuidadosamente, mas sem rodeios, disseque a gordura para longe da artéria renal usando pinças curvas. (Figura 1A-C).
7. Corte o papel de pesagem em um retângulo do mesmo tamanho que a artéria renal com uma tesoura afiada estéril. Para referência, corte o papel de pesagem no mesmo tamanho mostrado pela linha pontilhada na Figura 1C.
   NOTA: É uma parte crítica da cirurgia, tente cortar vários pedaços do papel de pesagem de cada vez para manter a mesma forma.
8. Mergulhe o papel de pesagem em solução de fenol/etanol a 10% por pelo menos 30 s. Cobrir a superfície da artéria renal esquerda e envolver o vaso com o papel de pesagem, manter por 2 min (Figura 1D). Use gaze para proteger os tecidos circundantes para evitar que o papel de pesagem toque o rim e o intestino circundantes.
   NOTA: A solução de fenol é estável em tubos de plástico, mas não em frascos para injetáveis de vidro. Portanto, a solução deve ser preparada na hora para cada experimento¹⁸.
9. Realizar o mesmo procedimento para a artéria renal direita. Realize a cirurgia simulada com papel de pesagem imerso em solução salina.
10. Reposicione os músculos em sua posição inicial e feche o peritônio com suturas de Vicryl 6-0 em uma sutura interrompida. Em seguida, feche a pele com suturas de nylon 4-0 interrompidas. Monitore todos os ratos até que estejam totalmente recuperados.

4. Cuidados pós-operatórios

1. Aplique iodopovidona na incisão e coloque o animal em um cobertor elétrico aquecido para recuperação e monitoramento pós-operatório.
2. Monitore os ratos duas vezes ao dia para avaliar se há vermelhidão, inchaço e dor ou infecção abdominal. Fornecer meloxicam (0,5 mg/kg, SC) a todos os ratinhos cerca de 1 h antes e 24 h após o procedimento RDN.

Resultados

Estatística
Todos os dados são expressos como média ± desvio padrão. A ANOVA one-way foi utilizada para experimentos com três ou mais condições, seguida de testes post-hoc de Bonferroni para comparações entre grupos individuais. Considere um valor de p igual ou menor que 0,05 como significativo. Um software comercial foi utilizado para realizar todas as análises estatísticas.

O aumento da pressão arterial induzido por Ang II foi atenuado após a RDN
Obser...

Discussão

Se a RDN poderia reduzir a pressão arterial tornou-se controversa desde a publicação do resultado negativo do estudo de simplicidade HTN-3 ^7,25. No entanto, os diversos ensaios clínicos e experimentos com animais têm demonstrado resultados positivos e efetivos da RDN em humanos e animais hipertensos 9,10,11,12,13,14,15,16,17....

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
Angiotensina II	Sangon Biotech	CAS: 4474-91-3	Para fazer um modelo de animol hipertensivo
Anticorpo anti-tirosina hidroxilase	Abcam	ab137869	Para avaliar a expressão de TH dos nervos renais
Análise da pressão arterial	Visitech Systems	BP-2000	Meça a pressão arterial de camundongos
Bomba mini-osmótica	DURECT Corporation	CA 95014	Para preencher com Angiotensina II
Norepinefrina ELISA Kit	Abcam	ab287789	para medir os níveis renais de norepinefrina
	Fenol Sangon Biotech	CAS:108-95-2	Danificar o nervo simpático renal
Papel de pesagem	Sangon Biotech	F512112	Para destruir o nervo renal com papel de pesagem imerso em fenol; https://www.sangon.com/productDetail?productInfo.code=F512112.