Summary
该协议描述了使用脉冲SILAC，非靶向质谱分析和简化的蛋白质半衰期计算来标记衰老和非分裂细胞的代谢标记的工作流程。
Abstract
越来越多的证据表明，中枢神经系统中衰老细胞的积累有助于阿尔茨海默氏症和帕金森病等神经退行性疾病。细胞衰老是一种永久性细胞周期停滞的状态，通常发生在暴露于亚致死应激时。然而，像其他非分裂细胞一样，衰老细胞保持代谢活性，并执行许多需要独特的转录和翻译需求以及细胞内和分泌蛋白质组的广泛变化的功能。了解蛋白质合成和衰变速率在衰老过程中如何变化可以阐明细胞衰老的潜在机制，并为衰老细胞加剧的疾病找到潜在的治疗途径。本文描述了一种使用细胞培养中氨基酸脉冲稳定同位素标记（pSILAC）结合质谱法对非分裂细胞中的蛋白质半衰期进行蛋白质组规模评估的方法。pSILAC涉及具有稳定重同位素含氨基酸版本的细胞的代谢标记。结合现代质谱方法，pSILAC能够测量复杂混合物中数百或数千种蛋白质的蛋白质周转。代谢标记后，可以根据质谱法检测到的肽中重同位素的相对富集来确定蛋白质的周转动力学。在该协议中，描述了用于生成衰老成纤维细胞培养物和类似停滞的静止成纤维细胞的工作流程，以及简化的单时间点pSILAC标记时间过程，以最大限度地覆盖预期的蛋白质周转率。此外，还提供了一个管道，用于分析pSILAC质谱数据并使用电子表格计算蛋白质降解速率的用户友好型。该协议的应用可以从衰老细胞扩展到任何非分裂培养细胞，如神经元。
Introduction
衰老首先被确定为培养的原代细胞在达到复制性耗尽1后表现出的无限期生长停滞状态。此后，已经证明衰老可以响应许多细胞损伤而出现，包括遗传毒性，线粒体和致癌应激，等等2。虽然衰老具有几个生理上重要的作用，例如肿瘤抑制和伤口愈合，但衰老过程中衰老细胞的积累与对健康的一系列有害影响有关3，包括几种神经退行性疾病4，5，6。细胞衰老发生在多种脑细胞类型中，包括神经元7，8，9，10，星形胶质细胞11，小胶质细胞12和少突胶质细胞前体13，并导致神经变性和认知功能障碍。淀粉样蛋白β低聚物是阿尔茨海默病的标志之一14，已被证明可以加速神经元衰老13，15，16。衰老细胞患病率的增加也与帕金森病17有关，特别是由环境应激源引起的11，18。重要的是，在临床前模型中选择性消除衰老细胞可延长寿命并减轻多种与年龄相关的疾病3，5，12 并改善认知缺陷8，11，12，13。因此，衰老细胞已成为治疗许多与年龄相关的疾病的有希望的治疗靶点。
衰老细胞的大部分有害作用是由衰老相关的分泌表型（SASP）引起的，SASP是衰老细胞分泌的生物活性分子的复杂混合物，可引起局部炎症，血管生成，细胞外基质的破坏以及衰老在周围组织中的繁殖19，20，21.SASP还代表了一种有趣的衰老生物学现象，因为它需要在细胞周期停滞状态下进行相当大的转录和翻译工作。事实上，衰老细胞已被证明在核糖体生物发生22，23，24中表现出减少，这应该会减少蛋白质合成。相反，衰老细胞强健地翻译一些蛋白质，特别是SASP因子，并影响周围组织的代谢25。因此，对于了解经历永久性细胞周期停滞的衰老细胞如何继续维持蛋白质稳态，同时稳健地表达SASP因子和其他选择蛋白质，存在相当大的兴趣。
该方法描述了如何使用质谱和细胞培养中氨基酸的脉冲稳定同位素标记（pSILAC）在蛋白质组范围内全局测量衰老细胞中蛋白质的半衰期。在传统的SILAC中，培养的细胞完全用氨基酸的重和轻非放射性同位素进行代谢标记，用于蛋白质丰度的下游分析。该方法先前已应用于全面定量评估培养成纤维细胞SASP中的丰度变化26。在pSILAC中，细胞以类似的代谢标记方式使用重同位素脉冲进行标记，该脉冲随后用轻同位素进行预标记，然后以一个或多个时间间隔收获。然后使用重同位素相对于预先存在的轻同位素的掺入速率来计算相对蛋白质周转率。通常，使用精氨酸和赖氨酸的同位素，因为胰蛋白酶在这些残基上裂解;因此，来自标准消化的所有肽都可能含有重标记。仅因存在或不存在重赖氨酸或精氨酸而不同的肽对在化学上是相同的，可以通过质谱仪进行区分和定量。在质谱分析之后，可以根据所得肽鉴定中存在或不存在同位素标记，将肽识别为新合成的或预先存在的。然后可以通过拟合给定蛋白质的重（13 C-15N）与轻（12 C-14N）肽与指数增长或衰变的动力学模型的比率来确定蛋白质周转率27，28。pSILAC已被用于蛋白质周转率29，30，31，32的几种比较，并且是目前用于测量蛋白质半衰期的最全面和高通量方法。
该方案详细介绍了衰老细胞与培养物中类似生长停滞的静止细胞并行的制备，然后用pSILAC进行代谢标记。然后将细胞收获，匀浆成裂解物，并处理用于质谱采集和分析。然后，从质谱法获得的数据用于使用简化的定量方法确定蛋白质半衰期，该方法采用在电子表格中执行的单个时间点和半衰期计算。使用这种方法，可以以全面和定量的方式测量蛋白质半衰期的估计，与使用蛋白质合成或周转阻滞剂的协议相比，这种方式对未受干扰的细胞条件更真实。
Protocol
