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Purificação Bioquímica e Caracterização Proteômica de Núcleos de Fibril Amiloides do Cérebro

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DOI:

10.3791/63816

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28 de abril de 2022

 ,  , 
1Department of Neurology, Northwestern University Feinberg School of Medicine

Neste artigo

Resumo

Este método de purificação bioquímica com análise proteômica baseada em espectrometria de massa facilita a caracterização robusta de núcleos fibril amiloides, o que pode acelerar a identificação de alvos para prevenir a doença de Alzheimer.

Resumo

As inclusões fibrilares proteináceas são marcas patológicas fundamentais de múltiplas doenças neurodegenerativas. Nos estágios iniciais da doença de Alzheimer (DA), peptídeos amilóide-beta formam protofibrilas no espaço extracelular, que agem como sementes que gradualmente crescem e amadurecem em grandes placas amiloides. Apesar dessa compreensão básica, o conhecimento atual da estrutura de fibrila amiloide, composição e padrões de deposição no cérebro é limitado. Uma grande barreira tem sido a incapacidade de isolar fibrilas amiloides altamente purificadas de extratos cerebrais. A purificação de afinidade e as abordagens baseadas em microdissecção de captura a laser foram usadas anteriormente para isolar amiloides, mas são limitadas pela pequena quantidade de material que pode ser recuperada. Este novo protocolo robusto descreve a purificação bioquímica de núcleos de placas amiloides usando solubilização de sulfato de dodecilo de sódio (SDS) com ultracentrifugação de gradiente de densidade de sacarose e ultrassônicas e produz fibrilas altamente puras de pacientes com DA e tecidos cerebrais modelo AD. A análise proteômica de baixo para cima baseada em espectrometria de massa (MS) do material purificado representa uma estratégia robusta para identificar quase todos os componentes proteicos primários das fibrilas amiloides. Estudos proteômicos anteriores de proteínas na coronária amiloide revelaram uma coleção inesperadamente grande e funcionalmente diversificada de proteínas. Notavelmente, após o refino da estratégia de purificação, o número de proteínas de co-purificação foi reduzido em mais de 10 vezes, indicando a alta pureza do material isolado SDS insolúvel. A coloração negativa e a microscopia eletrônica imuno-ouro permitiram a confirmação da pureza dessas preparações. Outros estudos são necessários para compreender os atributos espaciais e biológicos que contribuem para a deposição dessas proteínas em inclusões amiloides. Em conjunto, essa estratégia analítica está bem posicionada para aumentar a compreensão da biologia amiloide.

Introdução

Amiloide é um arranjo supramolecular extremamente estável que é encontrado em um painel diversificado de proteínas, algumas das quais levam a mudanças patológicas1. O acúmulo de agregados amiloides intra ou extracelulares é observado em várias doenças neurodegenerativas2. Os agregados amiloides são heterogêneos e são enriquecidos com um grande número de proteínas e lipídios3. Nos últimos anos, o interesse pelo proteome amiloide tem gerado interesse substancial entre neurocientistas básicos e translacionais. Vários métodos foram desenvolvidos para extrair e purificar agregados amiloides de tecidos cerebrais humanos de camundongos e pós-morte. Microdisseção de captura a laser, imunoprecipitação, descelularização e isolamento bioquímico de agregados amiloides são métodos amplamente utilizados para extrair e purificar placas amiloides, fibrilas e oligômeros 4,5,6,7. Muitos desses estudos têm se concentrado em determinar a composição proteica desses depósitos fibrilares bem embalados usando em ms semi-quantitativo. No entanto, os resultados disponíveis são inconsistentes, e o número surpreendentemente grande de proteínas co-purificadoras relatadas anteriormente são desafiadores de interpretar.

