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Geração de culturas de interface ar-líquido de células epiteliais das vias aéreas a partir de células-tronco pluripotentes humanas

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DOI:

10.3791/63882

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14 de junho de 2022

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Pulmonary Center, Boston University School of Medicine, 2Center for Regenerative Medicine, Boston University and Boston Medical Center, 3Center for Stem Cell and Regenerative Medicine, Brown Foundation Institute of Molecular Medicine, University of Texas Health Science Center

Neste artigo

Resumo

Os recentes avanços nos protocolos de diferenciação de células-tronco pluripotentes induzidos pelo homem permitem a derivação stepwise de tipos celulares específicos de órgãos. Aqui, fornecemos etapas detalhadas para a manutenção e expansão das células basais derivadas das vias aéreas derivadas do iPSC e sua diferenciação em um epitélio mucociliary em culturas de interface ar-líquido.

Resumo

Doenças das vias aéreas condutoras, como asma, fibrose cística (CF), diskinesia ciliar primária (PCD) e infecções respiratórias virais são as principais causas de morbidade e mortalidade em todo o mundo. Plataformas in vitro usando células epiteliais brônquias humanas (HBECs) têm sido fundamentais para a nossa compreensão do epitélio das vias aéreas em saúde e doenças. O acesso a HBECs de indivíduos com doenças genéticas raras ou mutações raras é um gargalo na pesquisa pulmonar.

As células-tronco pluripotentes induzidas (iPSCs) são prontamente geradas pela "reprogramação" de células somáticas e retêm o histórico genético único do doador individual. Os avanços recentes permitem a diferenciação direcionada dos iPSCs às células progenitoras epiteliais pulmonares, células alveolares tipo 2, bem como as células do epitélio das vias aéreas condutoras através de células basais, as principais células-tronco das vias aéreas.

Aqui descrevemos um protocolo para a manutenção e expansão das células basais das vias aéreas derivadas do iPSC (iBCs do futuro), bem como sua diferenciação trilineagem nas culturas de interface ar-líquido (ALI). os iBCs são mantidos e expandidos como esferas epiteliais suspensas em gotículas de matriz extracelular cultivada em um meio de célula basal primária complementada com inibidores de vias de sinalização TGF-ß e BMP. IBCs dentro dessas esferas epiteliais expressam os principais marcadores basais TP63 e NGFR, podem ser purificados por fluorescência ativada de classificação celular (FACS), e quando banhados em membranas porosas em condições de cultura ALI padrão, diferenciam-se em um epitélio funcional das vias aéreas. As culturas ALI derivadas de doadores saudáveis são compostas por células basais, secretas e multiciliadas e demonstram integridade da barreira epitelial, cília motile e secreção de muco. Culturas derivadas de indivíduos com CF ou PCD recapitulam o transporte disfuncional de cloreto mediado por CFTR ou cília immotile, os respectivos defeitos epiteliais causadores da doença.

Aqui, apresentamos um protocolo para a geração de células humanas que podem ser aplicadas para modelagem e compreensão de doenças das vias aéreas.

Introdução

As doenças pulmonares crônicas são responsáveis por uma grande carga de morbidade e mortalidade em todo o mundo1. Condições que afetam as vias aéreas condutoras, como asma, fibrose cística (CF), dyskinesia ciliar primária (PCD) e infecções virais representam doenças comuns e mais raras, adquiridas e genéticas, que contribuem para essa carga mundial. As principais funções das vias aéreas condutoras são: 1) atuar como um canal para o fluxo laminar de ar, e 2) fornecer liberação mucociliaria de patógenos e detritos. Células secretas, multiciliárias e basais representam os principais tipos de células epiteliais das vias aéreas condutoras. Tipos de células epiteliais mais raras incluem ionócitos, células tufas e células neuroendócrinas, e foram revisados em outros lugares2.