1.制备静止细胞和暴露于电离辐射（IR）而变衰老的细胞
注意：可以使用多种方法诱导细胞衰老和静止，如其他地方33，34，35中详细描述的那样。用于诱导衰老和静止的刺激可能取决于感兴趣的细胞类型和所研究的生物学问题。本研究中使用的细胞是市售的。
- 从冷冻管中解冻人二倍体IMR-90成纤维细胞（〜1 x 106 细胞），并将其接种在150mm板上的20mL DMEM中，并补充有10%胎牛血清（FBS）（表1）。
- 在生理氧气条件下（3%O2， 5%CO2， 37°C）生长细胞，并在10%含FBS的培养基中扩增培养物，直到建立足够的淬灭和衰老细胞重复（建议每种情况至少3-5次重复）。
注意：在生理（3%）氧气下培养细胞是原代人成纤维细胞的理想选择，但其他细胞类型的合适培养条件可能会有所不同，应根据具体情况确定。 - 通过将增殖细胞暴露于15灰色（Gy）的电离辐射（IR）来产生衰老细胞。
注意：辐射暴露的强度可能因细胞类型而异。虽然这里使用15 Gy，但10 Gy也是成纤维细胞常用的辐射剂量;其他细胞，如单核细胞，可能需要低至5 Gy的剂量。剂量通常通过权衡抗衰老诱导的可行性来经验确定。- 将细胞在含有10%FBS的培养基中以40%-60%汇合处暴露于IR中。
- 红外曝光后，换成含有10%FBS的新鲜培养基。
- 每 2 天更换一次培养基（20 mL，含 10% FBS），持续 8 天。
注意：细胞以较低的汇合度暴露于IR，因为IR处理的细胞在停止生长之前会在培养物中扩增。在这个实验中，细胞在衰老的建立过程中没有分裂细胞，虽然它们变得更加融合，但它们在收获时仍然显示出衰老细胞标志物。在成纤维细胞中，衰老表型在7-10天内发展。
- 通过将接种增殖细胞上的培养基更换为含有0.2%FBS（血清饥饿）的培养基来产生静止的对照细胞（表1）。
- 继续生长将用于含有10%FBS的培养基中的静止控制的细胞，直到衰老细胞暴露于IR后的第4天，必要时分裂。
- 在IR后的第4天，将静止细胞的培养基更换为含有0.2%FBS的20mL培养基（表1），并继续生长6天，每2天更换一次培养基。
注意：即使在含有0.2%FBS的培养基中，成纤维细胞也会继续生长，并且在收获结束时可能会出现汇合。根据经验，当静止细胞达到类似于衰老细胞培养物的汇合度时，旨在收集它们。
2. 脉冲 SILAC 细胞标记和裂解物收获
- 将衰老和静止细胞（12块板）上的培养基更换为SILAC Light（表1）并生长2天。
注意：这种标记有助于减少背景噪声，因为 13C和 15N的自然丰度较低。在试剂限制条件下可以跳过此步骤，但会导致对新蛋白质合成的轻微高估。 - 用 SILAC DMEM（表 1）替换培养基以进行代谢标记。
注意：SILAC DMEM培养基经过专门配制，含有精氨酸和赖氨酸的纯轻或重同位素，用于代谢标记。不得用子步骤2.2.1或2.2.2中的标准DMEM配方代替它们。- 对于三个衰老板和三个静态板，用30 mL SILAC Light替换培养基（表 1），并在不更换培养基的情况下生长3天。
- 对于至少三个衰老板和三个静态板，用 30 mL SILAC 重质试剂（表 1）替换培养基，并在不更换培养基的情况下生长 3 天。
注意：此时可以选择立即收获光标记的细胞，而不是将它们再标记3天。对于单个时间点，最好在与该协议中相同的时间段内标记重和轻标记的细胞，以最小化批次效应。
- 通过将5mL预热胰蛋白酶试剂添加到每个培养皿中并在37°C下孵育5分钟，将细胞从培养板中分离出来。
- 将分离的细胞重悬于5mL用于培养的相同培养基（SILAC轻质或SILAC重质）中，总体积为10mL。
- 收获细胞以提取裂解物和验证衰老标志物。
- 对于每个悬浮液，将0.6×106 个细胞等分试样到2mL含有0.2%FBS的培养基中，在6孔培养皿（两个培养皿，一个用于SILAC轻培养细胞和一个用于SILAC重培养细胞）中，并置于37°C下孵育过夜。
注意：这些板（子步骤2.5.1）将用于检测衰老相关的β半乳糖苷酶（SA-βGal）活性（步骤3.1）。 - 对于每个悬浮液，将1×106 的细胞等分试样放入微量离心管中，并在台式离心机中全速旋转1分钟。除去上清液并将沉淀重悬于1mL苯酚中;在此步骤中，RNA可以完全纯化，如苯酚供应商手册中所述，或在-80°C下长期储存。
注意：苯酚具有腐蚀性，应仅在戴手套和实验室外套的兜帽中处理。
注意：提取的RNA将用于检测编码SASP因子的mRNA，使用逆转录（RT），然后进行实时定量（q）PCR（RT-qPCR）分析（步骤3.2）。衰老诱导的另一个可靠测定是5-乙炔基二羟基尿苷（EdU）掺入的试验，这表明存在增殖细胞。没有增殖可用于确认静止和衰老。 - 将剩余的细胞转移到冰上，并在300× g 和4°C下旋转。
- 对于每个悬浮液，将0.6×106 个细胞等分试样到2mL含有0.2%FBS的培养基中，在6孔培养皿（两个培养皿，一个用于SILAC轻培养细胞和一个用于SILAC重培养细胞）中，并置于37°C下孵育过夜。
