बायोप्सी-व्युत्पन्न आंतों के ऑर्गेनोइड और ऑर्गन-ऑन-ए-चिप्स प्रौद्योगिकियों को क्षेत्र-विशिष्ट आंतों की कार्यक्षमता को पुन: प्राप्त करने के लिए एक माइक्रोफिजियोलॉजिकल प्लेटफॉर्म में जोड़ा जाता है।
आंतों का श्लेष्म एक जटिल भौतिक और जैव रासायनिक बाधा है जो महत्वपूर्ण कार्यों के असंख्य को पूरा करता है। यह माइक्रोबायोटा के साथ सहजीवी संबंध को सुविधाजनक बनाते हुए और सूक्ष्मजीवों के आक्रमण को प्रतिबंधित करते हुए पोषक तत्वों और ज़ेनोबायोटिक्स के परिवहन, अवशोषण और चयापचय को सक्षम बनाता है। आंतों के ऊतक होमियोस्टेसिस को स्थापित करने और बनाए रखने के लिए विभिन्न सेल प्रकारों और उनके भौतिक और जैव रासायनिक वातावरण के बीच कार्यात्मक बातचीत महत्वपूर्ण है। इन जटिल इंटरैक्शन और एकीकृत आंतों के शरीर विज्ञान को इन विट्रो में मॉडलिंग करना नए चिकित्सीय लक्ष्यों और दवा उम्मीदवारों की खोज और विकास के तरीके को बदलने की क्षमता के साथ एक दुर्जेय लक्ष्य है।
ऑर्गेनोइड्स और ऑर्गन-ऑन-ए-चिप प्रौद्योगिकियों को हाल ही में आंतों के शरीर विज्ञान और इन विट्रो में पैथोफिजियोलॉजी के कार्यात्मक पहलुओं का अध्ययन करने के लिए उपयुक्त मानव-प्रासंगिक आंत चिप्स उत्पन्न करने के लिए जोड़ा गया है। छोटी (ग्रहणी) और बड़ी आंत की बायोप्सी से प्राप्त ऑर्गेनोइड को एक अंग चिप के शीर्ष डिब्बे में वरीयता दी जाती है और फिर प्रत्येक आंतों के क्षेत्र की विशिष्ट सेलुलर, आणविक और कार्यात्मक विशेषताओं को संरक्षित करते हुए मोनोलेयर के रूप में सफलतापूर्वक विस्तार किया जाता है। मानव आंत ऊतक-विशिष्ट माइक्रोवास्कुलर एंडोथेलियल कोशिकाओं को उपकला-एंडोथेलियल इंटरफ़ेस को फिर से बनाने के लिए अंग चिप के निचले डिब्बे में शामिल किया जाता है। यह उपन्यास मंच पोषक तत्वों, दवाओं और सूक्ष्मजीवों के लिए ल्यूमिनल एक्सपोजर की सुविधा प्रदान करता है, आंतों के परिवहन, पारगम्यता और मेजबान-सूक्ष्मजीव इंटरैक्शन के अध्ययन को सक्षम करता है।
यहां, मानव ग्रहणी (ग्रहणी चिप) और बृहदान्त्र (बृहदान्त्र चिप) का प्रतिनिधित्व करने वाले आंत चिप्स की स्थापना के लिए एक विस्तृत प्रोटोकॉल प्रदान किया जाता है, और निरंतर प्रवाह और पेरिस्टलसिस जैसी विकृतियों के तहत उनकी बाद की संस्कृति। हम प्रोटोटाइपिकल इंड्यूसर और सब्सट्रेट का उपयोग करके ग्रहणी चिप में दवा चयापचय और सीवाईपी 3 ए 4 प्रेरण का आकलन करने के तरीकों का प्रदर्शन करते हैं। अंत में, हम बृहदान्त्र चिप में इंटरफेरॉन गामा (आईएफएन) -मध्यस्थता बाधा व्यवधान (टपका हुआ आंत सिंड्रोम) के इन विट्रो मॉडलिंग के लिए एक चरण-दर-चरण प्रक्रिया प्रदान करते हैं, जिसमें पैरासेल्युलर पारगम्यता के परिवर्तन, साइटोकिन स्राव में परिवर्तन और चिप के भीतर कोशिकाओं की ट्रांसक्रिप्टोमिक प्रोफाइलिंग का मूल्यांकन करने के तरीके शामिल हैं।
