Summary
L'infiammazione della superficie oculare danneggia i tessuti della superficie oculare e compromette le funzioni vitali dell'occhio. Il presente protocollo descrive un metodo per indurre l'infiammazione oculare e raccogliere i tessuti compromessi in un modello murino di disfunzione della ghiandola di Meibomio (MGD).
Abstract
Le malattie della superficie oculare comprendono una serie di disturbi che disturbano le funzioni e le strutture della cornea, della congiuntiva e della rete di ghiandole superficiali oculari associate. Le ghiandole di Meibomio (MG) secernono lipidi che creano uno strato di copertura che impedisce l'evaporazione della parte acquosa del film lacrimale. I neutrofili e le trappole del DNA extracellulare popolano la MG e la superficie oculare in un modello murino di malattia allergica dell'occhio. Le trappole extracellulari aggregate di neutrofili (aggNET) formulano una matrice simile a una maglia composta da cromatina extracellulare che occlude le prese di MG e condiziona la disfunzione della MG. Qui viene presentato un metodo per indurre l'infiammazione della superficie oculare e la disfunzione MG. Le procedure per la raccolta di organi relativi alla superficie oculare, come la cornea, la congiuntiva e le palpebre, sono descritte in dettaglio. Utilizzando tecniche consolidate per l'elaborazione di ciascun organo, vengono anche mostrate le principali caratteristiche morfologiche e istopatologiche della disfunzione MG. Gli essudati oculari offrono l'opportunità di valutare lo stato infiammatorio della superficie oculare. Queste procedure consentono lo studio di interventi antinfiammatori topici e sistemici a livello preclinico.
Introduction
Ogni battito di ciglia riempie il film lacrimale liscio disperso sulla cornea. Gli epiteli della superficie oculare facilitano la distribuzione e il corretto orientamento del film lacrimale sulla superficie oculare. Le mucine sono fornite dalla cornea e dalle cellule epiteliali congiuntiva per aiutare a posizionare la parte acquosa del film lacrimale proveniente dalle ghiandole lacrimali sulla superficie degli occhi. Infine, MG secerne lipidi che creano uno strato di copertura che impedisce l'evaporazione della parte acquosa del film lacrimale 1,2,3. In questo modo, le funzioni coordinate di tutti gli organi oculari proteggono la superficie oculare da agenti patogeni o lesioni invasori e supportano una visione cristallina senza alcun dolore o disagio.
In una superficie oculare sana, la scarica oculare o il reum oculare spazza via polvere, cellule epiteliali morte, batteri, muco e cellule immunitarie. Le trappole extracellulari di neutrofili aggregati (aggNET) formulano una matrice simile a una maglia composta da cromatina extracellulare e incorporano questi componenti nel reum dell'occhio. Gli AggNET risolvono l'infiammazione mediante la degradazione proteolitica di citochine e chemochine pro-infiammatorie4. Tuttavia, quando diventano disfunzionali, questi aggNET aberranti guidano la patogenesi di malattie come le occlusioni vascolari in COVID-195, calcoli biliari6 e sialolitiasi7. Allo stesso modo, gli aggNET sulla superficie oculare svolgono un ruolo protettivo e contribuiscono a risolvere l'infiammazione della superficie altamente esposta8. Una formazione esagerata o la mancanza di aggNET nella superficie oculare possono compromettere la stabilità del film lacrimale e / o causare ferite corneali, congiuntivite cicatrizzante e malattia dell'occhio secco. Ad esempio, l'ostruzione della MG è una delle principali cause di malattia dell'occhio secco9. Gli AggNET sono anche noti per tappare il flusso di secrezione lipidica dai dotti di MG e causare la disfunzione della ghiandola di Meibomio (MGD). La congestione degli orifizi MG da parte di aggNET provoca una mancanza di fluido grasso che avvolge la superficie oculare e il fluido imbottigliato retrogrado, con conseguente disfunzione della funzione ghiandolare e danni acinosi. Questa disfunzione può provocare evaporazione del film lacrimale, fibrosi dei margini sulle palpebre, infiammazione oculare e danni dannosi alla MG10,11.
Diversi modelli animali sono stati sviluppati nel corso degli anni per imitare il processo patologico della MGD nell'uomo. Ad esempio, topi C57BL / 6 di età pari o superiore a 1 anno hanno contribuito a studiare gli effetti legati all'età sulla malattia dell'occhio secco (DED) e MGD, riflettendo la patologia della malattia oculare in pazienti di età pari o superiore a 50 anni12,13,14. Inoltre, i conigli sono modelli appropriati per studiare gli effetti degli interventi farmacologici. Pertanto, l'induzione di MGD nei conigli è stata riportata sia dalla somministrazione topica di adrenalina che dall'introduzione sistemica di acido 13-cis-retinoico (isotretinoina)15,16,17,18,19.
Sebbene questi modelli animali fossero adeguati per determinare i diversi fattori che contribuiscono alla fisiopatologia della MGD, erano limitati nel loro utilizzo. Ad esempio, il modello murino di MGD legata all'età era ideale per decifrare elementi solo negli anziani e, quindi, i conigli sembravano essere il modello animale più adatto per studiare le malattie della superficie oculare, in quanto consentono lo studio di molteplici meccanismi fisiopatologici. Tuttavia, a causa della mancanza di strumenti analitici completi per rilevare le proteine sulla superficie oculare e poiché molte parti del genoma del coniglio non sono annotate, sono limitate per le indagini20,21.