- 除去上清液，在1 mL冷PBS中洗涤细胞两次，以从培养基中除去胎牛血清中的培养基/胰蛋白酶和外源性蛋白质污染。
- 再次旋转细胞，除去上清液，然后继续裂解。
- 将细胞沉淀重悬于150μL新鲜制备的8M尿素50mM碳酸氢铵裂解缓冲液中（表1），并通过上下移液混合。
- 将裂解物在水超声仪中超声处理2.5分钟，在4°C下以中等功率开/关30秒。
- 将裂解物转移到预热的95°C热块中并使其变性4分钟。
- 旋转裂解物;裂解物现在可以储存在-80°C或立即用于定量。
- 在裂解缓冲液中为每个裂解液制作30μL1：10稀释液。
- 使用BCA测定试剂盒测量蛋白质浓度，使用在ddH2O稀释的1/10x裂解缓冲液中制备的标准曲线，裂解物现在可以无限期地储存在-80°C。
3. 通过衰老相关β-半乳糖苷酶（SA-βGal）活性和衰老相关mRNA的RT-qPCR分析来验证衰老
注意：这些步骤的起始材料是在步骤 2.5 中收集的
- 从在亚步骤2.5.1中设置的6孔板开始，按照制造商的方案使用衰老β半乳糖苷酶染色试剂盒分析细胞的SA-βGal活性。在启用颜色的情况下在明场下可视化染色，如前所述36。
注意：SA-βGal通过比较衰老与静止对照条件下阳性细胞（可见蓝色）的百分比来量化。至少70%的细胞应为SA-βGal阳性，以成功确认衰老。静态对照细胞的 SA-βGal 阳性率应小于 10%。 - 从苯酚悬浮液中提取RNA（亚步长2.5.2），并使用RT-qPCR分析编码SASAP因子（IL6，CXCL8，IL1B），细胞周期标志物（CDKN2A / p16，CDKN1A / p21）和其他衰老指标（LMNB1和PCNA丢失）水平升高。
注意：RNA是不稳定的，因此应使用无RNase的设备，新鲜手套和冰处理，除非方案中另有说明。- 从苯酚悬浮液开始，每1mL苯酚加入200μL氯仿，并在4°C下以12，000× g 旋转15分钟。
- 小心地除去水相并加入1：1体积的异丙醇，15μg糖原共沉淀剂，然后在4°C下孵育10分钟以沉淀RNA。
- 孵育后，通过在4°C下以12，000× g 离心20分钟沉淀RNA，然后在75%EtOH中洗涤等于1体积的苯酚。将RNA重悬于50μL无核酸酶蒸馏水中;RNA可以无限期地储存在-80°C。
- 在RNA样品中，加入38μL无核酸酶蒸馏水，10μL10x DNAse反应缓冲液和2μLDNase I，然后混合。
注意：生成子步骤 3.2.3 中所有试剂的通用混合物乘以用于处理的样品数量，以便与样品均匀分布是最佳做法。 - 将DNANase I处理的RNA样品在37°C下孵育30分钟。
- 使用1体积的苯酚/氯仿/异戊醇（25：24：1）混合物从样品中除去DNA酶，方法是在台式离心机中以最大速度涡旋和旋转5分钟;RNA将包含在水相中。
- 重复亚步骤3.2.2和3.2.3以沉淀RNA。重悬于20μL无核酸酶蒸馏水中;RNA可以无限期地储存在-80°C。
- 通过将0.5-1.0μg纯化的RNA与200 U逆转录酶，100 pMol随机引物和10mM dNTP混合物在1x反应缓冲液中与逆转录酶一起孵育，从纯化的RNA中产生cDNA;在25°C下孵育10分钟，然后在50°C下孵育30分钟，最后在85°C下灭活5分钟。
- 使用实时定量（q）PCR分析，从静态对照和衰老细胞的RT步骤（亚步3.2.3）分析cDNA，以评估已知增加的mRNA标记物的水平（CDKN2A / p16， CDKN1A / p21， IL1B， IL6和 CXCL8 mRNA）或降低（LMNB1 和 PCNA mRNA）随着衰老而降低，如其他地方所述。 ACTB mRNA编码管家蛋白β-肌动蛋白，通常是一种很好的mRNA，可以归一化输入材料中的差异。使用的引物见 表2。
注意：相对RT-qPCR分析取决于靶引物对和参考引物对之间具有相等结合效率的假设。这些假设应该针对新的引物集进行测试，详见其他37。此外，所比较的细胞类型之间的参考标记物应该是恒定的，并且先前已经确定了衰老细胞的几个附加选择38。
4. 溶液内胰蛋白酶消化
注意：从现在开始，使用质谱级缓冲液，溶剂和化学品以防止质谱分析过程中杂质的干扰至关重要。所有缓冲液应由适合液相色谱串联质谱分析的成分组成，包括水和乙腈。有关合适的化学品和溶剂的列表，请参阅 材料表 。
- 将每个蛋白质样品的50μg等分到新管中，并与裂解缓冲液等体积。
- 向每个样品中，将DTT加入到最终浓度为20 mM以减少二硫键。
- 将样品在37°C下振荡孵育30分钟，然后让样品在室温（RT，〜10分钟）下冷却。
- 将碘乙酰胺加入到40mM的终浓度中，以不可逆地烷基化在上一步中还原的巯基。将样品在室温下在黑暗中孵育30分钟。
- 用由50mM碳酸氢铵组成的缓冲液将每个样品稀释至1M以下尿素。通过在pH条上移液少量样品来检查pH值是否约为8。