A principal limitação da literatura existente descrevendo o núcleo amiloide nos cérebros modelo de camundongos AD e AD é que o material purificado contém um número incontrolável de proteínas co-purificadoras. O objetivo global deste método é superar essa limitação e desenvolver uma purificação bioquímica robusta para isolar núcleos de fibrila amiloide. Esta estratégia emprega um método bioquímico baseado em afluente de densidade de sacarose anteriormente descrito para o isolamento de frações amiloides enriquecidas insolúveis da SDS a partir de tecidos cerebrais humanos e camundongos pós-morte 8,9. Este método baseia-se na literatura existente, mas vai além com a ultrassonização e as lavagens SDS para remover a maioria das proteínas amiloides frouxamente ligadas, levando ao isolamento de fibrilas amiloides altamente purificadas (Figura 1). As fibrilas purificadas por este protocolo superam vários desafios existentes frequentemente encontrados em estudos estruturais de fibrilas amiloides isolados de extratos cerebrais. A visualização dessas fibrilas com microscopia eletrônica de transmissão (TEM) confirma a integridade e pureza do material purificado (Figura 2). Neste estudo, as fibrilas isoladas são solubilizadas e digeridas em peptídeos com trippsina, e a análise de MS sem rótulos pode facilmente revelar a identidade das proteínas que formam o núcleo fibril. Notavelmente, algumas dessas proteínas têm uma tendência inerente à formação de conjuntos supramoleculares em organelas não ligadas à membrana. Além disso, muitas das proteínas identificadas na análise de fibrilas amilóide-beta (Aβ) também estão associadas a outras doenças neurodegenerativas, sugerindo que essas proteínas podem desempenhar um papel fundamental em múltiplas proteinopatias.

Este método SDS/ultrasonicação é improvável de alterar ou interromper a estrutura dos núcleos fibril. O material purificado também é adequado para uma ampla gama de abordagens de análise proteômica de cima para baixo e de baixo para cima e estratégias adicionais de análise estrutural baseada em MS, como crosslinking químico ou troca de deutério de hidrogênio. A recuperação geral usando este método é relativamente alta e, portanto, é adequada para estudos estruturais detalhados, que requerem microgramas a miligramas do material purificado. O material purificado também é adequado para estudos estruturais utilizando crioEM e microscopia de força atômica. Este protocolo, em combinação com a rotulagem isotópica estável de mamíferos, pode facilitar estudos de ressonância magnética nuclear de estado sólido (RMN) da estrutura amiloide10.

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Protocolo

Este protocolo envolve o uso de tecidos cerebrais humanos ou vertebrados. Toda a pesquisa foi realizada em conformidade com as diretrizes institucionais aprovadas da Universidade northwestern. O fluxo de trabalho atual é padronizado usando o cérebro do cérebro do cérebro do rato (AppNL-G-F/NL-G-F) extrai11. Este protocolo foi otimizado para extratos cerebrais de camundongos aos 6-9 meses de idade, e pode efetivamente purificar amiloides de animais machos e fêmeas.

NOTA: Para uma melhor compreensão do procedimento experimental global, consulte a Figura 1 para um esquema do fluxo de trabalho.

1. Colheita de tecidos e purificação amiloide

NOTA: Idealmente, as fibrilas amiloides devem ser isoladas de regiões cerebrais recém-dissecadas. No entanto, este método também funciona bem com tecidos cerebrais instantâneos ou congelados. Abaixo está um breve esboço de tecidos cerebrais com congelamento de estalos para armazenamento para uso posteriormente.

  1. Colheita e armazenamento de tecidos cerebrais: Disseque cérebros de camundongos e colmeça rapidamente as regiões carregadas de amiloide (ou seja, córtex e hipocampo), seguido de congelamento de snap em nitrogênio líquido ou um banho seco de álcool no gelo.
    NOTA: O congelamento de espetos ajuda a preservar os atributos estruturais dos constituintes do tecido. Os camundongos são eutanizados por isoflurano e luxação cervical 12,13. É aconselhável evitar o uso de CO2, uma vez que pode comprometer a integridade do proteome cerebral.
  2. Pós-dissecção, corte e armazene tecidos frescos em blocos pequenos (por exemplo, 5 mm x 5 mm), pois isso facilita a homogeneização mais eficiente antes da extração amiloide. Transfira o tecido para o frasco criogênico estéril, aperte sua tampa e submersa rapidamente.
  3. Mantenha os tecidos congelados em condições ultracold (ou seja, -80 °C ou nitrogênio líquido). Se a extração for realizada alguns dias depois, armazene os tecidos a -20 °C e evite ciclos de congelamento e degelo. Descongele os tecidos congelados no gelo molhado quando estiver pronto para extração e purificação.
    NOTA: O contato direto dos tecidos com nitrogênio líquido pode causar danos teciduais e proteicos. Note que um banho de álcool pode remover marcadores permanentes das etiquetas do tubo.