मानव आंत एक जटिल और मल्टीटास्किंग अंग है जो आत्म-उत्थान में सक्षम है। यह छोटी और बड़ी आंत में विभाजित है। छोटी आंत का प्राथमिक कार्य पेट से आने वाले भोजन को पचाना, सभी पोषक तत्वों को अवशोषित करना और बड़ी आंत पर अवशेषों को पारित करना है, जो पानी और इलेक्ट्रोलाइट्स को पुनर्प्राप्त करता है। छोटी आंत को आगे कई शारीरिक रूप से अलग-अलग क्षेत्रों में विभाजित किया गया है: ग्रहणी, जेजुनम और इलियम, जिनमें से प्रत्येक को विशिष्ट कार्यों को करने के लिए अनुकूलित किया जाता है। उदाहरण के लिए, ग्रहणी जेजुनम में प्रोटीन, कार्बोहाइड्रेट, विटामिन और खनिजों से जुड़े पोषक तत्वों के उचित अवशोषण को सक्षम करने के लिए चाइम (पेट की सामग्री) को तोड़ने में मदद करता है। छोटी आंत का यह समीपस्थ हिस्सा आंतों की दवा अवशोषण और चयापचय की मुख्य साइट भी है, और यह इलियम और बृहदान्त्र1 में उनकी अभिव्यक्ति की तुलना में दवा-चयापचय एंजाइमों (जैसे, सीवाईपी 3 ए 4) की उच्च अभिव्यक्ति की विशेषता है। पोषक तत्वों को पचाने और अवशोषित करने में इसकी मुख्य भूमिका के अलावा, आंत संभावित हानिकारक ल्यूमिनल सामग्री, जैसे रोगजनक सूक्ष्मजीवों, माइक्रोबियल चयापचयों, आहार एंटीजन और विषाक्त पदार्थों 2,3 के खिलाफ एक प्रभावी बाधा भी है। यह उल्लेखनीय है कि मानव बृहदान्त्र बड़ी संख्या में सूक्ष्मजीवों द्वारा बसा हुआ है, जो मानव शरीर में कुल कोशिकाओं से कहीं अधिक है, जो पोषण, चयापचय और प्रतिरक्षा के लिए कई लाभ प्रदान करते हैं। इसलिए, आंतों के उपकला कोशिकाओं द्वारा गठित श्लेष्म बाधा की अखंडता का रखरखाव आंत माइक्रोबायोटा और मेजबान कोशिकाओं के बीच सहजीवी संबंधों को अनावश्यक प्रतिरक्षा कोशिका सक्रियण से बचने के लिए शारीरिक रूप से अलग करने की अनुमति देने के लिए महत्वपूर्ण है2. इसके अलावा, क्रमादेशित आंतों की कोशिका मृत्यु एक आत्म-सुरक्षात्मक तंत्र के रूप में एक आवश्यक भूमिका निभाती है जो संक्रमित कोशिकाओं को जारी रखने या प्रसार करने से रोकती है- जिससे संभावित रोगजनकोंका प्रसार होता है 3-जबकि हर चार से सात दिनों में आंतों के उपकला का निरंतर आत्म-नवीकरण कोशिका हानि के लिए क्षतिपूर्ति करता है जो बाधा अखंडता और ऊतक होमियोस्टेसिस सुनिश्चित करता है। पोषक तत्वअवशोषण, बाधा अखंडता, या आंतों की कोशिका मृत्यु और आत्म-नवीकरण में असंतुलन सहित वर्णित आंतों के कार्यों की हानि, कुपोषण और सूजन आंत्र रोग (आईबीडी) 2,3 सहित गैस्ट्रोइंटेस्टाइनल विकारों की एक श्रृंखला के विकास के परिणामस्वरूप हो सकती है।