Inoltre, questi modelli animali utilizzati per studiare la patogenesi della malattia dell'occhio secco non hanno fornito dettagli adeguati per analizzare il braccio immunologico del disturbo che istiga l'infiammazione della superficie oculare. Di conseguenza, il modello murino di MGD sviluppato da Reyes et al. ha mostrato un'associazione tra malattia allergica dell'occhio nei topi e MGD nell'uomo e ha evidenziato l'eziologia immunitaria responsabile della MGD21 ostruttiva. Questo modello associa la malattia allergica dell'occhio con una risposta TH17 che recluta neutrofili alla congiuntiva e alla palpebra, causando MGD e infiammazione oculare cronica21. L'induzione della MGD e dell'infiammazione oculare in questo modello murino è uno strumento prezioso per studiare gli eventi a monte durante lo sviluppo dell'infiammazione locale guidata da una risposta immunitaria in corso21. L'attuale protocollo descrive l'infiammazione della superficie oculare accompagnata da MGD ostruttiva. In questo metodo, i topi vengono immunizzati e, dopo 2 settimane, sfidati sulla superficie oculare con l'immunogeno per 7 giorni. Inoltre, vengono descritti i passaggi per isolare l'essudato oculare e gli organi oculari associati durante l'infiammazione acuta e la dissezione della cornea, della congiuntiva e delle palpebre.
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Protocol
Tutte le procedure che coinvolgono gli animali sono state condotte secondo le linee guida istituzionali sul benessere degli animali e approvate dalla commissione per il benessere degli animali della Friedrich-Alexander-University Erlangen-Nuremberg (FAU) (numero di autorizzazione: 55.2.2-2532-2-1217). Per il presente studio sono stati utilizzati topi femmina C57Bl/6, di età compresa tra 7 e 9 settimane. I topi sono stati ottenuti da fonti commerciali (vedi Tabella dei materiali) e tenuti in condizioni specifiche prive di agenti patogeni con cicli giorno/notte di 12 ore.
1. Induzione dell'infiammazione della superficie oculare murina
- Eseguire la preparazione immunogena per l'immunizzazione.
- Preparare l'immunogeno fresco il giorno dell'immunizzazione, mescolando l'ovoalbumina (OVA, 50 mg/ml) e la tossina della pertosse (100 μg/ml) in soluzione salina e l'adiuvante idrossido di alluminio (40 mg/ml) (vedi Tabella dei materiali) in proporzione 1:1.
ATTENZIONE: Eseguire l'apertura, la ricostituzione e la preparazione immunogena della tossina della pertosse in un armadio di sicurezza laminare. Indossare indumenti protettivi ed evitare qualsiasi contatto con la pelle. - Incubare l'immunogeno e la miscela adiuvante a temperatura ambiente per 30 minuti e caricare 100 μL in una siringa da 1 ml.
- Eseguire l'iniezione intraperitoneale della soluzione immunogena in un topo non anestetizzato.
- Tieni il mouse dolcemente per la coda mentre afferri la griglia della gabbia. Tenere saldamente la pelle della schiena e la regione del collo tra il pollice e l'indice e fissare la coda e gli arti inferiori tra l'anello e il mignolo contro il palmo della mano.
- Tieni il mouse fisso con la testa verso il basso.
- Iniettare 100 μL della soluzione immunogena preparata nel quadrante destro o sinistro della cavità addominale inferiore.
- Preparare l'immunogeno fresco il giorno dell'immunizzazione, mescolando l'ovoalbumina (OVA, 50 mg/ml) e la tossina della pertosse (100 μg/ml) in soluzione salina e l'adiuvante idrossido di alluminio (40 mg/ml) (vedi Tabella dei materiali) in proporzione 1:1.
- Eseguire la sfida della superficie oculare 2 settimane dopo l'immunizzazione.
- Anestetizzare il topo con isoflurano (2,5%).
- Applicare 5 μL di OAV (50 mg/ml) o soluzione salina (0,9% NaCl) per occhio su entrambi gli occhi e attendere che la goccia venga assorbita dall'occhio. Questo richiede ~ 5 min.
- Ripetere la procedura 1 volta al giorno per 7 giorni.
NOTA: La somministrazione topica di farmaci può essere effettuata allo stesso modo.
2. Raccolta degli essudati oculari
- Recuperare gli essudati oculari formati durante la fase di challenge applicando 50 μL di soluzione salina sterile sull'occhio subito dopo la sfida.
- Per ottenere una sospensione unicellulare, trattare la secrezione oculare raccolta con MNasi ricombinante (2 x 106 gel U/mL, vedi Tabella dei materiali) contenente il calcio cofattore (5 mM) a 37 °C per 20 min.
- Centrifugare a 400 x g per 7 minuti a temperatura ambiente.
- Isolare il surnatante e misurare le citochine e le chemochine utilizzando ELISA multiplex secondo le istruzioni del produttore (vedere Tabella dei materiali).