2. Enriquecimento de material insolúvel da SDS

NOTA: Realize todos os passos no gelo e centrífuga a 4 °C, a menos que seja indicado o contrário. Os detalhes de todos os buffers e soluções utilizados neste protocolo são fornecidos no Arquivo Suplementar 1. Os fabricantes e o catálogo de números de produtos químicos e instrumentos são fornecidos na Tabela de Materiais.

  1. Comece com regiões de tecido cerebral recém-dissecadas ou congeladas (descongeladas no gelo) colocadas em um tubo de 2 mL contendo contas de cerâmica de 6-8 e tampão de homogeneização gelada recém-preparado (1 mL para 0,25-1 g de massa de tecido molhado).
  2. Transfira os tubos para o homogeneizador do moinho de contas e triture o conteúdo tecidual a 4000 rpm, com dois ciclos de 30 s cada e um intervalo de 30 s no meio.
    NOTA: Alternativamente, sistemas de agitador ou homogeneizador motorizados podem ser usados para moer e homogeneizar os tecidos.
  3. Adicione 9 mL de tampão de homogeneização gelada ao 1 mL de tecido inteiro do cérebro homogeneizar em tubos de 15 mL, selar com tiras de filme de cera de laboratório e girar de ponta a ponta durante a noite a 4 °C para garantir solubilização robusta.
    NOTA: Para remover detritos celulares grandes e lipídios indesejados, na manhã seguinte, gire os tubos a 800 x g a 4 °C por 10 min e colete o sobrenante em um tubo fresco. Resuspend a pelota restante em 2 mL de tampão de homogeneização gelada, misture bem, gire novamente por 10 min a 4 °C, e combine as duas supernantes.
  4. Adicione lentamente sacarose sólida à suspensão do extrato do tecido a uma concentração final de 1,2 M, misture bem e centrífuga a 250.000 x g por 45 min a 4 °C.
  5. Remova cuidadosamente e descarte o sobrenatante usando uma pipeta. Resuspenha a pelota em 2 mL de tampão de homogeneização contendo 1,9 M de sacarose por trituração, seguida de centrifugação a 125.000 x g para 45 min a 4 °C.
    NOTA: O volume do buffer pode ser ajustado com base na quantidade de material recuperado da etapa anterior. Em geral, 10 volumes de tampão de homogeneização (V/V) é ideal para esta etapa.
  6. Colete a camada sólida branca superior usando uma pipeta, transfira-a para um tubo fresco e solubilize em 1 mL de tampão de lavagem gelada, pipetando para cima e para baixo várias vezes, sem introduzir bolhas de ar.
  7. Além da camada superior, a pelota também é enriquecida com fibrilas amiloides. Para um rendimento maior, combine as duas frações e prossiga. Remova cuidadosamente a camada aquosa média usando uma pipeta e descarte.
  8. Centrifugar as frações combinadas a 8000 x g por 20 min a 4 °C. Descarte o supernatante.
  9. Adicione 1 mL de tampão de digestão gelada à pelota lavada, resuspend e incubar à temperatura ambiente (RT) por 3h.
  10. Centrifugar a 8000 x g por 20 min a 4 °C e remover o supernatante usando uma pipeta.
  11. Resuspend e lavagem (mesmo que passo 2.8.) a pelota digerida duas vezes em 1 mL de tampão Tris gelado.
  12. Resuspenha a pelota lavada em 1 mL de tampão de solubilização contendo 1% SDS e 1,3 M de sacarose por tubulação para cima e para baixo. Centrifugar rapidamente a 200.000 x g para 60 min a 4 °C.
    NOTA: Embora as fibrilas amiloides sejam altamente resistentes a detergentes e desnatantes, exposições muito longas ao detergente (1% SDS) podem afetar a integridade das fibrilas ou remover as proteínas firmemente ligadas, o que comprometerá análises subsequentes. Portanto, imediatamente após o ressusususundo as pelotas, proceda à centrifugação.
  13. Economize a pelota e aumente o volume do restante do supernadante adicionando 50 mM Tris buffer (em razão 1:0.3) para reduzir a concentração de sacarose de 1,3 para 1 M e centrífugas mais uma vez a 200.000 x g por 45 min a 4 °C.
  14. Dissolva as duas pelotas em 100 μL de tampão Tris contendo SDS de 0,5% e piscina para purificação amiloide. As pelotas visíveis são pequenas e devem parecer opacas e off-white (ver Figura 2A).