इससे पहले, मानव आंतों के ऊतकों के शारीरिक और पैथोफिजियोलॉजिकल कार्यों का अध्ययन करने के लिए पशु मॉडल और परिवर्तित कैंसर-व्युत्पन्न आंतों की कोशिका रेखाओं का उपयोग किया गया है। हालांकि, दो प्रजातियों के बीच महत्वपूर्ण असमानताओं की उपस्थिति के कारण मनुष्यों के लिए पशु अनुसंधान की अनुवादशीलता के बारे में तेजी से प्रमुख चिंताओं ने मानव-प्रासंगिक वैकल्पिक तरीकों की आवश्यकता पर प्रकाश डाला4. आमतौर पर इन विट्रो आंतों की सेल लाइनों में टी 84, कैको -2 और एचटी 29 कोशिकाएं शामिल हैं। जबकि वे आंतों के अवरोध समारोह और झिल्ली परिवहन के कुछ पहलुओं की नकल करते हैं, उन्हें दवा चयापचय एंजाइम5, सतह रिसेप्टर्स और ट्रांसपोर्टरों4 की एक परिवर्तित अभिव्यक्ति की विशेषता है। इसके अलावा, उनके पास आंतों के खंड विशिष्टता की कमी होती है और आंतों के उपकला की जटिलता को दोहराने में विफल रहते हैं, प्रत्येक मॉडल में आंत में मौजूद पांच उपकला कोशिका प्रकारों में से केवल एकहोता है 6.
हाल ही में, छोटी आंत और बृहदान्त्र 7,8 या प्रेरित प्लुरिपोटेंट स्टेम सेल (आईपीएससी) 9 की ताजा बायोप्सी से स्थापित मानव आंतों के ऑर्गेनोइड संस्कृतियों को भविष्य में पशु प्रयोग के पूरक, कम करने और शायद बदलने की क्षमता के साथ वैकल्पिक प्रयोगात्मक मॉडल के रूप में पेश किया गया था। जबकि आईपीएससी को गैर-आक्रामक तरीके से प्राप्त किया जा सकता है, आईपीएससी से ऑर्गेनोइड स्थापित करने के लिए जटिल और लंबे प्रोटोकॉल (कई प्रयोगात्मक चरणों के साथ) के उपयोग की आवश्यकता होती है और मानव भ्रूण के ऊतकों से मिलती-जुलती संस्कृतियां उत्पन्न होती हैं। इसके विपरीत, बायोप्सी-व्युत्पन्न ऑर्गेनोइड अत्यधिक स्केलेबल हैं, क्योंकि वे आंतों के ऊतकों की अंतर्निहित नवीकरण क्षमता का लाभ उठा सकते हैं और इन विट्रो में अनिश्चित काल तक पारित और प्रचारित किए जा सकते हैं। महत्वपूर्ण रूप से, बायोप्सी-व्युत्पन्न ऑर्गेनोइड प्राथमिक ऊतक की बीमारी और आंतों के क्षेत्र-विशिष्ट विशेषताओं को बनाए रखते हैं जिससे वे विकसित किए गए थे और आंतों के उपकला की सेलुलर विविधता का अनुकरण करते हैं। ऑर्गेनोइड का उपयोग विभिन्न गैस्ट्रोइंटेस्टाइनल विकारों के जीव विज्ञान और रोगजनन को उजागर करने और उनके चिकित्सीय प्रबंधन में सुधार करने के लिए इन विट्रो में रोगी-विशिष्ट अवतारों के रूप में किया जा सकता है। यद्यपि आंतों के ऑर्गेनोइड ने शारीरिक कार्यक्षमता की एक प्रभावशाली डिग्री हासिल की है, फिर भी वे महत्वपूर्ण स्ट्रोमल घटकों की कमी के कारण देशी अंगों की जटिलता को पुन: उत्पन्न करने में विफल रहते हैं- जिसमें रक्त वाहिकाओं, संयोजी ऊतक, परिधीय तंत्रिकाएं और प्रतिरक्षा कोशिकाएं-साथ ही यांत्रिक उत्तेजना भी शामिल है। यांत्रिक पैरामीटर, जैसे प्रवाह, कतरनी तनाव, खिंचाव और दबाव, विवो