Em linhas gerais, uma grande barreira para a compreensão dos mecanismos de doença e o avanço das abordagens terapêuticas tem sido a falta consistente de tecido primário humano para o uso em modelos pré-clínicos. Os HBECs são geralmente considerados o modelo in vitro padrão-ouro da biologia epitelial das vias aéreas humanas e desempenharam papéis-chave na pesquisa cf em particular3. No entanto, eles são tipicamente isolados ou de biópsias broncoscópicas, do tecido pulmonar após a cirurgia, ou de pulmões rejeitados para fins de transplante. O acesso a HBECs de indivíduos com doenças genéticas, incluindo as prioridades de pesquisa de CF e PCD, é pouco frequente e imprevisível. Superar esse gargalo para células epiteliais derivadas das vias aéreas derivadas do paciente é necessário. Os iPSCs são prontamente gerados a partir de qualquer indivíduo, eles mantêm o histórico genético único do doador, e têm uma notável capacidade de proliferar e sobreviver a longo prazo em condições de cultura celular 4,5,6. Ao recapitular as principais etapas embriológicas, os iPSCs passam por uma "diferenciação direcionada" em tipos celulares específicos de órgãos. Nós e outros desenvolvemos protocolos para gerar progenitores pulmonares derivados do iPSC, células alveolares tipo 2 7,8 e as células das vias aéreas condutoras, incluindo células basais das vias aéreas 9,10,11,12.

A célula basal das vias aéreas é a célula-tronco das vias aéreascondutoras 13. Em trabalhos publicados anteriormente, nosso grupo gerou células epiteliais derivadas das vias aéreas derivadas do iPSC, incluindo um subconjunto (iBCs) que expressa marcadores de células basais canônicas, incluindo TP63, KRT5 e NGFR. Seguindo pistas da biologia celular basal adulta, a inibição de vias SMAD duplas (TGF-β e BMP) leva à regulação dos NGFR+ iBCs11,14. Os iBCs NGFR+ são resuspengiados como células únicas em gotículas de matriz extracelular e cultivadas em um meio de célula basal. Eles se auto-renovam para manter uma população iBC e formar esferoides epiteliais; no entanto, uma proporção também se diferencia em células secretas nesse formato (conhecida como cultura 3D). No protocolo a seguir, detalhamos as etapas para manter e expandir esses iBCs na cultura 3D, bem como as etapas necessárias para gerar uma cultura ali mucociliary funcional.

As etapas iniciais deste protocolo de diferenciação foram publicadas anteriormente e não serão analisadas aqui11,12. Este manuscrito centra-se na expansão e purificação dos iBCs e sua subsequente diferenciação em células funcionais secretary e multiciliadas na cultura ALI.

Protocolo

Cada uma das etapas a seguir deve ser realizada utilizando técnica estéril em uma capa de fluxo laminar nível 2 de biossegurança. Todas as mídias devem ser aquecidas à temperatura ambiente (22 °C) antes de serem adicionadas às células, exceto quando especificamente mencionadas de outra forma. Cada passo de centrifugação deve ser realizado à temperatura ambiente (aproximadamente 22 °C). A Figura 1 descreve os esquemas do protocolo.

1. Preparação de mídia necessária

NOTA: Consulte o arquivo suplementar 1 para obter detalhes.

  1. Meio de célula basal
    1. Prepare o meio base de acordo com as instruções do fabricante.
    2. A cada 50 mL do meio base, adicione 5 μL de A83-01 (10 mM), 5 μL de DMH1 (10 mM), 50 μL de Y-27632 (10mM) e 100 μL de Primocin (50 mg/mL). Daqui em diante, esta mídia é chamada de meio de célula basal.
    3. Armazene a 4 °C por até 1 mês.
  2. Meio de Diferenciação ALI
    1. Prepare o meio de acordo com as instruções do fabricante.
    2. A cada 50 mL de ALI Diferenciação Média, adicione 100 μL de Primocina (50 mg/mL).
    3. Armazene protegido contra luz a 4 °C por até 1 mês.
  3. Classificar buffer
    1. Para cada 50 mL de Buffer de Tipo, combinar 47,5 mL da Solução de Sal Balanceado da Hanks, 1 mL de FBS, 200 μL de EDTA (500 mM), 1,25 mL de HePES Buffer (1 M), 50 μL de Y-27632 (10 mM) e 100 μL de Primocin (50 mg/mL).
    2. O filtro esterilizar usando um tamanho de poro de 0,4 μm.
    3. Armazene a 4 °C por até 1 mês.
  4. Meio de Criopreservação
    1. Para cada 50 mL de Médium criopreservador, combine 45 mL de Meio Celular Basal e 5 mL de sulfóxido de dimetil (DMSO).
    2. O filtro esterilizar usando um tamanho de poro de 0,4 μm.
    3. Armazene a 4 °C por até 1 mês.