- 向每个样品中加入1μg胰蛋白酶，以获得50μg起始蛋白，或者如果消化不同的蛋白质量，则按质量按质量以1：50的胰蛋白酶：蛋白质比。例如，将加入3μg胰蛋白酶以消化150μg蛋白质。
- 将样品在37°C下振荡孵育过夜，以将蛋白质消化成肽。
- 将甲酸加入每个样品的1%，按体积计，以淬灭蛋白质消化。
注意：实验可以在此处暂停。将样品在-80°C下冷冻，如有必要，稍后继续下一步。
5. 固相萃取 （SPE） 样品净化
注：此固相萃取方案需要固相萃取盒和真空歧管设置。在质谱分析之前，研究人员可以自行决定进行其他等效固相萃取（SPE）方案。
- 通过将固相萃取滤芯放在真空歧管上，对每个样品使用一个萃取滤芯，为SPE做准备。
注：请参阅制造商的指南，了解 SPE 协议中使用的吸附剂量。对于50μg肽样品，建议使用10mg吸附剂柱。 - 通过加入800μLSPE洗脱缓冲液（表1）来调节每个SPE滤芯，并使用真空抽吸将溶剂吸入滤芯。
- 重复步骤 5.2。
- 通过加入800μLSPE洗涤缓冲液（表1）平衡每个滤芯，并使用真空抽吸将缓冲液吸入滤芯。
- 再重复步骤 5.4 两次，共重复三次。
- 将肽样品装入SPE滤芯，并使用真空抽吸将样品通过试样。
注意：此时，肽与滤芯内的吸附剂结合。 - 用 SPE 洗涤缓冲液清洗每个滤芯，然后使用真空抽吸将缓冲液吸入滤芯。
- 再重复步骤5.7两次，共洗涤三次。
- 在洗脱步骤之前，将收集管布置在每个滤芯下方的真空歧管内，小心地确保收集管和滤芯之间的对准。
- 要洗脱肽，向每个滤芯中加入800μLSPE洗脱缓冲液，并将肽洗脱到真空抽吸的收集管中。
- 用400μLSPE洗脱缓冲液重复步骤5.10。
- 从真空歧管中取出肽样品，并在真空浓缩器中完全干燥（干燥大约需要3小时）。
注意：实验可以在此处暂停。在-80°C下冷冻样品，如有必要，可在以后继续。
6. 数据依赖性采集（DDA）质谱分析
- 将肽样品以400ng / μL的浓度重悬于由水中0.2%甲酸组成的缓冲液中。
- 为了帮助肽的再溶解，涡旋样品5分钟。然后，在水浴超声仪中超声处理样品5分钟。
- 通过在4°C下以15，000× g 离心样品15分钟来沉淀任何不溶性材料。 将肽上清液转移到MS小瓶中。
- 按体积将所选的索引保留时间（iRT）肽标准品以1：30 iRT：样品的浓度添加到每个样品中。
- 使用液相色谱串联质谱（LC-MS / MS）分析提交样品进行蛋白质组学分析。
- 使用质谱机构推荐用于非靶向分析的LC-MS / MS设置。分析的示例设置如图 3所示，配置为在Orbitrap质谱仪上进行分析，该质谱仪以纳米流动模式耦合到纳米液相色谱系统。下面是一个示例协议。
- 将每个样品的1μg（5μL）上加载到捕集柱（1cm长x 100μm直径）上，并以10μL / min的流速用上样溶剂（表1）洗涤5分钟。
- 将样品加载到分析柱（50 cm 长 x 100 μm 直径）上，流速为 400 nL/min。
- 用有机溶剂（0.2%甲酸和99.8%乙腈）和无机溶剂（0.2%甲酸在99.8%水中）在90分钟的线性梯度上洗脱肽，范围为5%至35%有机溶剂。
- 在数据依赖模式下获取质谱数据，连续循环MS1调查扫描（60，000分辨率，3e6 AGC靶标，100 ms最大累积时间和400-1，600 m / z质量范围），然后进行20次数据依赖性MS2扫描（15，000分辨率，1e5 AGC靶标，25 ms最大注射时间和1.6 m / z宽度隔离窗口），并进行HCD碎片（归一化碰撞能量为27%）。
- 在MS采集所有样品后，将原始质谱文件导入质谱蛋白质组学分析软件工具，用于鉴定和定量肽峰区域。
注意：为了鉴定本实验中的肽和蛋白质，Mascot数据库搜索工具与审查的UniProt人蛋白质组序列数据库（蛋白质组ID：UP000005640）一起使用。在Mascot中指定了以下搜索参数：- 定量：SILAC K+8 R+10 [MD] 酶：胰蛋白酶/p 固定修饰：氨基甲酸甲酯（C）
- 可变修饰： 乙酰（蛋白质 N 项）， Gln->热糖胶 （N 项 Q）， 氧化 （M）， 标签：13C（6）15N（2） （K）， 标签：13C（6）15N（4） （R）
- 肽质量耐受性： 10 ppm
- 碎片质量公差：0.08 Da
- 最大漏数： 2
- 所有未指定的参数均为默认值
- 在蛋白质组定量软件工具中定量重肽和轻肽的肽峰区域。为了量化本实验中的峰面积，使用了免费开源的Skyline软件平台39，40。导出重肽和轻肽峰区，用于估计蛋白质半衰期。
7. 蛋白质半衰期的计算
- 打开 SILAC 分析工作手册（表 3）到第一个名为 1） 原始数据 ，并将 UniProt ID、基因名称、重峰区域和轻峰区域粘贴到指示的列中（SH = 衰老-重，SL = 衰老-轻，CH = 对照（静止）-重，CL = 控制（静止）-轻）。
- 打开2-4张，确保UniProt ID和Gene柱与分析中鉴定的蛋白质数量相匹配（这些实验鉴定了841种蛋白质）。其余列在被拖动以覆盖已识别的蛋白质后将自动填充数据。