NOTA: Il surnatante ottenuto può essere utilizzato per l'analisi delle proteine e il pellet per saggi funzionali come immunofenotipizzazione, fagocitosi, degranulazione ed espressione genica.
3. Asportazione dei tessuti superficiali oculari
- Seziona le palpebre e il globo oculare seguendo i passaggi seguenti.
- Eutanasia del topo mediante asfissia da CO2 e lussazione cervicale.
- Posizionare il mouse su una superficie piana.
- Disinfettare l'area orbitale intorno all'occhio con un tampone impregnato di etanolo al 70%.
- Fare un'incisione tra l'orecchio e il seno retro-orbitale e lungo la superficie sopra l'osso squamoso verticalmente, estendendo l'incisione orizzontalmente sotto la palpebra inferiore lungo l'osso mascellare e sopra la palpebra superiore lungo l'osso frontale. Questo forma un'incisione intorno all'occhio (Figura 1).
- Tenere con cura il tessuto sezionato intorno all'occhio usando una pinza curva e tirare fuori il tessuto e il bulbo oculare.
- Posizionare gli organi asportati in PBS sterile.
- Tagliare il tessuto muscolare facciale in eccesso intorno alle palpebre superiori asportate usando un bisturi e sotto lo stereomicroscopio.
- Raccogli la congiuntiva seguendo i passaggi seguenti.
- Posizionare la palpebra superiore su una capsula di Petri asciutta sotto lo stereomicroscopio.
- Usando una pinzetta fine e un bisturi, staccare lo strato biancastro-mucoso molto delicatamente dalla superficie interna della palpebra.
- Quindi, sezionare la cornea seguendo i passaggi seguenti.
- Posizionare il globo oculare su una nuova capsula di Petri asciutta sopra il ghiaccio secco per 3 minuti.
- Portare la capsula di Petri sulla superficie del banco in una posizione stabile.
- Fai una piccola incisione sul bordo della cornea vicino al limbus usando sottili forbici affilate.
- Prolungare l'incisione con il bisturi intorno al globo oculare, separando la sclera dalla cornea.
- Rimuovere i resti dell'iride e della lente dalla parte posteriore della cornea sciacquando generosamente con soluzione salina.
4. Documentazione dell'ostruzione della ghiandola di Meibomio (MG)
- Per valutare la MG e i suoi orifizi, posizionare le palpebre asportate in posizione verticale sotto lo stereomicroscopio (Figura 2).
- Cattura immagini con luce bianca epi-illuminazione in base al tempo di esposizione della fotocamera e alle impostazioni ISO.
NOTA: L'analisi morfometrica di queste immagini fornisce una quantificazione affidabile della dimensione del tappo all'uscita delle ghiandole. La quantificazione può essere eseguita delineando con lo strumento bacchetta i tappi oculari ed eseguendo il comando "Analizza particelle" del software Image J (vedi Tabella dei Materiali).
5. Transilluminazione delle palpebre (morfologia della ghiandola di Meibomio)
- Per valutare l'area MG, posizionare le palpebre asportate in posizione orizzontale e accendere la retroilluminazione dello stereomicroscopio dotato di una telecamera a infrarossi (Figura 3).
- Acquisire immagini regolando il tempo di esposizione in base all'ISO della fotocamera (vedere Tabella dei materiali).
NOTA: L'imaging a infrarossi di queste palpebre transilluminate sotto lo stereomicroscopio può aiutare a misurare la forma e le dimensioni di ogni acini. L'analisi morfometrica di queste immagini fornisce una quantificazione affidabile delle dimensioni e del numero di MG. La quantificazione può essere eseguita delineando la MG con lo strumento bacchetta ed eseguendo il comando "Analizza particelle" del software Image J.
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Representative Results
Il presente protocollo descrive i passaggi sequenziali per stabilire un modello murino di infiammazione della superficie oculare. I protocolli mirano a mostrare come applicare le terapie localmente, ottenere essudati oculari e asportare organi accessori associati come palpebre sane e infiammate (Figura 2), la cornea e la congiuntiva. Bisogna prestare attenzione quando le palpebre superiori vengono sezionate per l'isolamento della congiuntiva e deve essere conservato in 1x PBS durante la dissezione della cornea. Ciò impedirà l'essiccazione della congiuntiva, che può essere utilizzata per studi istologici, farmacocinetici e di espressione genica.
OAV e soluzione salina sono stati applicati localmente per 7 giorni consecutivi seguendo il protocollo sopra menzionato. I topi sfidati topicamente con soluzione salina hanno mostrato una superficie oculare sana con occhi spalancati e un modello di battito delle palpebre regolare. Tuttavia, l'infiammazione oculare è stata istigata in topi immunizzati C57BL / 6J sfidati con OVA. L'instillazione della soluzione OAV sulla superficie oculare ha causato prurito, e non dolore, per le prime 2 ore dopo l'instillazione. L'eczema dell'essudato e delle palpebre è stato osservato solo durante gli ultimi 3 giorni della fase di sfida. Nessun dolore era evidente, a giudicare il comportamento degli animali. Pertanto, è stato ipotizzato un livello moderato di stress per i topi per un breve periodo di tempo. La sfida OAV giornaliera ha innescato manifestazioni cliniche come abbondante secrezione oculare, chemosi e stretta apertura degli occhi. Inoltre, le palpebre superiore e inferiore spesso aderivano l'una all'altra, compromettendo la funzione essenziale di battere le palpebre (Figura 2). Per questo modello sono stati seguiti rigorosi criteri di interruzione (Supplementary File) che sono stati approvati dal comitato etico locale per la sperimentazione animale. L'interruzione immediata veniva effettuata se un topo raggiungeva 15 punti in un dato momento.