में ऊतक मॉर्फोजेनेसिस और होमियोस्टेसिस को प्रभावित करने के लिए जाने जाते हैं और पहले इन विट्रो10,11,12,13 में कोशिकाओं की परिपक्वता में सुधार करने के लिए दिखाए गए थे। ऑर्गेनोइड सिस्टम का एक अतिरिक्त महत्वपूर्ण दोष लुमेन की दुर्गमता है और इस प्रकार, उपकला के एपिकल पक्ष के लिए। यह आयन और ड्रग ट्रांसपोर्टरों, होस्ट-माइक्रोबायोम इंटरैक्शन और फार्मास्युटिकल विषाक्तता परीक्षण की ध्रुवीकृत अभिव्यक्ति से जुड़े विभिन्न तंत्रों की जांच के लिए एक चुनौती प्रस्तुत करता है। अंत में, ऑर्गेनोइड संस्कृतियां आकार, आकृति विज्ञान और कार्य में काफी परिवर्तनशीलता से पीड़ित हैं, इन विट्रो स्व-संगठन प्रक्रिया और सेल भाग्य विकल्पों की स्टोकेस्टिक प्रकृति के कारण। इसलिए, रोग मॉडलिंग, ड्रग स्क्रीनिंग और पुनर्योजी चिकित्सा में आंतों के ऑर्गेनोइड की पूरी क्षमता का एहसास करने के लिए, नई रणनीतियों का पता लगाना आवश्यक है जो ऑर्गेनोइड विकास में परिवर्तनशीलता को कम करते हैं, ल्यूमिनल डिब्बे तक पहुंच में सुधार करते हैं, और लापता सेल-सेल इंटरैक्शन को शामिल करते हैं।
ऑर्गन-ऑन-ए-चिप तकनीक ने इन विट्रो में आंतों की कोशिका संस्कृतियों में यांत्रिक बलों और द्रव प्रवाह को शामिल करने के लिए कई तकनीकों को पेश किया है। हालांकि, चूंकि अधिकांश प्रारंभिक प्रमाण-अवधारणा अध्ययनों ने कैंसर-व्युत्पन्न सेल लाइनों का उपयोग किया है जो पर्याप्त सेलुलर विविधता का प्रदर्शन नहीं करते हैं, इसलिए इन प्रणालियों की प्रासंगिकता पर सवाल उठाया गया है। हाल ही में, हमने आंतों के ऑर्गेनोइड और ऑर्गन-ऑन-ए-चिप तकनीक को सहक्रियात्मक रूप से जोड़ा है ताकि प्रत्येक दृष्टिकोण की सर्वोत्तम विशेषताओं को इन विट्रो सिस्टम14,15,16 में शामिल किया जा सके। परिणामस्वरूप आंत-चिप आंतों के उपकला के बहुकोशिकीय वास्तुकला, उपकला-एंडोथेलियल ऊतक इंटरफ़ेस की उपस्थिति, और द्रव प्रवाह और खिंचाव के यांत्रिक बलों को दोहराता है, जो इन विट्रो में अंग-स्तरीय कार्यों के अनुकरण को सक्षम करता है। इसके अतिरिक्त, प्रारंभिक सामग्री के रूप में प्राथमिक-ऊतक-व्युत्पन्न ऑर्गेनोइड (जिसे मानव आंत के विभिन्न क्षेत्रों से नमूना लिया जा सकता है) का उपयोग इस मॉडल की बहुमुखी प्रतिभा को बढ़ाता है, क्योंकि मानव ग्रहणी, जेजुनम, इलियम और बृहदान्त्र का प्रतिनिधित्व करने वाले चिप्स समान बोने और संस्कृति प्रक्रियाओं के बाद स्थापित किए जा सकते हैं। महत्वपूर्ण बात यह है कि आंत-चिप्स वास्तविक समय के मूल्यांकन को सक्षम करते हैं: आंतों की बाधा अखंडता; ब्रश सीमा और दवा-चयापचय एंजाइमों की गतिविधि; म्यूकिन का उत्पादन; साइटोकिन्स का स्राव; और रोगजनक और कमेंसल सूक्ष्मजीवों के साथ आंतों की कोशिकाओं की