- 打开名为 4）分析 的第四个工作表，并删除列G和H指示样本超出范围的行;将读取的行保持在范围内。第五张工作表中的火山图将自动填充。
Representative Results
该协议描述了一种使用pSILAC和最小时间点全局比较衰老和非分裂，静止对照细胞之间的蛋白质半衰期的方法。该协议详细介绍了培养物中衰老和静止细胞的生成，在3天内用精氨酸和赖氨酸的稳定同位素对细胞进行代谢标记，通过质谱法量化重肽和轻肽同位素的相对丰度，以及使用电子表格公式简单易用地计算蛋白质半衰期（图1）。这种方法非常灵活，可以适应多种细胞类型和条件。
作为该方案生成衰老细胞的一部分，使用了两种衰老验证方法：通过显微镜观察的SA-βGal阳性细胞和使用RT-qPCR分析定量的衰老标志物水平的增加。衰老标志物的测量应该在静止细胞和衰老细胞之间产生明确的区别，以便将两个细胞群的比较视为有效。对于SA-βGal活性，衰老细胞应显示为蓝色，而静止的对照细胞没有颜色或颜色很少（图2A）。该测定可以通过将阳性的蓝色染色细胞计数为细胞总数的百分比，然后比较静止对照和衰老细胞之间的阳性率百分比来量化。重要的是，该协议应同时执行，以便比较两种细胞状态;SA-βGal活性依赖于染色溶液的pH值，因此结果在两次测定之间可能会有很大差异，应被视为定性测定。
对衰老标志物的RT-qPCR分析将显示大多数衰老模型中编码SASP因子（IL6，CXCL8，IL1B）和细胞周期抑制剂（CDKN2A / p16，CDKN1A / p21）的mRNA水平很高。尽管根据细胞类型，培养条件和衰老诱导剂41，42预计会出现一些变化，但与静止对照细胞相比，大多数衰老细胞显示的 IL6， CXCL8和 CDKN1A / p21 mRNA水平高出五倍以上;相反，与静止细胞相比，编码增殖标志物的 LMNB1 和 PCNA mRNA的水平在衰老细胞中应该很低或不存在（图2B）。综上所述，相当大比例的SA-βGal阳性率和一组衰老相关mRNA标记物的预期表达足以证实实验中衰老的诱导。
用于质谱分析的蛋白质样品处理包括溶液内消化（2天）和固相萃取（4-6小时）。为了进行非靶向蛋白质组学分析，使用数据依赖性采集（DDA）将所得肽提交LC-MS / MS分析。在Orbitrap仪器上，可以在质谱仪器软件方法编辑器中指定DDA方法。本研究中使用的质谱仪设置如图 3A所示。液相色谱设置也可以在方法编辑器中指定。对于这项研究，使用了90分钟的线性梯度，有机相（乙腈）增加（图3B）。成功采集后，在方法的线性梯度部分，总离子电流（TIC）应包含强信号（图3C）。该协议描述了Orbitrap仪器上的示例协议，但是蛋白质半衰期的计算可以对从以DDA模式收集的任何质谱仪获得的数据进行，该质谱仪可用于几种类型的仪器（例如Orbitraps和飞行时间仪器）和供应商。采集设置对于所用仪器的类型和配置是唯一的，建议使用质谱仪设施建议的设置。该方法也与非DDA方法（SRM，PRM，DIA）兼容，只要可以从原始数据文件中提取重峰和轻峰的定量色谱峰面积并输入到电子表格公式中即可。
使用许多可用的蛋白质组学数据库搜索工具之一搜索原始质谱文件，以鉴定肽和蛋白质。例如，这项研究利用了Mascot43 搜索引擎。为了获得用于定量重肽和轻肽的色谱峰区域，数据库搜索结果被导入到能够色谱峰区域（如Skyline39，40）的蛋白质组学软件中。检查提取的肽离子色谱图（图4）将揭示重肽和轻肽信号的相对比例。在衰老细胞中，重肽信号相对于轻肽信号的比例较低，表明蛋白质周转速率较慢（图4A），而相对于光的重肽信号较高表明蛋白质周转率更快（图4B）。未标记的样品应显示很少或没有重肽信号。未标记样品中的任何明显重肽信号都被视为背景噪声，并将在最终计算过程中被减去。必须导出所有处理和标记条件下轻肽和重肽的色谱峰区域的定量，以便随后计算蛋白质周转率和进行统计分析。
通过使用单时间点分析，蛋白质半衰期的定量操作简单，并且可以在电子表格中方便地完成。在 表3中，计算了从质谱分析中鉴定的695种蛋白质的半衰期。从样品中每种蛋白质的蛋白质水平重质和轻质同位素丰度开始（ 1）原始数据表 的输入），然后在标题为2）的工作表上自动计算百分比重同位素（称为比率，R ）比率H|H + L.在此步骤中，通过从未标记的样品中减去R来归一化来自重标记样品的R，以产生静态和衰老三重的最终R。由于未标记的样品不应具有任何外源添加的重同位素，因此它们用于消除背景信号。从R开始，k度 （周转率）使用以下公式计算：
使用以下公式确定静态对照和衰老对照中每种蛋白质的半衰期（H，以天为单位）（标题为3）半衰期（天））：
然后将这些半衰期在静态和衰老三份中取平均值，以生成每种蛋白质的静态和衰老平均半衰期以及p值。然后，对计算的半衰期进行过滤以查找负值，当来自轻标记单元格（背景）的重信号大于来自重标记单元格的重信号时，就会发生这种情况。这种过滤结果从841个蛋白质中获得了707个蛋白质，这些蛋白质具有有效的半衰期，用于这里介绍的结果。