File supplementare. Clicca qui per scaricare questo file.
Dopo l'eutanasia, gli organi oculari sono stati asportati e sono stati osservati a un ingrandimento più elevato. Le palpebre asportate al microscopio hanno mostrato grandi occlusioni che ostruiscono gli orifizi della MG e dell'edema, in netto contrasto con le palpebre sane che mostrano piccoli tappi della ghiandola che rivestono la palpebra (Figura 3).
Un ulteriore esame della transilluminazione infrarossa della ghiandola rivela l'aspetto racemico degli acini della MG. Ciò consente di quantificare le ghiandole di Meibomio visibili (indicate in rosso). Le palpebre dei topi con problemi salini mostravano gli acini rotondi che formavano la MG. In confronto, l'applicazione di OAV ha indotto la distruzione e la perdita di alcuni MG nei topi con malattia allergica agli occhi (AED, Figura 4). L'analisi istologica delle palpebre ha mostrato MG dilatata rispetto ai topi naïve somministrati con solo soluzione salina per 7 giorni (Figura 5), consentendo l'accumulo di neutrofili che producono aggNET che infine ostruiscono gli orifizi della ghiandola.
Separare la cornea dalla sclera dell'occhio può essere ingombrante a causa della superficie mucosa scivolosa del globo oculare. L'incubazione del bulbo oculare su ghiaccio secco in una capsula di Petri per 3 minuti consente di fissare l'occhio, praticare una piccola incisione sul limbus e sezionare la cornea (Figura 6).
I passaggi arruolati nella sezione protocollo hanno facilitato la raccolta della cornea e della congiuntiva. Inoltre, la somministrazione locale di OAV ha inflitto una grave infiammazione alla congiuntiva, con un aspetto iperemico (Figura 7).
L'analisi degli essudati oculari rivela meccanismi molecolari nello sviluppo della MGD. La quantificazione delle citochine e delle chemochine come descritto ha mostrato livelli elevati delle principali chemochine che facilitano lo stravaso dei neutrofili, la fagocitosi e la degranulazione (CXCL-1) nei surnatanti di topi con AED8. Inoltre, il primo mediatore della risposta di fase acuta e della produzione di neutrofili, IL-6, era anche significativamente elevato nei topi con DAE. D'altra parte, la concentrazione di IL-10, una citochina antinfiammatoria, non ha mostrato cambiamenti significativi sia nei topi naïve che in quelli DAE (Figura 8).
Figura 1: Asportazione del tessuto facciale che circonda la regione orbitale. La traccia di incisione è indicata in rosso. Ciò consente di asportare gli organi oculari e studiare l'influenza e gli effetti di varie terapie somministrate localmente sugli organi oculari accessori come la congiuntiva e la cornea. Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.
Figura 2: La somministrazione di OAV causa manifestazioni cliniche di MGD . (A) I topi a cui è stata somministrata soluzione salina mostrano una superficie oculare sana con gli occhi ben aperti. (B) L'applicazione di OAV induce grave infiammazione della superficie oculare, stretta apertura degli occhi e segni di chemioterapia. Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.
Figura 3: Tappi duttali che ostruiscono le ghiandole di Meibomio (MG) situate lungo le palpebre. (A) Fotografia macro rappresentativa di una palpebra sana senza eccessiva secrezione oculare da un topo somministrato soluzione salina per soli 7 giorni. (B) Palpebra che mostra grandi occlusioni duttali della MG ed edema dopo il periodo di provocazione. Barra di scala = 300 μm. Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.
Figura 4: La macrofotografia transilluminante consente la visualizzazione degli acini (linee rosse) della MG. (A) Migliorare i livelli di infrarossi visualizza gli acini sani dei topi ingenui e svela i distinti acini a forma di tasca nelle palpebre sane. (B) Gli acini appaiono spessi nelle palpebre colpite dei topi con l'applicazione di OVA. Barra di scala = 100 μm. Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.
Figura 5: L'analisi istologica delle palpebre mostra dotti dilatati di MG nei topi con insulto OAV ripetuto per 7 giorni . (A) Le palpebre di topo ingenue mostrano l'assenza di dotti dilatati, raffiguranti un organo oculare funzionante sano (B) in contrasto con i topi con OAV. Barra di scala = 200 μm. Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.
Figura 6: Incisione alla cornea vicino al limbus e separazione della cornea dalla sclera. Immagine del bulbo oculare che mostra il punto di incisione (indicato da una freccia bianca). Barra di scala = 500 μm. Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.
Figura 7: Somministrazione locale di OAV . (A) Macro fotografie di organi oculari murini che mostrano la cornea. Barra della scala: 600 μm. (B) Congiuntiva infiammata da topi sfidati con OVA. Barra scala: 100 μm. Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.