बातचीत, जैसा कि पहले प्रकाशित रिपोर्टों में दिखाया गया है। विशेष रूप से, जब विभिन्न व्यक्तियों के ऊतकों से उत्पन्न ऑर्गेनोइड का उपयोग करके आंत के चिप्स स्थापित किए गए थे, तो इन मॉडलों ने विभिन्न दवाओं और उपचारों के कार्यात्मक प्रतिक्रियाओं में अपेक्षित अंतर-दाता परिवर्तनशीलता पर कब्जा कर लिया। कुल मिलाकर, ऑर्गन-ऑन-ए-चिप तकनीक के साथ ऑर्गेनोइड को विलय करने से विवो-प्रासंगिक मॉडल में अधिक उन्नत, व्यक्तिगत, दरवाजा खुलता है जो इन विट्रो निष्कर्षों की शारीरिक प्रासंगिकता और सटीकता के साथ-साथ मनुष्यों के लिए उनके एक्सट्रपलेशन में सुधार कर सकता है। यहां, दो आंतों के खंडों के शारीरिक कार्यों के अध्ययन में आंत चिप और इसके आवेदन की स्थापना के लिए एक विस्तृत प्रोटोकॉल प्रस्तुत किया गया है: ग्रहणी और बृहदान्त्र। सबसे पहले, ग्रहणी चिप में दवा-चयापचय एंजाइम सीवाईपी 3 ए 4 की गतिविधि का आकलन करने के तरीकों के साथ-साथ रिफैम्पिसिन और विटामिन डी 3 जैसे प्रोटोटाइपिकल यौगिकों द्वारा इसके प्रेरण का वर्णन किया गया है। दूसरे, बृहदान्त्र चिप में “टपका हुआ आंत” मॉडल करने के लिए आवश्यक कदम प्रोटोकॉल में उल्लिखित हैं, उपकला बाधा के विघटन के साथ आईबीडी के रोगजनन में फंसे हॉलमार्क साइटोकिन्स का उपयोग करके किया जा रहा है। संक्षेप में, मानव बायोप्सी से प्राप्त ऑर्गेनोइड को इन विट्रो में प्रचारित किया जाता है, एंजाइमी पाचन के अधीन किया जाता है, और चिप के शीर्ष चैनल में पेश किया जाता है। विकास-कारक-समृद्ध मीडिया के साथ निरंतर छिड़काव की उपस्थिति में वे 3 डी वास्तुकला और आसानी से सुलभ एपिकल सेल सतह के साथ एक संगम उपकला मोनोलेयर में विकसित होते हैं। नीचे, “संवहनी” चिप डिब्बे को छोटी या बड़ी आंत से अलग माइक्रोवास्कुलर एंडोथेलियल कोशिकाओं के साथ वरीयता दी जाती है। उपकला और एंडोथेलियम को एक छिद्रपूर्ण खिंचाव झिल्ली द्वारा अलग किया जाता है, जो दो ऊतकों के बीच पैराक्राइन इंटरैक्शन की सुविधा प्रदान करता है और, जब चक्रीय विकृतियों के अधीन होता है, तो मानव आंत के पेरिस्टलसिस जैसी गति का अनुकरण करता है। सह-संस्कृति को उचित सेल संस्कृति मीडिया के साथ ल्यूमिनल और संवहनी छिड़काव द्वारा उत्पन्न गतिशील प्रवाह स्थितियों के तहत बनाए रखा जाता है। अंत में, हम कई प्रकार के परख और समापन बिंदु विश्लेषणों का वर्णन करते हैं जिन्हें सीधे ऑन-चिप या नमूना सेल संस्कृति प्रवाह से किया जा सकता है।
ऑर्गन-ऑन-ए-चिप तकनीक और आंतों के ऑर्गेनोइड का संयोजन मानव आंतों के शरीर विज्ञान और पैथोफिजियोलॉजी के सटीक मॉडलिंग के लिए वादा करता है। यहां, हम बायोप्सी-व्युत्पन्न छोटे आंतों या कोलोनिक उपकला और आंतों…
The authors have nothing to disclose.