2. Descongelamento de iBCs criopreservados

  1. Degelo (no gelo) um volume suficiente de fator de crescimento 3D reduziu a matriz extracelular (matriz 3D posterior). Mantenha no gelo até estar pronto para uso.
    NOTA: Ao descongelar um frasco (contendo 250.000 células), descongele 100-200 μL de matriz 3D.
  2. Descongele um frasco de suspensões de células únicas previamente criopreservadas de iBCs incubando em uma água de 37 °C ou banho de contas apenas até que não haja mídia congelada visível (1-2 min).
  3. Usando uma pipeta sorológica de 5 mL, adicione suspensão celular a um tubo cônico de 15 mL.
  4. Adicione 6-10 mL de DMEM/F12 dropwise à suspensão da célula, misture suavemente e centrífuga a 300 x g por 5 min para pelotar as células.
  5. Aspire o supernascer e resuspenja a pelota celular em 1 mL de Meio Celular Basal com uma micropipette P1000. Remova uma alíquota de 10 μL e realize uma contagem de células.
  6. Centrifugar as células a 300 x g por 5 min. Aspire o supernascer e resuspenque as células a uma densidade de 4.000 células/μL em matriz 3D previamente descongelada com uma micropipette P1000.
    NOTA: É fundamental evitar adicionar bolhas à matriz 3D. Pipeta a matriz devagar e com cuidado.
  7. Com uma micropipette P200, adicione uma gota (25 ou 50 μL) à base de cada poço de uma placa tratada de cultura de tecido de 12 poços. Se começar com 250.000 células congeladas, o número esperado de gotículas nesta etapa está entre 3-4 (gotículas de 25 μL), dependendo da viabilidade celular.
  8. Incubar a placa a 37 °C por aproximadamente 15 min e, em seguida, adicione o suficiente de Meio celular basal a cada poço para submergir totalmente a gota (1,5 mL para 50 μL; 1 mL para 25 μL), usando uma pipeta sorológica de 5 mL. Devolva a placa a uma incubadora umidificada.
  9. Células de alimentação a cada 2 dias usando o meio celular basal fresco. Adicione meio fresco ao lado do poço com pipeta sorológica de 5 mL, tomando cuidado para não perturbar a gota das células.
    NOTA: A densidade de células emplacaram nesta fase é 10 vezes maior do que a passagem de rotina de iBCs na seção 3.

3. Dissociação de esferoides e expansão de iBCs na cultura 3D

  1. Degelo (no gelo) um volume suficiente de matriz 3D. Mantenha no gelo até estar pronto para uso.
    NOTA: O volume da matriz 3D necessária varia de quantas células o usuário precisará.
  2. Aproximadamente 5-7 dias depois, aspire o meio de cada poço e com uma micropipette P1000, adicione 1 mL de Dispase II (1 U/mL) diretamente sobre os esferoides para dissociar da gotícula da matriz.
    1. Coloque a placa na incubadora de 37 °C por 10-15 min.
  3. Usando uma micropipette P1000, pipeta o Dispase para cima e para baixo 1-2 vezes, quebrando grandes aglomerados de matriz 3D. Retorne a placa a 37 °C por mais 30-40 min, permitindo que a matriz se dissolva completamente.
    1. Quando a gotícula da matriz 3D não estiver mais visível sob o microscópio de luz, adicione os esferoides livremente flutuantes a um cônico de 15 mL usando uma ponta de pipeta sorológica de 5 mL. Adicione DMEM/F12 para um volume final de 10 mL por cônica e centrífuga a 200 x g por 3 min para pelotar os esferoides.
  4. Aspire o supernasce e adicione 1 mL de trippsina de 0,05% (37 °C) para cada gotícula inicial dissociada (por exemplo, se começar com quatro gotículas, adicione 4 mL trypsin ao frasco cônico).
    1. Incubar a 37 °C, triturando com frequência (a cada 2-3 min).
    2. Avalie com o microscópio de luz a cada poucos minutos. Uma vez que a maioria (>90%) dos esferoides tenham sido dissociados a células únicas, adicione 10% de Soro Bovino Fetal (em DMEM/F12) a uma proporção de volume de 1:1 para a trippsina.
  5. Filtre as células através de um coador de células de 40 μm e centrífuga a 300 x g por 5 min.
  6. Realize uma contagem de células e resuspense as células a uma densidade de 400 células/μL de matriz 3D descongelada. Evite introduzir bolhas de ar. Resuspenda quantas gotículas necessários para a aplicação a jusante. Repita o passo 2.6-2.9 para cada poço.