Figura 8: Misurazione dei marcatori infiammatori negli essudati oculari raccolti. Analisi quantitativa di citochine e chemochine nel surnatante dell'essudato oculare centrifugato di topi naïve (n = 7) e topi con MGD (n = 8). I dati sono espressi come mediana con un intervallo 5%-95%. La significatività statistica è stata calcolata utilizzando il test U di Mann-Whitney a due code. Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.
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Discussion
La secrezione oleosa delle ghiandole di Meibomio è di grande importanza per un occhio sano22. Tuttavia, l'ostruzione di queste ghiandole sebacee da parte di trappole extracellulari di neutrofili aggregati (aggNET) che si allineano come filamenti paralleli situati sulle placche tarsali di entrambe le palpebre può interrompere il film lacrimale23. Questa interruzione provoca disfunzione della ghiandola di Meibomio (MGD)1 e un'evaporazione lacrimale accelerata e condiziona il danno della superficie oculare2. Questo protocollo descrive l'infiammazione della superficie oculare immuno-mediata che porta all'ostruzione della MG.
Studi su modelli murini hanno confermato i meccanismi immuno-mediati sottostanti che causano l'ostruzione della MG associata all'infiammazione della superficie oculare. Una robusta risposta TH17 che recluta neutrofili nel modello murino di DAE e un aumento dei neutrofili e di altre cellule mieloidi nel liquido lacrimale dei pazienti con MGD indica il ruolo dei neutrofili che ostruiscono l'MG21. La presenza di aggNET che occludono gli orifizi MG è stata confermata con peptidil arginina deiminasi 4 in topi con AED. In questo modello, i neutrofili hanno mostrato una ridotta capacità di aggregarsi e hanno formato aggNET che ostruivano i dotti e gli orifizi delle ghiandole MG10. Inoltre, l'analisi lacrimale di pazienti con MGD ha mostrato un aumento dell'anafilossina C5a e della chemochina IL-8, dimostrando una maggiore attività del sistema del complemento e un elevato afflusso di infiltrazione di neutrofili. Infine, un aumento del livello di citochine associate a diverse funzioni dei neutrofili, come IL-6, IL-18, MCP-1 / CCL-2 e MIG / CXCL9, sottolinea la posizione primaria dei neutrofili nella patogenesi di MGD11.
L'insorgenza di MGD contribuisce in modo significativo allo sviluppo della DED e l'esame del ruolo dei numerosi elementi coinvolti nella patogenesi delle manifestazioni oculari è complicato24. Pertanto, la selezione degli animali come modelli è fortemente influenzata dalla questione in esame. Ad esempio, i conigli fungono da modelli convenzionali per i test farmaceutici delle formulazioni; I modelli felini, suini e canini sono adatti per studiare caratteristiche patologiche simili ai pazienti umani e i topi sono adatti principalmente per la manipolazione genetica25.
I modelli animali sono strumenti preziosi per studiare la patogenesi della malattia ed esaminare l'efficacia terapeutica di vari interventi in vivo. Ad esempio, i trattamenti convenzionali includono la somministrazione di instillazioni di colliri per trattare le manifestazioni oculari cliniche; Tuttavia, a causa del flusso lacrimale e del sistema di drenaggio lacrimale, tali interventi oculari vengono rapidamente rimossi dalla superficie oculare. Ciò causa solo un'azione temporanea e richiede somministrazioni ripetute e dosi elevate. Per risolvere questo problema, il modello di coniglio della malattia dell'occhio secco (DED) è servito come mezzo ideale per esaminare termogel e nanogel carbonizzati (CNG) come trattamenti topici alternativi. I termogel ottenuti coniugando diversi gradi di solfatazione dell'acido ialuronico e un poli terminato con ammine (N-isopropil acrilammide), quando somministrati all'occhio, si trasformano in un gel. Nel modello di coniglio di DED, questo gel è stato mantenuto per un tempo più lungo e una singola goccia ha riparato gli epiteli corneali danneggiati, fermato l'apoptosi e represso l'infiammazione oculare durante un follow-up di 7 giorni, suggerendo un'interruzione dell'infiltrazione leucocitaria dovuta all'inibizione dell'interazione leucocitaria mediata dalla selettina26.
Inoltre, nel modello di coniglio di DED, i nanogel carbonizzati (CNG) come colliri hanno mostrato lo scavenging dei radicali liberi che tratta la carenza lacrimale e l'eccessiva evaporazione lacrimale causata da una risposta infiammatoria esacerbata e stress ossidativo. I CNG sono stati ottenuti tramite la pirolisi del cloridrato di lisina (Lys-CNG) e somministrati, e una singola dose ha mitigato i sintomi DED entro 4 giorni. Un effetto terapeutico simile era ottenibile solo con diversi trattamenti di una quantità 10 volte superiore di instillazioni di ciclosporina A collirio. Questi nuovi interventi farmaceutici biocompatibili hanno mostrato prospettive superiori come interventi a dose singola e ritenzione oculare più estesa in modelli animali preclinici27.