然后将半衰期报告为衰老与静止对照细胞（log2FC ）的对数2比率，并绘制在火山图中（图5）。例如，通过查看 5）分析表，可以看出凝血II凝血酶受体（F2R）蛋白在静止细胞中的半衰期为0.51天（B列），在衰老细胞中的半衰期为1.07天（C列），其产生对数2FC约为1.06（D列），p值为0.001。
图 1：衰老和静止对照细胞的 pSILAC 工作流程图。 人IMR-90成纤维细胞用于制备静态（低血清）或衰老（IR）细胞培养物，以比较蛋白质半衰期。然后用SILAC轻质或SILAC重培养基用同位素精氨酸和赖氨酸标记细胞3天。从细胞中提取裂解物，消化，脱盐，并使用质谱分析。重肽同位素峰和轻肽同位素峰分别对应于新合成的和预先存在的肽。半衰期是使用指数衰变方程计算的。 请点击此处查看此图的大图。
图2：使用SA-βGal和RT-qPCR分析验证衰老表型。 （A）在收获时将衰老和静止细胞重新接种到6孔板中，并使用SA-βGal染色试剂盒染色SA-βGal。细胞体内的蓝色对衰老呈阳性。图像在明场中拍摄，颜色为10倍放大倍率，大小标记为红色。（B）RT-qPCR分析比较来自不相关实验的衰老细胞（红色）和循环细胞（灰色）。 CDKN1A/p21、 CXCL8 和 IL6 mRNA 水平的增加表明衰老， LMNB1 mRNA 水平的降低也表明衰老。 请点击此处查看此图的大图。
图 3：在 Q-Exactive HF orbitrap 质谱仪上进行 pSILAC 培养物的数据依赖性采集 （DDA） 扫描和液相色谱梯度的代表性方法。（A） 仪器软件中推荐的仪器设置，用于对 pSILAC 实验中的全细胞裂解物进行数据依赖性分析。（B）实施例液相色谱法的流量梯度设置。在90分钟的线性梯度范围内洗脱肽，范围从5%到35%缓冲液B（0.2%甲酸和99.8%乙腈），然后用80%缓冲液B洗涤10分钟，用5%缓冲液B平衡25分钟。请点击此处查看此图的大图。
图4：在衰老期间具有改变周转率的肽的代表性提取的离子色谱图。 （A）来自衰老和非衰老细胞中蛋白质DnaJ同源物B成员11（DNAJB11）的肽FQMTQEVVCDECPNVK++的色谱峰区域。在SILAC 3天后，与静止（非衰老）细胞相比，衰老细胞在该肽中掺入的重同位素较少，这表现为含重同位素肽（蓝色）相对于轻肽（红色）的峰面积减少，表明该肽降低了衰老细胞的周转。（B）来自蛋白质剪接因子3a亚基1（SF3A1）的肽VQAQVIQETIVPK++在衰老和非衰老细胞中的色谱峰区域。在SILAC 3天后，与静止（非衰老）细胞相比，衰老细胞将更高比例的重同位素掺入该肽中，其表现为含有重同位素肽（蓝色）的峰面积相对于轻肽（红色）的减少，表明该肽在衰老细胞中的周转增加。未标记（第0天）条件显示两种肽均未掺入重同位素，正如预期的那样。 请点击此处查看此图的大图。
图5：通过psILAC标记确定的衰老细胞和静止细胞中蛋白质半衰期的比较。 （A）火山图显示695种已鉴定蛋白质中每种蛋白质的衰老/对照（静止）的log2 比率;在该实验中，轻质和重度标记培养基不含葡萄糖和酚红。（B）表格显示了静态细胞中半衰期增加或减少最多的10种蛋白质与衰老细胞（分别为左和右）。 请点击此处查看此图的大图。
表 1：此协议中使用的介质和缓冲区。请按此下载此表格。
表2：该方案中使用的RT-qPCR引物。请按此下载此表格。
表 3：用于计算蛋白质半衰期、折叠变化和 t 检验的 SILAC 分析工作簿。请按此下载此表格。
Discussion
pSILAC是一种强大的技术，可以对多种细胞条件下的蛋白质周转率进行全局定量。本文详细介绍了使用pSILAC比较衰老细胞和静止细胞之间的全局蛋白质半衰期，包括制备衰老和静止细胞的说明，SILAC标记和收获，以及最终使用DDA质谱进行分析的说明。此外，描述了一种两步测试，用于使用SA-βGal和RT-qPCR分析编码衰老相关蛋白的一组mRNA来验证衰老表型。除了使用所描述的两种方法验证衰老之外，还可以在质谱分析之后通过寻找蛋白质组学水平上衰老细胞之间衰老和静止细胞之间已知衰老标志物的变化来执行衰老的第三次验证。预计会升高的衰老相关蛋白包括p16，p21和BCL2等，在其他地方描述44，45。在上述方案中，电离辐射用于诱导静止细胞的衰老和血清饥饿。对于衰老的诱导，有多种选择，其中存在很大的异质性41，42，46。目前，没有被认为是“最生理”的衰老方法，因此衰老诱导剂的选择很大程度上是基于实验的背景。然而，以陈述衰老的一般现象为目标的实验建议使用至少两种不同的衰老诱导剂。讨论衰老范式的范围超出了本文的范围，但一些诱导衰老的常用方法包括触发DNA损伤（IR，阿霉素，复制性耗尽），表达致癌蛋白（HRAS，BRAF）和破坏线粒体功能2。