4. Avaliação e purificação de iBCs NGFR+

  1. Após 10-14 dias da passagem mais recente, dissociar os esferoides a uma única suspensão celular como nas etapas 3.2-3.5 e realizar uma contagem celular.
    NOTA: Diferentes linhas iPSC se comportam de forma diferente; portanto, a faixa de 10-14 dias pode variar para diferentes iBCs. Consulte a Figura 2 para aparições típicas de iBCs 3D após 1, 4, 8 e 14 dias, quando são adequados para a classificação celular NGFR+. A classificação mais cedo do que o recomendado (por exemplo, dia 8 como na Figura 2C), resulta em um número de células mais baixa com expressão de NGFR menos frequente. A classificação mais tarde do que o recomendado (por exemplo, maior que 14 dias após a passagem mais recente) leva à má sobrevivência celular pós-tipo.
  2. Resuspend as células a uma densidade de 1 x 106 células/100 μL em Sort Buffer (população principal). Transfira uma pequena alíquota (25-50 μL) para um tubo separado (população menor).
    1. Adicione anticorpo anti-NGFR conjugado (diluição de 1:100) à população celular principal.
    2. Adicione anticorpo de controle de isótipo (diluição 1:200) à população celular menor.
    3. Proteja as células da luz e mantenha no gelo por 30 minutos, intermitentemente (a cada 5-10 minutos) triturando as células para evitar a dotização.
  3. Após 30 min, adicione o Buffer de classificação em uma proporção de 1:1 para cada tubo de células. Células centrífugas a 300 x g por 5 min.
  4. Aspire o supernasciente, resuspenda as células pelotas no Buffer de classificação a uma densidade de 10 x 106 células/mL, e adicione mancha de célula viva ou morta.
  5. Usando a estratégia de gating NGFR+ apropriada (baseada no controle do isótipo, ver Figura 3), classifique células NGFR+ vivas suficientes para aplicações necessárias a jusante.
    NOTA: Se usar iBCs com repórteres fluorescentes (ou seja, NKX2-1GFP TP63tdTomato), recomenda-se classificar para células "triple positive" (ou seja, NKX2-1GFP+, TP63tdTomato+, NGFR+), com seleção e compensação de portão apropriadas (Figura 3). Durante essa expansão dos iBCs, uma proporção de células se diferencia em células secretas e uma proporção muito pequena de células multiciliadas também podem ser detectadas. Ambas as populações são NGFR-.

5. Geração de culturas mucociliary ALI

  1. Prepare as pastilhas de membrana porosa de 6,5 mm adicionando uma matriz de 200 μL à câmara apical (matriz qualificada por células-tronco embrionárias humanas ou laminina humana recombinante-521) de acordo com a instrução do fabricante.
    1. Coloque a 37 °C por pelo menos 2 h antes da necessidade.
  2. Aspire a matriz de revestimento da câmara apical da inserção. Adicione 500 μL do meio de célula basal à câmara basolateral.
  3. Resuspend pelo menos 30.000 células NGFR+ classificadas (a partir da etapa 4.5) em 100-200 μL Basal Cell Medium e transferência para a câmara apical usando uma micropipette P200. Repita para quantos poços desejarem (e células disponíveis). Coloque a placa na incubadora umidificada de 37 °C.
  4. Em 2-3 dias, aspirar câmaras apical e basolateral e alimentar-se com médio celular basal fresco (500 μL a apical, 100 μL para basolateral).
  5. Monitore a câmara apical diariamente com microscopia leve. Quando as células são >80% confluentes (tipicamente 3-7 dias), substitua o meio de célula basal por meio de diferenciação ALI (não pré-aquecido) em câmaras apical e basolateral. Ao trabalhar com o ALI Diferenciação Média, proteja-se contra a luz mantendo os recipientes de mídia envoltos em papel alumínio e desligando as luzes aéreas quando possível.
  6. No dia seguinte, aspire o meio da câmara apical, expondo assim a superfície apical ao ar.
  7. Substitua a mídia média de diferenciação ALI na câmara basolateral a cada 2-3 dias.
    1. Monitore a aparência cultural a cada 1-2 dias. Aspire cuidadosamente qualquer líquido acumulado da câmara apical, sem perturbar a camada celular.
    2. Avalie a resistência elétrica transeptelial (TEER) para integridade epitelial.
      NOTA: O TEER pode ser avaliado nos dias seguintes à exposição ao ar para dar uma leitura da integridade da camada epitelial. O momento ideal para medir o TEER não foi estabelecido, embora valores consistentes com diferenciação mucociliaria de alta qualidade sejam tipicamente >500 x cm2.
    3. Se for necessário remover detritos ou muco, adicione suavemente 100 μL PBS (sem Ca2+ ou Mg2+) à câmara apical. Incubar a 37 °C por 10 min e, em seguida, aspirar cuidadosamente PBS.
    4. Após 7-10 dias de exposição ao ar, cílios motile normalmente aparecem e podem ser vistos usando microscopia leve. Dependendo do experimento planejado e da leitura, as células podem ser analisadas após 14-28 dias de exposição ao ar.
      NOTA: Se as células fluorescentes do repórter tiverem sido usadas, e se um microscópio fluorescente de células vivas estiver disponível, as células podem ser rastreadas com microscopia leve, bem como fluorescência de repórteres.