3. Purificação amiloide

NOTA: Combine as duas pelotas, solubilize por pipetação até obter uma solução uniforme e proceda com as seguintes etapas de purificação amiloide.

  1. Para a solubilização completa do material rico em amiloide presente em pelotas, sujeito o tubo a cisalhamento mecânico produzido por ondas de ultrassom em um dispositivo de sônica de banho que funciona para 30 s ON e 30 s OFF em uma frequência de médio alcance para 20 ciclos.
  2. Imediatamente centrifugar o material a 20.000 x g por 30 min a 4 °C e resuspensar a pelota em 500 μL de 0,5% de tampão SDS Tris.
  3. Repita o passo 3.1. e passo 3.2. quatro vezes para um total de cinco lavagens. O número de lavagens pode ser aumentado para melhorar a pureza.
    NOTA: As etapas de sônica e lavagem são otimizadas a 0,5% de SDS, pois concentrações mais elevadas podem afetar a estrutura, integridade ou composição proteica das fibrilas. Não é recomendado aumentar a concentração de SDS nesta etapa.
  4. Após a etapa final de centrifugação, lave a pelota em 200 μL de água ultra-pura e centrífuga a 20.000 x g por 30 min a 4 °C para remover qualquer detergente restante. A pelota lavada contendo fibrilas amiloides purificadas parece semi-transparente em cores e é difícil de ver às vezes.
  5. Dissolva a pelota final contendo fibrilas amiloides purificadas em 100 μL de água ultrapura. Proceda imediatamente para o processamento a jusante ou salve a suspensão da fibrila a -20 °C para análise posterior. Se congelado, descongele no gelo antes de iniciar a precipitação.

4. Precipitação de clorofórmio de metanol

NOTA: Se o objetivo final é realizar a análise proteica, recomenda-se desalar e remover impurezas não proteináceas adicionais.

  1. Adicione 400 μL de metanol aos 100 μL purificados de fibrilas amiloides em um tubo de 1,5 mL e bem vórtice.
  2. Adicione 100 μL de clorofórmio ao tubo e ao vórtice bem.
  3. Adicione 300 μL de água ultrauso e vórtice completamente. Isso torna a mistura nublada devido à precipitação proteica.
  4. Centrifugar a 12.000 x g por 2 min no RT.
  5. Remova cuidadosamente a camada aquosa (ou seja, topo) sem perturbar a camada de interface que contém o floco de proteína.
  6. Adicione o mesmo volume de metanol novamente e centrífuga a 12.000 x g por 2 min no RT.
  7. Descarte o supernatante usando uma pipeta e seque a pelota no RT. Evite a secagem excessiva; fração amiloide é difícil de ressolar se sobre-seca.

5. Digestão de trippsina

  1. Dissolva a pelota em 50 μL de tampão de cloridrato de guanidina (GuHCl). Sonicate em um banho de água gelada e aqueça a 95 °C por 5 min, se necessário.
  2. Vórtice completamente em RT por 45 min a 1 h para dissolver completamente. A pelota não será visível após esta etapa, e a solução parece clara na aparência.
  3. Adicione o mesmo volume de solução surfactante de 0,2%. Solubilize na RT com vórtice por 60 min. Esta etapa melhora a atividade enzimática de trypsin.
  4. Adicione 1 μL de tris-2-carboxilfosphine (TCEP) da solução de estoque de 500 mM. Incubar por 60 min.
  5. Adicione 2 μL de iodoacetamida de 500 mM (IAA) e incuba no escuro por 20 minutos.
  6. Sacie o IAA com 5 μL de solução TCEP por 15 min.
  7. Adicione o volume necessário de 50 mM solução de bicarbonato de amônio ao tubo para reduzir a concentração de guanidina para 1,5 M.
  8. Adicione 1% de solução surfactante ao tubo (1 μL/50 μg de proteína).
  9. Adicione trippsina (1 μg/100 μg de proteína) e deixe o tubo se misturando a 37 °C durante a noite.