除了衰老诱导剂的选择外，对照细胞的选择也是一个同样重要的考虑因素。根据定义，衰老细胞处于无限期的生长停滞状态，因此通常选择与其他生长停滞的细胞进行比较。对于pSILAC，细胞周期停滞的细胞通常是优选的，因为它们不复制，因此更容易用于蛋白质半衰期计算47。然而，由于培养的细胞通常会保留一些分裂细胞，因此用于诱导细胞周期停滞的方法产生尽可能均匀的反应以最小化仍在增殖的细胞的误差非常重要。为了使用pSILAC计算循环细胞的蛋白质降解速率，需要额外的计算来补偿蛋白质被稀释到子细胞中的速率27。然而，静止生长停滞本身并非没有并发症。细胞周期停滞有两种一般方法：血清剥夺和接触抑制48。并非所有细胞都可以通过接触抑制使静止，尽管一些成纤维细胞已被证明在培养几天后表现出静止49。这种方法使用血清剥夺，因为它更常用于衰老细胞的比较，尽管它要求衰老细胞同样被血清剥夺以进行准确的比较。血清激活mTOR复合物，因此血清剥夺除了细胞周期停滞50之外还对细胞具有几种下游影响。值得注意的是，衰老细胞已被证明在血清剥夺或mTOR抑制51，52时显示SASP降低。
pSILAC 中要考虑的另一个要点是要测试多少个时间点。该方案在单个时间点（3天的轻或重标记）收集细胞，这大大简化了结果分析。时间点的选择应以实验目的为依据。对于全球分析，预计3天捕获大部分蛋白质，尽管在这个时间点无法测量3天内完全周转的短寿命蛋白质的半衰期（所有光信号都丢失）。相反，在3天内周转率非常低的长寿命蛋白质也难以量化，并且通常看起来具有非常大的半衰期（以周为单位），这通常只是非常小的重信号积累的结果。由于重肽和轻肽信号的比例与新合成蛋白质在较短和较长的时间点的百分比的非线性关系，通过添加额外的标记时间点可以改善半衰期的定量。对于两个细胞状态之间的相对比较，如在该协议中，近似的半衰期可能就足够了，但可以使用额外的时间点来提高定量准确性。
该协议描述了如何对蛋白质周转进行基于DDA的非靶向分析。然而，蛋白质周转计算通常可以应用于任何能够推导出重肽和轻肽对相对丰度的采集方案。例如，基于MS2的方法如独立于数据的采集（DIA/SWATH）也可以应用于成功计算53的周转率。此外，除本协议中描述的仪器和软件管道外，还可用于执行DDA分析，蛋白质鉴定和蛋白质定量。当使用Skyline等蛋白质定量软件平台提取肽峰区域时，建议在文档工作区中手动检查提取的离子色谱图，识别错误集成的峰和非定量峰，并相应地整理文档。在线上提供了大量有关Skyline（skyline.ms）的教程。
pSILAC代表了培养细胞中蛋白质半衰期全局定量的最理想方法之一，因为它具有卓越的多重检测（蛋白质组覆盖率）和通量。虽然pSILAC不提供直接的合成或降解速率，但由于轻信号和重信号的变化是由于因素的汇合，因此pSILAC对于条件和不同细胞类型之间的比较非常有用。低通量方法通常分为两种类型：1）用环己酰亚胺处理细胞以阻断蛋白质合成并在添加后按时间间隔收获以监测衰变，或2）用蛋白质衰变抑制剂处理细胞并在添加后每隔一段时间收获以监测蛋白质的积累，从而推断蛋白质衰变速率。这两种方法的局限性在于，这种治疗将不可避免地引起细胞生理学的实质性变化。相比之下，pSILAC不需要实质性干预，理论上对细胞生理学没有可检测的影响，因为同位素氨基酸与非同位素氨基酸只有一个中子的差异。因此，这里描述的用于pSILAC的方法代表了一种简单的方案，用于全局测量非分裂细胞中最具生理性的蛋白质半衰期。
蛋白质周转的改变与衰老，年龄相关疾病，神经变性和长寿有密切关系54，55。该协议描述了一种通过使用细胞培养物中氨基酸的稳定同位素标记来测量衰老细胞中蛋白质周转率来询问这些关系的方法。然而，存在许多类似的方法，可以在整个生物体（如小鼠） 体内 衰老和神经变性的背景下进行研究。事实上，这些研究强调了在与年龄有关的疾病背景下测量蛋白质周转率的重要性56，57，58，59。
在这项研究中，核糖体蛋白和存在于内质网中的蛋白质分别是衰老细胞中半衰期降低和增加的两类蛋白质。虽然需要进一步分析稳态水平才能得出明确的结论，但这些结果进一步表明，衰老细胞可能通过降低核糖体蛋白的半衰期来独特地调节翻译。展望未来，应用稳定同位素标记方法来研究小鼠模型中细胞衰老与 体内 神经变性之间的关系，将是该协议所描述的同位素标记方法的有希望的扩展。
Disclosures
作者没有披露。
Acknowledgments
这项工作得到了美国国立卫生研究院（NIH）和国家老龄化研究所（NIA）校内研究计划（IRP）的支持。NB得到了长寿动力补助金和膳食补充剂办公室（ODS）学者计划的支持。 图 1 是使用 BioRender.com 创建的。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Acetonitrile (LC-MS grade) | Grainger | AH015 | |
| Ammonium Bicarbonate | Millipore-Sigma | 9830 | |
| Antibiotic-Antimycotic (100x) | ThermoFisher | 15240062 | |