6. Criopreservação opcional (mas recomendada) de iBCs

  1. Após 10-14 dias da mais recente passagem de cultura 3D, dissociar os esferoides à suspensão de célula única como nas etapas 3.2-3.5. Faça uma contagem de células.
  2. Resuspend em Criopreservação Média a uma densidade de 250.000 células /500 μL em um criovial.
  3. Coloque o cryovial(s) em um recipiente para garantir uma queda constante da temperatura (1 °C/min) e transfira para -80 °C por 24-48 h, seguido de transferência para -150 °C para armazenamento a longo prazo.
    NOTA: A criopreservação repetida, bem como a criopreservação de células classificadas anteriormente NGFR+foram realizadas, mas estas não foram adequadamente avaliadas para a viabilidade celular e a capacidade de formar culturas ali funcionais. Especialmente com a passagem celular estendida, recomenda-se avaliar para o karyótipo, pois isso tem sido observado para variar em iPSCs e células derivadas do iPSC.

Resultados

Seguindo este protocolo, 200.000 iBCs criopreservados (previamente confirmados como um karyótipo 46XY normal)11 foram descongelados e expandidos na cultura 3D. Cinco dias depois, os esferoides resultantes foram dissociados, contados e aprovados novamente para uma expansão adicional. Aproximadamente 480.000 células foram obtidas e re-suspensas em matriz 3D (gotículas de 12 x 50 μL, densidade de 400 células/μL). Fresh Basal Cell Medium foi aplicado a cada 2-3 dias. Dez dias depois, as células foram novamente dissociadas e contadas. Foram colhidas e preparadas para FACS 19,7 x 106 células. 106 células foram manchadas com o controle isótipo IgG1 κconjugado pela APC e as outras 18,7 x 106 células foram manchadas com o anticorpo anti-NGFR conjugado pela APC por 30 minutos protegidos da luz (Figura 3).

O NGFR+ gating foi realizado após comparação com as células de controle do isótipo e foi definido propositalmente para coletar as células NGFR+ mais expressadoras (Figura 3). Com essa técnica de gating, 28% das células vivas e individuais eram NGFR+. Enquanto mais células estavam disponíveis, 750.000 células foram coletadas para a cultura a jusante. As células classificadas foram resuspengiadas no Meio celular basal a uma concentração de 50.000 células/100 μL. 50.000 células foram então semeadas em cada inserção porosa de membrana porosa de 6,5 mm, que havia sido revestida com laminina recombina humana-521 (2 μg/200 μL) de acordo com as diretrizes do fabricante. 500 μL Basal Cell Medium foi adicionado à câmara basolateral de cada inserção e a placa foi colocada em uma incubadora umidificada de 37 °C. Três dias depois, a mídia na câmara apical foi aspirada e as células eram ~90% confluentes por microscopia leve (Figura 4B). A mídia da câmara basolateral foi aspirada; O MEIO DE Diferenciação ALI foi adicionado às câmaras apical (100 μL) e basolateral (500 μL). No dia seguinte, a mídia da câmara apical foi aspirada.