Il knockout di diversi geni in modelli murini ha svelato il ruolo di più proteine coinvolte nella patogenesi della MGD. Ad esempio, l'espressione genica disregolata del recettore gamma attivato dal proliferatore dei perossisomi (PPAR γ)24 e le alterazioni nella sua via di segnalazione inducono cambiamenti nell'ingresso/proliferazione del ciclo cellulare, nella sintesi lipidica e nell'atrofia della ghiandola di Meibomio durante l'etàdi 13 anni. Inoltre, l'assenza del βENaC (β - canale epiteliale del sodio) in un modello murino ha indicato che il fenotipo di disfunzione MG prevalente nelle femmine era associato ad atrofia MG e ostruzione dell'orifizio come negli esseri umani con pseudoipoaldosteronismo 1 (PHA) 28. Il ruolo essenziale di CD147 è stato chiarito anche nei topi e si ritiene che mantenga il ricco contenuto lipidico dei meibocytes29. I topi carenti dell'enzima superossido dismutasi 1 hanno mostrato elevati danni ossidativi ai lipidi e al DNA, che erano collegati ad un aumento dell'infiammazione MG30. Infine, una singola mutazione nell'ELOVL4 che codifica per l'enzima necessario per sintetizzare residui di acidi grassi a catena estremamente lunga che formano il lipidoma del meibum porta a cambiamenti funzionali nella superficie oculare anteriore31. È interessante notare che la MGD è stata anche indotta in topi con una dieta speciale con composizione lipidica incompleta per valutare l'efficacia terapeutica dell'azitromicina come formulazione oftalmica32.
Mentre la maggior parte degli studi che impiegano modelli murini hanno identificato diversi geni coinvolti nella MGD, molti mancano di una condizione immunologica di base. Il modello DAE fornisce un'intera gamma di possibili interventi dall'induzione della risposta immunitaria, alla generazione di anticorpi IgE e alla fase effettrice, accompagnati da diversi cambiamenti patologici simili alla MGD evaporativa umana.
Quando si studia MGD utilizzando il protocollo menzionato, è fondamentale aggiungere immunogeno (OAV e tossina della pertosse) all'allume in proporzione 1: 1. Si dovrebbe incubare la miscela per 30 minuti a temperatura ambiente per un buon adsorbimento della tossina ovalbumina-pertosse all'allume. Queste interazioni sono vitali per innescare un'adeguata risposta immunitaria. Inoltre, durante l'immunizzazione, è necessario prestare attenzione durante l'iniezione, in quanto ciò potrebbe causare la perforazione degli organi sottostanti della cavità peritoneale. Ciò può comportare un'immunizzazione inadeguata e un'infiammazione sistemica nel topo, con effetti profondi sulla risposta immunitaria.
Gli essudati oculari sono grandi strutture cromatiniche extracellulari simili a ragnatele che ingabbiano cellule immunitarie infiltranti. Pertanto, il trattamento con MNasi degli essudati oculari raccolti da questo modello è vitale per ottenere sospensioni unicellulari11. Inoltre, questi essudati sono facili da raccogliere sulla superficie oculare e sono una fonte di neutrofili vitali che sono trasmigrati dalla circolazione. La principale limitazione di questa tecnica è la quantità di essudato da raccogliere dalle superfici oculari. L'aggiunta di 50 μL di soluzione salina a ciascun occhio consente il recupero di fino a 100 μL di essudato da un topo. Questo è appena sufficiente per le colorazioni con citometria a flusso (FACS) 1-2 e i surnatanti per studi biochimici.
Sezionare con un bisturi per strappare successivamente l'occhio e i tessuti circostanti può spesso causare lesioni alla vena temporale superficiale, alla vena palpebrale inferiore o alla vena angolare oculare. Si consiglia di creare un'incisione nella pelle con meno profondità intorno all'occhio poiché il sanguinamento può interferire con ulteriori preparazioni istologiche. Durante la dissezione di un tessuto, la conservazione di altri tessuti in PBS è essenziale poiché l'essiccazione o una lubrificazione insufficiente possono causare la perdita delle caratteristiche strutturali.
Durante la dissezione della cornea dal globo oculare, se l'incubazione del globo oculare su ghiaccio secco non consente un controllo costante, è possibile estendere il tempo fino a 5 minuti in modo che l'incisione al limbus e la separazione della cornea siano possibili.
Potenziali applicazioni
L'infiammazione della superficie oculare associata alla MGD è una malattia multifattoriale. Lo sviluppo e la progressione della disfunzione in queste ghiandole secernenti lipidi possono essere causati da fattori oftalmici, sistemici, ormonali e genetici, sostanze chimiche, farmaci, agenti nocivi meccanici e risposte immunologiche33. Diversi studi hanno riportato neutrofili che causano occlusione delle ghiandole di Meibomio e infiammazione 11,21,34,35,36,37,38. Lo sviluppo di interventi antinfiammatori topici e sistemici che interferiscono con queste vie immunologiche può offrire sollievo ai pazienti affetti da disagio oculare dovuto alla MGD. Il modello murino di malattia allergica dell'occhio può essere utilizzato in un contesto preclinico per studiare le proprietà farmacocinetiche e farmacodinamiche di questi agenti. Questo modello di malattia consente lo sviluppo di strategie appropriate per affrontare la MGD e aiuta a determinare la corretta somministrazione di agenti antinfiammatori topici o sistemici che colpiscono componenti vitali nei percorsi che causano la malattia.