| BCA Assay Kit | ThermoFisher | 23227 | |
| Dithiothreotol (DTT) | Sigma | D9779 | |
| DMEM, high glucose, HEPES | ThermoFisher | 12430112 | |
| dNTP Mix | ThermoFisher | R0191 | |
| Fetal Bovine Serum, certified, heat inactivated | ThermoFisher | 10082147 | |
| Formic Acid | Sigma | 27001 | |
| Gammacel 40 Exactor | Best Theratronics | Cesium Irradiator for cells | |
| GlycoBlue | ThermoFisher | AM2238 | |
| Iodoacetamide (IAA) | Sigma | I1149 | Light sensitive |
| IMR-90 primary lung fibroblasts | ATCC | CCL-186 | |
| iRT Kit (indexed retention time) | Biognosys | Ki-3002-2 | Indexed Retention Time Peptide Standards |
| Isopropanol | ThermoFisher | 423835000 | |
| Mascot | Matrix Science | Mascot Daemon 2.8 | Proteomic database searching software |
| Maxima Reverse Transcritase (200 U/µL) | ThermoFisher | EP0742 | |
| MEM Non-Essential Amino Acids Solution (100x) | ThermoFisher | 11140050 | |
| Nano LC System | ThermoFisher | ULTIM3000RSLCNANO | |
| Oasis HLB Solid Phase Extraction Cartirdges | Waters | 186000383 | |
| Orbitrap Mass Spectrometer | ThermoFisher | Q Exactive HF Orbitrap | |
| Phenol/Chloroform/Isoamyl alcohol (25:24:1), 100 mM EDTA, pH 8.0 | ThermoFisher | 327110025 | |
| Phosphate Buffered Saline (PBS) | ThermoFisher | 10010023 | |
| Pierce SILAC Protein Quantitation Kit (Trypsin) -DMEM | ThermoFisher | A33972 | |
| QuantStudio 6 Real-Time PCR System | ThermoFisher | ||
| Random Hexamer Primer | ThermoFisher | SO142 | |
| Senescence β-Galactosidase Staining Kit | Cell Signaling | 9860 | |
| Skyline | University of Washington | Skyline-Daily v21.2.1.424 | Free and open source qantiative proteomic software. Available on www.skyline.ms |
| Sonicator waterbath | Branson | CPX-952-516R | |
| TRIzol Reagent | ThermoFisher | 15596018 | Referred to as phenol in text; hazardous |
| TRYPle Express | ThermoFisher | 12605010 | |
| Trypsin (sequencing grade) | Promega | V5113 | |
| TURBO Dnase (2U/ uL) | ThermoFisher | AM2238 | |
| Urea | ThermoFisher | 29700 | |
| Water (LC-MS grade) | Grainger | AH365 |
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