6. Limpeza de peptídeos

  1. Na manhã seguinte, acidifice a solução de peptídeo digerido baixando o pH para 2,0 adicionando ácido fórmico.
  2. Ative a coluna de giro C18 (n-octadecyl) em um tubo receptor de 2 mL adicionando 200 μL de solução de metanol de 50% e gire a 1500 x g por 2 min na RT. Repita a etapa de ativação.
  3. Equilibre os leitos de resina da coluna C18 adicionando 200 μL de tampão de equilíbrio e girando por 2 min com as mesmas condições. Repita este passo.
  4. Carregue a solução de peptídeo acidificado na coluna C18 e centrífuga a 1500 x g por 2 min na RT. Coleça o fluxo e recarregue-o mais uma vez. Descarte o segundo fluxo.
  5. Lave os peptídeos ligados à resina C18 com o tampão de lavagem 2x, como feito na Etapa 6.3. Use o mesmo tampão de equilíbrio para lavar a coluna.
  6. Elute os peptídeos adicionando 40 μL de tampão de eluição seguido de centrifugação a 1500 x g, por 2 min em RT. Repita o passo de eluição três vezes para aumentar o rendimento dos peptídeos recuperados.
  7. Seque os peptídeos em um concentrador de vácuo de velocidade evaporando a solução aquosa. Pelotas secas podem ser salvas a -20 °C por algumas semanas antes da análise de MS.

7. Configuração de espectrômetro de massa para análise de peptídeos

NOTA: Para parâmetros ms, consulte Arquivo Suplementar 1 (adaptado de uma publicação anterior do laboratório)14.

  1. Antes de carregar as amostras de peptídeos para a análise de MS, dissolva as pelotas de peptídeos secos em 20 μL de tampão de carga de amostra e realize micro BCA para quantificar a concentração de peptídeos recuperados.
  2. Transfira os peptídeos dissolvidos em um frasco de vidro e carregue 3 μg (quantificado a partir de micro BCA) de peptídeos para o autosampler do sistema UPLC.
  3. Carregue as amostras em uma coluna de armadilha ventilada (coluna HPLC C18, 0,075 mm x 20 mm) com uma taxa de fluxo de 250 nL/min.
  4. Organize a coluna de armadilha em linha com uma coluna analítica (0,075 μm x 500 mm) e monte uma ponta de emissor para a fonte de ionização de eletrospray (ESI) submetida a uma tensão de pulverização de 2000 V.
    NOTA: Neste estudo, é realizado o ESI, no qual a fase móvel é submetida à ionização de alta tensão na fase do gás. O spray criado por isso é direcionado para a câmara de vácuo do MS através de um capilar aquecido. Enquanto sob vácuo, a desolação das gotículas e a ejeção de íons ocorre na presença de calor e tensão. Depois disso, os íons são acelerados em direção ao analisador de massa na presença de um ambiente de alta tensão.
  5. Analise as amostras com corridas de aquisição de 2 h. Este estudo é realizado utilizando-se aquisição dependente de dados com o paradigma de seleção de íons precursores mais intenso.
    NOTA: Na aquisição dependente de dados, um número limitado de peptídeos precursores são detectados na varredura MS1 e submetidos à fragmentação para análise de MS2. No entanto, a exclusão dinâmica é problemática aqui, uma vez que peptídeos Aβ altamente abundantes serão omitidos para fragmentação e resultarão em uma subestimação de sua quantidade.
  6. Para quantificação absoluta dos peptídeos Aβ, execute as mesmas amostras mais uma vez usando o método MS/MS direcionado. Para este estudo, é preparada uma lista exaustiva de todas as proporções de m/z para vários peptídeos Aβ aβ possíveis para os modelos de mouse knock-in APP (ver Tabela Suplementar 1). Outros grupos devem preparar uma lista semelhante de acordo com o modelo de mouse disponível e os possíveis peptídeos gerados a partir da proteína de interesse (por exemplo, Aβ para AD).
    NOTA: Para abordar a exclusão de peptídeos altamente abundantes, use uma abordagem direcionada fornecendo uma lista de valores selecionados m/z correspondentes aos peptídeos tripptic aβ. Esta abordagem aborda o problema da exclusão dependente de dados dos peptídeos Aβ e pode quantificar as quantidades absolutas de diferentes monômeros (Aβ38, 40 e 42 peptídeos) com alta resolução.
  7. O espectrômetro de massa gera espectros ms das amostras de peptídeos e salva arquivos de dados brutos no diretório de destino. Use este arquivo para executar a correspondência espectral usando ferramentas estatísticas e bioinformáticas bem estabelecidas. Várias ferramentas de pesquisa e análise de banco de dados on-line e off-line estão disponíveis.