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Disclosures
Gli autori non hanno conflitti di interesse da rivelare.
Acknowledgments
Questo lavoro è stato parzialmente sostenuto dalla Fondazione tedesca per la ricerca (DFG) 2886 PANDORA Project-No.B3; SCHA 2040/1-1; MU 4240/2-1; CRC1181(C03); TRR241(B04), H2020-FETOPEN-2018-2020 Project 861878, e dalla Volkswagen-Stiftung (Grant 97744) a MH.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1x PBS | Gibco | ||
| Aluminium Hydroxide | Imject alum Adjuvant | 77161 | 40 mg/ mL Final Concentration: in vivo: 1 mg/ 100 µL |
| C57Bl/6 mice, aged 7–9 weeks | Charles River Laboratories | ||
| Calcium | Carl roth | CN93.1 | 1 M Final Concentration: 5 mM |
| Curved forceps | FST by Dumont SWITZERLAND | 5/45 11251-35 | |
| Fine sharp scissor | FST Stainless steel, Germany | 15001-08 | |
| Laminar safety cabinet | Herasafe | ||
| Macrophotography Camera | Canon | EOS6D | |
| Macrophotography Camera (without IR filter) | Nikon | D5300 | |
| Mnase | New England biolabs | M0247S | 2 x 106 gel U/mL |
| Multi-analyte flow assay kit (Custom mouse 13-plex panel) | Biolegend | CLPX-200421AM-UERLAN | |
| NaCl 0,9% (Saline) | B.Braun | ||
| Ovalbumin (OVA) | Endofit, Invivogen | 9006-59-1 | 10 mg/200 µL in saline |
| Pertussis toxin | ThermoFisher Scientific | PHZ1174 | 50 µg/ 500 µL in saline Final Concentration: in vivo: 100 µg/ 100 µL |
| Petridish | Greiner bio-one | 628160 | |
| Scalpel | Feather disposable scalpel | No. 21 | Final Concentration: in vivo: 300 ng/ 100 µL |
| Stereomicroscope | Zeiss | Stemi508 | |
| Syringe (corneal/iris washing) | BD Microlane | 27 G x 3/4 - Nr.20 0,4 x 19 mm | |
| Syringe (i.p immunization) | BD Microlane | 24 G1"-Nr 17, 055* 25 mm |
References
- Gilbard, J. P., Rossi, S. R., Heyda, K. G. Tear film and ocular surface changes after closure of the meibomian gland orifices in the rabbit. Ophthalmology. 96 (8), 1180-1186 (1989).
- Mishima, S., Maurice, D. M. The oily layer of the tear film and evaporation from the corneal surface. Experimental Eye Research. 1, 39-45 (1961).
- Gipson, I. K. The ocular surface: The challenge to enable and protect vision: The Friedenwald lecture. Investigative Ophthalmology and Visual Science. 48 (10), 4391-4398 (2007).
- Hahn, J., et al. Aggregated neutrophil extracellular traps resolve inflammation by proteolysis of cytokines and chemokines and protection from antiproteases. The FASEB Journal. 33 (1), 1401-1414 (2019).
- Leppkes, M., et al. Vascular occlusion by neutrophil extracellular traps in COVID-19. EBioMedicine. 58, 102925 (2020).
- Munoz, L. E., et al. Neutrophil extracellular traps initiate gallstone formation. Immunity. 51 (3), 443-450 (2019).
- Schapher, M., et al. Neutrophil extracellular traps promote the development and growth of human salivary stones. Cells. 9 (9), 2139 (2020).
- Mahajan, A., et al. Frontline science: Aggregated neutrophil extracellular traps prevent inflammation on the neutrophil-rich ocular surface. Journal of Leukocyte Biology. 105 (6), 1087-1098 (2019).
- DEWS Definition and Classification Subcommittee. The definition and classification of dry eye disease: Report of the Definition and Classification Subcommittee of the International Dry Eye Workshop. The Ocular Surface. 5 (2), 75-92 (2007).
- Nichols, K. K., et al. The international workshop on meibomian gland dysfunction: Executive summary. Investigative Ophthalmology and Visual Science. 52 (4), 1922-1929 (2011).
- Mahajan, A., et al. Aggregated neutrophil extracellular traps occlude Meibomian glands during ocular surface inflammation. The Ocular Surface. 20, 1-12 (2021).
- Jester, B. E., Nien, C. J., Winkler, M., Brown, D. J., Jester, J. V. Volumetric reconstruction of the mouse meibomian gland using high-resolution nonlinear optical imaging. The Anatomical Record. 294 (2), 185-192 (2011).
- Nien, C. J., et al.
- Parfitt, G. J., Xie, Y., Geyfman, M., Brown, D. J., Jester, J. V. Absence of ductal hyper-keratinization in mouse age-related meibomian gland dysfunction (ARMGD). Aging. 5 (11), 825-834 (2013).