हम चिप, पोर्टेबल और संस्कृति मॉड्यूल के वैज्ञानिक चित्रों को डिजाइन करने के लिए आंतों की बायोप्सी-व्युत्पन्न ऑर्गेनोइड और ब्रेट क्लेयर प्रदान करने के लिए प्रोफेसर मार्क डोनोविट्ज़ को धन्यवाद देते हैं। बाकी सभी वैज्ञानिक चित्र बायोरेंडर का उपयोग करके उत्पन्न किए गए थे।
small intestine Human Intestinal Microvascular Endothelial Cells | AlphaBioRegen | ALHE15 | 0.5 cells M/ml ; cryopreserved |
colon Human Intestinal Microvascular Endothelial Cells | AlphaBioRegen | ALHE16 | 0.5 cells M/ml ; cryopreserved |
Biopsy-derived Human Duodenal Organoids | John Hopkin's University | – | The organoids were provided by Professor Mark Donowitz (Institutional Review Board Number: NA_00038329). |
Biopsy-derived Human Colonic Organoids | John Hopkin's University | – | The organoids were provided by Professor Mark Donowitz (Institutional Review Board Number: NA_00038329). |
Zoë CM-1™ Culture Module | Emulate Inc. | – | Culture module |
Orb-HM1™ Hub Module | Emulate Inc. | – | 5% CO2, vacuum stretch, and power supply |
Chip-S1™ Stretchable Chip | Emulate Inc. | – | Organ-Chip |
Pod™ Portable Modules | Emulate Inc. | – | Portable module |
UV Light Box | Emulate Inc. | – | – |
Chip Cradle | Emulate Inc. | – | 1 per square culture dish |
Steriflip®-HV Filters | EMD Millipore | SE1M003M00 | 0.45 μm PVDF filter |
Square Cell Culture Dish (120 x 120 mm) | VWR | 82051-068 | – |
Handheld vacuum aspirator | Corning | 4930 | - |
Aspirating pipettes | Corning / Falcon | 357558 | 2 mL, polystyrene, individually wrapped |
Aspirating tips | - | Sterile (autoclaved) | |
Serological pipettes | - | 2 mL, 5 mL, 10 mL, and 25 mL low endotoxin, sterile | |
Pipette | P20, P200, P1000 and standard multichannel | ||
Pipette tips | P20, P200, and P1000. | ||
Conical tubes (Protein LoBind® Tubes) | Eppendorf | 0030122216; 0030122240 | 15 mL, 50 mL tubes |
Eppendorf Tubes® lo-bind | Eppendorf | 022431081 | 1.5 mL tubes |
96 wells black walled plate | – | – | for epithelial permeability analysis |
Microscope (with camera) | – | – | For bright-field imaging |
Water bath (or beads) | – | – | Set to 37°C |
Vacuum set-up | - | – | Minimum pressure: -70 kPa |
Cell scrapers | Biotium | 220033 | |
T75 flasks | BD Falcon | 353136 | Cell culture flask |
Emulate Reagent-1 (ER-1) | Emulate Inc. | – | Chip coating solution |
Emulate Reagent-2 (ER-2) | Emulate Inc. | – | Chip coating solution |
Dulbecco’s PBS (DPBS) | Corning | 21-031-CV | 1X |
Cell Culture Grade Water | Corning | MT25055CV | |
Trypan blue | Sigma | 93595 | For cell counting |
TryplE Express | ThermoFisher Scientific | 12604013 | Organoids dissociation and endothelium cells detachment solution |
Advanced DMEM/F12 | ThermoFisher Scientific | 12634028 | Medium |
IntestiCult™ Organoid Growth Medium (Human) | Stem Cell technologies | 06010 | Organoid Growth Medium |
Endothelial Cell Growth Medium MV 2 | Promocell | C-22121 | Endothelial medium |
Fetal bovine serum (FBS) | Sigma | F4135 | Serum |