8. Análise de dados de MS

  1. Extrair os arquivos MS1 e MS2 usando a ferramenta Rawconverter offline (http://www.fields.scripps.edu/rawconv/).
  2. Realize a identificação, quantificação e análises detalhadas dos dados em um mecanismo de pesquisa de dados MS baseado na Web. Neste estudo, utilizou-se Pipeline Integrado de Proteômica - IP2 (Bruker: http://www.integratedproteomics.com/).
    NOTA: Várias outras ferramentas de análise de dados MS on-line e off-line estão disponíveis e também podem ser usadas, como o MaxQuant (https://www.maxquant.org/).
  3. Depois de carregar os arquivos MS1 e MS2, selecione um banco de dados proteome de mouse atualizado. Aqui, um banco de dados de mouse atualizado contendo mutações específicas adicionais do App knock-in é selecionado para a identificação de peptídeos usando algoritmos ProLuCId e SEQUEST11.
  4. No sistema de análise IP2, selecione os parâmetros padrão e modifique-os de acordo com os requisitos experimentais. Neste estudo, é utilizada uma tolerância de massa de peptídeo de 50 ppm para precursor e 600 ppm para fragmentos (consulte o Arquivo Suplementar 1 para outros parâmetros utilizados em IP2).
    NOTA: Os pesquisadores podem modificar os parâmetros de pesquisa de acordo com os objetivos experimentais. Por exemplo, para identificar modificações pós-translacionais, adicione valores de modificação diferencial para vários PTMs (por exemplo, ubiquização, SUMOylation, fosforilação).

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Resultados

Aqui, um método detalhado para o isolamento e purificação de fibrilas amiloides usando um método de purificação de ultracentrifugação de densidade de sacarose modificada é resumido (ver Figura 1). A inovação neste método é a inclusão de etapas de lavagem à base de ultrassonificação utilizando um sistema de sônica de banho de água seguido pela solubilização do SDS, que remove muitas proteínas vagamente associadas das fibrilas amiloides que co-purificam com as fibrilas altamente densas e limpa...

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Discussão

Desenvolver uma compreensão clara da estrutura e composição amiloide é um desafio para biólogos e bioquímicos estruturais devido às complexidades biológicas e limitações experimentais na extração de fibrilas purificadas dos tecidos cerebrais da AD16,17. Fibrilas amiloides são polimórficas a nível molecular, mostrando uma população heterogênea de comprimentos e complexidades variados18,19. Para entender me...

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Divulgações

Os autores não têm nada a revelar.

Agradecimentos

Este trabalho foi apoiado pela concessão do NIH R01AG061865 a R.J.V. e J.N.S. Os autores agradecem a Vassar e aos membros do grupo de pesquisa Savas na Universidade Northwestern por suas discussões pensativas. Também agradecemos sinceramente ao Dr.s. Ansgar Seimer e Ralf Langen na Universidade do Sul da Califórnia por sua contribuição crucial. Agradecemos ao Dr. Farida Korabova pela preparação da amostra e imagens de microscopia eletrônica de coloração negativa no Centro de Microscopia Avançada da Universidade northwestern.