Nos 21 dias seguintes, as células foram avaliadas periodicamente por microscopia leve e alimentadas com médio de diferenciação ALI fresco (somente câmara basolateral) a cada 2-3 dias. As células individuais eram inicialmente facilmente identificáveis (Figura 4A), tinham uma aparência alongada e em forma de fuso, e formavam uma monocamada frouxamente embalada (Figura 4B). Durante os dias seguintes, as células formaram uma camada fortemente embalada, altamente celular, epitelial, e após 7-10 dias houve o claro surgimento da produção de lólia e muco. O TEER das amostras foi calculado e semelhante aos controles celulares primários (variam de 700-1600 Ω x cm2)11. Posterior fixação (dia 21-28) com paraformaldeído e imunolabeling para marcadores epiteliais das vias aéreas canônicas foi realizada para MUC5AC e acetilada-α-tubulina, entre outros (Figura 4C). No geral, com nossa observação da cília motil, produção de muco, bem como imunostenção confirmatória de células-tronco multiciliadas e secretas que é semelhante à dos HBECs primários, concluímos que geramos com sucesso células epiteliais das vias aéreas a partir de células-tronco pluripotentes induzidas.

figure-results-1
Figura 1: Esquema geral do protocolo. Os iBCs criopreservados são descongelados, expandidos e FACS purificados antes do revestimento em pastilhas porosas de membrana, onde se diferenciam em um epitélio mucociliador funcional. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

figure-results-2
Figura 2: Imagens de contraste de fase representativas. Imagens de contraste de fase representativa demonstrando aparência usual de iBCs na cultura 3D após (A) 1 dia, (B) 4 dias, (C) 8 dias e (D) 14 dias (apenas tipo pré-NGFR). As barras de escala representam 500 μm. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

figure-results-3
Figura 3: Parcelas representativas facs. Representante FACS parcelas para iBCs não repórter e fluorescente. Exemplos de controles de isótipo são mostrados e foram usados para selecionar para as células NGFR+ mais expressas. As linhas iPSC que contêm repórteres fluorescentes são "triplamente classificadas" para células NKX2-1GFP+ TP63tdTomato+ NGFR+. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

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Figura 4: Imagens representativas das culturas iBC em membranas porosas. As imagens de contraste de fase são mostradas (A) 1 dia e (B) 3 dias após o revestimento. Imunolabelamento representativo de culturas mucociliárias mostradas em (C); tubulina acetilada-alfa (verde) e MUC5AC (vermelho). As barras de escala representam 25 μm. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Arquivo suplementar 1: Tabela de componentes de mídia. Clique aqui para baixar este Arquivo.

Discussão

HBECs são do tipo celular padrão-ouro para estudar doenças do epitélio das vias aéreas. Devido às suas limitações (incluindo acessibilidade e dificuldade de manipulação genética), geramos um protocolo para a derivação de culturas iBCs e ALI. Essas células podem ser derivadas de qualquer doador e reter seu histórico genético único, permitindo assim estudos básicos de desenvolvimento, modelagem de doenças e desenvolvimento terapêutico novo.

Embora cada etapa individual do protocolo descrito seja necessária, há várias que merecem menção extra. Em primeiro lugar, a cada etapa que requer a dissociação de esferoides em células únicas, é fundamental evitar a pipetação excessiva; A digestão enzimática (com despase ou trippsina) promove uma melhor sobrevivência celular, enquanto a tubulação excessiva leva a morte celular significativa. Em segundo lugar, ao purificar os iBCs NGFR+, a utilização do controle do isótipo é crucial e recomendamos selecionar para as células NGFR+ mais expressas com FACS (Figura 3). Essa abordagem resulta em culturas ali ótimas com diferenciação mucocilial adequada. Finalmente, a preparação e semeadura de membranas porosas precisamente documentadas no protocolo é fundamental para a sobrevivência da cultura ALI. Embora tipicamente semeamos 30.000-60.000 células por inserção, tivemos sucesso com apenas 20.000 células. Embora culturas bem sucedidas possam ser geradas usando o revestimento matricial embrionário humano qualificado por células-tronco, usamos mais recentemente laminina recombina-521 humana com uma durabilidade significativamente maior das culturas ALI.