Primocin™ | InvivoGen | ANT-PM-1 | antimicrobial agent |
Attachment Factor™ | Cell Systems | 4Z0-210 | coating solution for flask |
Matrigel – Growth Factor Reduced | Corning | 356231 | Solubilized basement membrane matrix |
Collagen IV | Sigma | C5533 | ECM component |
Fibronectin | Corning | 356008 | ECM component |
Y-27632 | Stem Cell technologies | 72304 | organoid media supplement |
CHIR99021 | Reprocell | 04-0004-10 | organoid media supplement |
Cell Recovery Solution | Corning | 354253 | Basement mebrane matrix dissociationsolution |
Bovine Serum Albumin (BSA) | Sigma | A9576 | 30%, Sterile |
Cell Culture Grade Water | Corning | MT25055CV | Sterile, Water |
DMSO | Sigma | D2650 | solvent |
3KDa Dextran Cascade Blue | Invitrogen | D7132 | 10 mg powder |
Rifampicin (RIF) | Sigma | Cat# R3501 | CYP inducer |
Testosterone hydrate | Sigma | T1500 | CYP substrate |
1,25-dihyroxy Vitamin D3 (VD3) | Sigma | Cat# D1530 | CYP inducer |
Acetonitrile with 0.1% (v/v) Formic acid | Sigma | 159002 | LCMS stop solution |
IFNγ | Peprotech | 300-02 | |
4% Paraformaldehyde (PFA) | EMS | 157-4 | Fixative |
Triton-X 100 | Sigma | T8787 | |
Normal Donkey Serum (NDS) | Sigma | 566460 | |
anti-Occludin | ThermoFisher Scientific | 33-1500 | tight junctions marker |
anti-Claudin 4 | ThermoFisher Scientific | 36-4800 | tight junctions marker |
anti-E-cadherin | Abcam | ab1416 | epithelial adherens junctions marker |
anti-VE-cadherin | Abcam | ab33168 | endothelial adherent junctions marker |
anti- Zonula Occludens 1 (ZO-1) | Thermo Fischer | 339194 | tight junctions marker |
DAPI | ThermoFisher Scientific | 62248 | nuclear stain |
2-mercaptoethanol | Sigma | M6250 | |
PureLink RNA Mini Kit | Invitrogen | 12183020 | RNA lysis, isolation and purification kit |
SuperScript™ IV VILO™ Master Mix | Invitrogen | 11756050 | reverse transcriptase kit |
TaqMan™ Fast Advanced Master Mix | Applied Biosystems | 4444557 | qPCR reagent |
QuantStudio™ 5 Real-Time PCR System | Applied Biosystems | A28573 | Real-time PCR cycler |
18S primer | ThermoFisher Scientific | Hs99999901_s1 | Eukaryotic 18S rRNA |
CYP3A4 primer | ThermoFisher Scientific | Hs00604506_m1 | Cytochrome family 3 subfamily A member 4 |
Pierce™ Coomassie Plus (Bradford) Assay Kit | ThermoFisher Scientific | 23236 | Protein quantification kit |
MSD Tris lysis buffer | Meso Scale Diagnostics | R60TX-3 | Protein lysis buffer |
Cleaved/Total Caspase-3 Whole Cell Lysate Kit | Meso Scale Diagnostics | K15140D | Caspase 3 detection kit |
V-PLEX Vascular Injury Panel 2 Human Kit | Meso Scale Diagnostics | K15198D | |
V-PLEX Human Proinflammatory Panel II (4-Plex) | Meso Scale Diagnostics | K15053D | |
Zeiss LSM 880 | Zeiss | – | Confocal microscope |
Zeiss LD plan-Neofluar 20x/0.40 Korr M27 | Zeiss | – | 20X long-distance objective lenses |
Zeiss AXIOvert.A1 | Zeiss | – | Brightfield microscope |
Zeiss LD A-Plan 10X/0.25 Ph1 | Zeiss | – | 10X objective lenses |