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Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo
NomeEmpresaNúmero de catálogoComentários
Acclaim PepMap 100 C18 Coluna HPLC 0.075 mm x 20  mmThermo Scientific164535Podem ser utilizados instrumentos alternativos, produtos químicos e anticorpos de outros fabricantes
Bicarbonato de amónioSigma-Aldrich9830
anti-beta-amilóide (1-16) anticorpo 6E10Biolegend 803001
anti-beta-amilóide (17-24) anticorpo 4G8Biolegend800701
anti-beta-amilóide (terminal N 82E1) anticorpoIBL America10323
anti-fibrila amilóide LOC anticorpo  Kit BCA EMD MilliporeAB2287
Thermo Fisher Scientific23225
Bioruptor Pico PlusDiagenodeB01020001
Cloreto de CálcioSigma-Aldrich  C1016
CollagenaseSigma-AldrichC0130
Completo  Coquetel Inibidor de ProteaseSigma-Aldrich11697498001
Dnase IThermo Fisher ScientificEN0521
EDTASigma-AldrichEDS
Cloridrato de guanidinaCartuchos Sigma-AldrichG4505
HyperSep C18Thermo Fisher Scientific60108-302
Pipeline de Proteômica Integrada - IP2 http://www.integratedproteomics.com/
Iodoacetamida (IAA)Sigma-AldrichI1149
K54 Sistema de Homogeneização de Tecidos MotorCole ParmerGlas-Col 099C
MaxQuanthttps://www.maxquant.org/
Micro Kit BCAThermo Fisher Scientific23235
Nanoviper 75 μ m x 50  cmThermo Scientific164942
Optima L-90K UltracentrifugeBeckman CoulterBR-8101P-E
Orbitrap Fusion TribridMass SpectrometerThermo ScientificIQLAAEGAAPFADBMBCX
Pierce C18 Spin ColumnsThermo Fisher Scientific89870
Precellys 24 homogeneizador de tecidosBertin InstrumentsP000062-PEVO0-A
ProteaseMAX(TM) Surfactante Intensificador de TripsinaPromegaV2072
RawConverterhttp://www.fields.scripps.edu/rawconv/
Azida de sódioVWR97064-646
Dodecil sulfato de sódio (SDS)Sigma-Aldrich74255
Sorvall Legend Micro 21R MicrocentrífugaThermo Fisher ScientificConcentrador
vácuo de 75002446 velocidadeLabconco7315021
Tris-2-carboxietilfosfina (TCEP)Sigma-AldrichC4706-2G
Tris-HClThermo Fisher Scientific15568025
Tripsina Ouro-Massa grau de especificaçãoPromegaV5280
UltiMate 3000 RSLCnano SystemThermo Scientific
de ULTIM3000RSLCNANO