Muito raramente, as diferenciações do iPSC podem não conseguir regulamentar uma porcentagem adequada de iBCs NGFR+. Neste caso, a passagem serial de iBCs (na cultura 3D) pode resultar em um aumento da frequência de NGFR ao longo do tempo. As limitações deste protocolo incluem o tempo, o custo e a experiência necessárias para gerar essas células. Além disso, reconhecemos que muitos pesquisadores estão interessados nos tipos celulares menos comuns do epitélio das vias aéreas (por exemplo, ionócitos, células neuroendócrinas). Embora tenhamos detectado alguns desses tipos de células mais raras, como nas culturas primárias do HBEC, elas não são identificadas de forma reprodutivelmente, provavelmente devido ao conhecimento incompleto sobre as pistas de desenvolvimento necessárias para gerar essas células.

Como está escrito, o protocolo acima começa com o descongelamento de iBCs já criopreservados. Os detalhes antes desta criopreservação são descritos anteriormente e além do escopo deste manuscrito 11,12.

Nosso método de cultura ali epitelial das vias aéreas permite a geração de células epiteliais das vias aéreas funcionais de quase qualquer doador. Isso aumenta consideravelmente a acessibilidade a preciosas células epiteliais geneticamente controladas das vias aéreas que podem ser usadas para modelagem de doenças, rastreamento de medicamentos, futuras terapias baseadas em células, bem como para melhorar a compreensão da padronização do desenvolvimento dentro do epitélio das vias aéreas.

Divulgações

Os autores não têm revelações.

Agradecimentos

Agradecemos aos membros dos laboratórios Hawkins, Kotton e Davis por sua contribuição ao longo dos anos em relação a este e outros projetos. Também estamos em dívida com Brian Tilton (Diretor de Classificação de Células BU) por sua dedicação e experiência técnica, e somos gratos a Greg Miller e Marianne James do Centro de Medicina Regenerativa da Universidade de Boston (CReM) por seu apoio e experiência técnica em manutenção e caracterização de iPSCs específicos para pacientes, apoiados pelo NIH concede no1 75N92020C000005 e U01TR001810. Este trabalho foi apoiado pelas bolsas NIH U01HL148692, U01HL134745, U01HL134766 e R01HL095993 a D.N.K, R01HL139876 a B.R.D, R01 HL1397999 para F.H., e a Cystic Fibrosis Foundation (CFF) concede CFF 00987G220 e CFF WANG20GO para D.N.K, CFF DAVIS15XX1, DAVIS17XX0, DAVIS19XX0 a B.R.D, CFF SUZUKI19XX0 a S.S, CFF BERICA2010 a A.B., e CFF HAWKIN20XX2 para F.H.

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo
NomeEmpresaNúmero de catálogoComentários
Placa tratada com cultura de tecidos de 12 poçosCorning3515plano
3-D fator de crescimento reduzido MatrigelCorning356230
A83-01ThermoFisher Scientific293910
Inserções de cultura de células (Transwell)Corning34706.5mm de diâmetro; 0.4μ m tamanho do poro
Dimetilsulfóxido (DMSO)SigmaD8418
Dispase II, PóThermoFisher Scientific17105-041
DMH1ThermoFisher Scientific412610
Dulbecco's Modified Eagle Medium/Nutrient Mixture (DMEM):F-12ThermoFisher Scientific11330-032
Dulbecco's Phosphate Buffered Saline ( PBS) (1X)Gibco14190-144
Solução de sal dissódico de ácido etilenodiaminotetracético (EDTA)SigmaE7889
Soro bovino fetal (FBS)SoluçãoSH3007003E
Hanks (HBSS)ThermoFisher Scientific14175-079
HEPESSigmaH3375
qualificado por hESC MatrigelCorning354277
controle de isotipo IgG1kappa de camundongo, Biolegend conjugadoAPC400122
Camundongo monoclonal anti-humano CD271 / NGFR, Biolegend conjugadoAPC345108
meio PneumaCult-ALI (meio de diferenciação ALI)StemCell Technologies05001
PneumaCult-Ex Plus Medium (meio de base de células basais)StemCell Technologies05040
PrimocinInvivoGenant-pm-2
rhLaminin-521ThermoFisher ScientificA29248Concentração Final: 10ug/mL
Solução de Tripsina-EDTA, 0,05%InvitrogenT3924
Y-27632Tocris1254
fundo salina balanceada Fisher com com

Referências

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