- Lambert, R. W., Smith, R. E. Pathogenesis of blepharoconjunctivitis complicating 13-cis-retinoic acid (isotretinoin) therapy in a laboratory model. Investigative Ophthalmology and Visual Science. 29 (10), 1559-1564 (1988).
- Jester, J. V., Nicolaides, N., Kiss-Palvolgyi, I., Smith, R. E. Meibomian gland dysfunction. II. The role of keratinization in a rabbit model of MGD. Investigative Ophthalmology and Visual Science. 30 (5), 936-945 (1989).
- Jester, J. V., et al. In vivo biomicroscopy and photography of meibomian glands in a rabbit model of meibomian gland dysfunction. Investigative Ophthalmology and Visual Science. 22 (5), 660-667 (1982).
- Lambert, R., Smith, R. E. Hyperkeratinization in a rabbit model of meibomian gland dysfunction. American Journal of Ophthalmology. 105 (6), 703-705 (1988).
- Knop, E., Knop, N., Millar, T., Obata, H., Sullivan, D. A. The international workshop on meibomian gland dysfunction: Report of the subcommittee on anatomy, physiology, and pathophysiology of the meibomian gland. Investigative Ophthalmology and Visual Science. 52 (4), 1938-1978 (2011).
- Huang, W., Tourmouzis, K., Perry, H., Honkanen, R. A., Rigas, B. Animal models of dry eye disease: Useful, varied and evolving (Review). Experimental and Therapeutic Medicine. 22 (6), 1394 (2021).
- Reyes, N. J., et al. Neutrophils cause obstruction of eyelid sebaceous glands in inflammatory eye disease in mice. Science Translational Medicine. 10 (451), (2018).
- Knop, E., Korb, D. R., Blackie, C. A., Knop, N. The lid margin is an underestimated structure for preservation of ocular surface health and development of dry eye disease. Developments in Ophthalmology. 45, 108-122 (2010).
- Knop, N., Knop, E. Meibomian glands. Part I: anatomy, embryology and histology of the Meibomian glands. Ophthalmologe. 106 (10), 872-883 (2009).
- Nien, C. J., et al. Effects of age and dysfunction on human meibomian glands. Archives of Ophthalmology. 129 (4), 462-469 (2011).
- Lio, C. T., Dhanda, S. K., Bose, T. Cluster analysis of dry eye disease models based on immune cell parameters - New insight into therapeutic perspective. Frontiers in Immunology. 11, 1930 (2020).
- Nguyen, D. D., Luo, L. J., Lai, J. Y. Thermogels containing sulfated hyaluronan as novel topical therapeutics for treatment of ocular surface inflammation. Materials Today Bio. 13, 100183 (2022).
- Lin, P. H., et al. Alleviation of dry eye syndrome with one dose of antioxidant, anti-inflammatory, and mucoadhesive lysine-carbonized nanogels. Acta Biomaterialia. 141, 140-150 (2022).
- Yu, D., et al. Loss of beta epithelial sodium channel function in meibomian glands produces pseudohypoaldosteronism 1-like ocular disease in mice. American Journal of Pathology. 188 (1), 95-110 (2018).
- Mauris, J., et al. Loss of CD147 results in impaired epithelial cell differentiation and malformation of the meibomian gland. Cell Death & Disease. 6 (4), 1726 (2015).
- Ibrahim, O. M., et al. Oxidative stress induced age dependent meibomian gland dysfunction in Cu, Zn-superoxide dismutase-1 (Sod1) knockout mice. PloS One. 9 (7), 99328 (2014).
- McMahon, A., Lu, H., Butovich, I. A. A role for ELOVL4 in the mouse meibomian gland and sebocyte cell biology. Investigative Ophthalmology and Visual Science. 55 (5), 2832-2840 (2014).
- Miyake, H., Oda, T., Katsuta, O., Seno, M., Nakamura, M. Meibomian gland dysfunction model in hairless mice fed a special diet with limited lipid content. Investigative Ophthalmology and Visual Science. 57 (7), 3268-3275 (2016).
- Schaumberg, D. A., et al. The international workshop on meibomian gland dysfunction: Report of the subcommittee on the epidemiology of, and associated risk factors for, MGD. Investigative Ophthalmology and Visual Science. 52 (4), 1994-2005 (2011).
- Lee, S. Y., et al. Analysis of tear cytokines and clinical correlations in Sjogren syndrome dry eye patients and non-Sjogren syndrome dry eye patients. American Journal of Ophthalmology. 156 (2), 247-253 (2013).
- Nakae, S., et al. Antigen-specific T cell sensitization is impaired in IL-17-deficient mice, causing suppression of allergic cellular and humoral responses. Immunity. 17 (3), 375-387 (2002).
- von Vietinghoff, S., Ley, K. IL-17A controls IL-17F production and maintains blood neutrophil counts in mice. Journal of Immunology. 183 (2), 865-873 (2009).
- Langrish, C. L., et al. IL-23 drives a pathogenic T cell population that induces autoimmune inflammation. Journal of Experimental Medicine. 201 (2), 233-240 (2005).
- Chen, Y., et al. Anti-IL-23 therapy inhibits multiple inflammatory pathways and ameliorates autoimmune encephalomyelitis. Journal of Clinical Investigation. 116 (5), 1317-1326 (2006).