Referências

  1. Willbold, D., Strodel, B., Schröder, G. F., Hoyer, W., Heise, H. Amyloid-type protein aggregation and prion-like properties of amyloids. Chemical Reviews. 121 (13), 8285-8307 (2021).
  2. Rambaran, R. N., Serpell, L. C. Amyloid fibrils: abnormal protein assembly. Prion. 2 (3), 112-117 (2008).
  3. Upadhyay, A., et al. Complex inclusion bodies and defective proteome hubs in neurodegenerative disease: New clues, new challenges. The Neuroscientist. , (2021).
  4. Greiner, E. R., Kelly, J. W., Palhano, F. L. Immunoprecipitation of amyloid fibrils by the use of an antibody that recognizes a generic epitope common to amyloid fibrils. PLOS ONE. 9 (8), 105433(2014).
  5. Kourelis, T. V., et al. A proteomic atlas of cardiac amyloid plaques. JACC: CardioOncology. 2 (4), 632-643 (2020).
  6. Mangione, P. P., et al. Increasing the accuracy of proteomic typing by decellularisation of amyloid tissue biopsies. Journal of Proteomics. 165, 113-118 (2017).
  7. Rostagno, A., Neubert, T. A., Ghiso, J. Unveiling brain Aβ heterogeneity through targeted proteomic analysis. Methods in Molecular Biology. 1779, 23-43 (2018).
  8. Roher, A. E., et al. Morphology and toxicity of Aβ-(1-42) dimer derived from neuritic and vascular amyloid deposits of Alzheimer's disease. Journal of Biological Chemistry. 271 (34), 20631-20635 (1996).
  9. Lu, J. -X., et al. Molecular structure of β-amyloid fibrils in Alzheimer's disease brain tissue. Cell. 154 (6), 1257-1268 (2013).
  10. Tycko, R. Solid-state NMR studies of amyloid fibril structure. Annual Review of Physical Chemistry. 62, 279-299 (2011).
  11. Saito, T., et al. Single App knock-in mouse models of Alzheimer's disease. Nature Neuroscience. 17 (5), 661-663 (2014).
  12. Meyerhoff, J., et al. Microdissection of mouse brain into functionally and anatomically different regions. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (168), e61941(2021).
  13. Spijker, S. Dissection of Rodent Brain Regions. Neuroproteomics. Neuromethods. Li, K. 57, Humana Press. Totowa, NJ. (2011).
  14. Hark, T. J., et al. Pulse-chase proteomics of the App knockin mouse models of Alzheimer's disease reveals that synaptic dysfunction originates in presynaptic terminals. Cell Systems. 12 (2), 141-158 (2021).
  15. Liu, S., et al. Highly efficient intercellular spreading of protein misfolding mediated by viral ligand-receptor interactions. Nature Communications. 12 (1), 5739(2021).
  16. Toyama, B. H., Weissman, J. S. Amyloid structure: conformational diversity and consequences. Annual Review of Biochemistry. 80, 557-585 (2011).
  17. Sundaria, N., et al. Neurodegeneration & imperfect ageing: Technological limitations and challenges. Mechanisms of Ageing and Development. 200, 111574(2021).
  18. Cendrowska, U., et al. Unraveling the complexity of amyloid polymorphism using gold nanoparticles and cryo-EM. Proceedings of the National Academy of Sciences. 117 (12), 6866-6874 (2020).
  19. Seuring, C., et al. Amyloid fibril polymorphism: almost identical on the atomic level, mesoscopically very different. The Journal of Physical Chemistry B. 121 (8), 1783-1792 (2017).
  20. Close, W., et al. Physical basis of amyloid fibril polymorphism. Nature Communications. 9 (1), 699(2018).
  21. Tycko, R. Amyloid polymorphism: Structural basis and neurobiological relevance. Neuron. 86 (3), 632-645 (2015).
  22. Konstantoulea, K., et al. Heterotypic Amyloid β interactions facilitate amyloid assembly and modify amyloid structure. The EMBO Journal. 41, 108591(2022).
  23. Hondius, D. C., et al. Proteomics analysis identifies new markers associated with capillary cerebral amyloid angiopathy in Alzheimer's disease. Acta Neuropathologica Communications. 6 (1), 1-19 (2018).
  24. Luo, J., Wärmländer, S. K., Gräslund, A., Abrahams, J. P. Cross-interactions between the Alzheimer disease amyloid-β peptide and other amyloid proteins: a further aspect of the amyloid cascade hypothesis. Journal of Biological Chemistry. 291 (32), 16485-16493 (2016).
  25. Hosp, F., et al. Spatiotemporal proteomic profiling of Huntington's disease inclusions reveals widespread loss of protein function. Cell Reports. 21 (8), 2291-2303 (2017).
  26. Wallace, E. W. J., et al. Reversible, specific, active aggregates of endogenous proteins assemble upon heat stress. Cell. 162 (6), 1286-1298 (2015).
  27. Darling, A. L., Liu, Y., Oldfield, C. J., Uversky, V. N. Intrinsically disordered proteome of human membrane-less organelles. Proteomics. 18 (5-6), 1700193(2018).
  28. Kepchia, D., et al. Diverse proteins aggregate in mild cognitive impairment and Alzheimer's disease brain. Alzheimer's Research & Therapy. 12 (1), 1-20 (2020).
  29. Espay, A. J., et al. Revisiting protein aggregation as pathogenic in sporadic Parkinson and Alzheimer diseases. Neurology. 92 (7), 329-337 (2019).
  30. Fändrich, M., Schmidt, M., Grigorieff, N. Recent progress in understanding Alzheimer's β-amyloid structures. Trends in Biochemical Sciences. 36 (6), 338-345 (2011).
  31. Bonnin, E. A., Fornasiero, E. F., Lange, F., Turck, C. W., Rizzoli, S. O. NanoSIMS observations of mouse retinal cells reveal strict metabolic controls on nitrogen turnover. BMC Molecular and Cell Biology. 22 (1), 1-10 (2021).
  32. Michno, W., et al. Following spatial Aβ aggregation dynamics in evolving Alzheimer's disease pathology by imaging stable isotope labeling kinetics. Science Advances. 7 (25), (2021).
  33. Toyama, B. H., et al. Identification of long-lived proteins reveals exceptional stability of essential cellular structures. Cell. 154 (5), 971-982 (2013).
  34. Bomba-Warczak, E., Edassery, S. L., Hark, T. J., Savas, J. N. Long-lived mitochondrial cristae proteins in mouse heart and brain. Journal of Cell Biology. 220 (9), 202005193(2021).

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