Summary
La inflamación de la superficie ocular daña los tejidos de la superficie ocular y compromete las funciones vitales del ojo. El presente protocolo describe un método para inducir inflamación ocular y recolectar tejidos comprometidos en un modelo de ratón de disfunción de la glándula de Meibomio (MGD).
Abstract
Las enfermedades de la superficie ocular incluyen una variedad de trastornos que alteran las funciones y estructuras de la córnea, la conjuntiva y la red de glándulas de la superficie ocular asociada. Las glándulas de Meibomio (MG) secretan lípidos que crean una capa de cobertura que evita la evaporación de la parte acuosa de la película lagrimal. Neutrófilos y trampas de ADN extracelular pueblan MG y la superficie ocular en un modelo de ratón de enfermedad ocular alérgica. Las trampas extracelulares agregadas de neutrófilos (aggNET) formulan una matriz en forma de malla compuesta de cromatina extracelular que ocluye las salidas de MG y condiciona la disfunción de MG. Aquí, se presenta un método para inducir inflamación de la superficie ocular y disfunción de MG. Los procedimientos para recolectar órganos relacionados con la superficie ocular, como la córnea, la conjuntiva y los párpados, se describen en detalle. Utilizando técnicas establecidas para procesar cada órgano, también se muestran las principales características morfológicas e histopatológicas de la disfunción de MG. Los exudados oculares ofrecen la oportunidad de evaluar el estado inflamatorio de la superficie ocular. Estos procedimientos permiten la investigación de intervenciones antiinflamatorias tópicas y sistémicas a nivel preclínico.
Introduction
Cada parpadeo de un ojo repone la suave película lagrimal dispersa sobre la córnea. Los epitelios de la superficie ocular facilitan la distribución y correcta orientación de la película lagrimal sobre la superficie ocular. Las mucinas son proporcionadas por la córnea y las células epiteliales de la conjuntiva para ayudar a colocar la parte acuosa de la película lagrimal proveniente de las glándulas lagrimales en la superficie de los ojos. Finalmente, la MG secreta lípidos que crean una capa de recubrimiento que evita la evaporación de la parte acuosa de la película lagrimal 1,2,3. De esta manera, las funciones coordinadas de todos los órganos oculares protegen la superficie ocular de patógenos invasores o lesiones y apoyan una visión cristalina sin ningún dolor o molestia.
En una superficie ocular sana, la secreción ocular que fluye o el reuma ocular barre el polvo, las células epiteliales muertas, las bacterias, el moco y las células inmunitarias. Las trampas extracelulares agregadas de neutrófilos (aggNET) formulan una matriz en forma de malla compuesta de cromatina extracelular e incorporan estos componentes en el reuma del ojo. Los AggNET resuelven la inflamación por la degradación proteolítica de citoquinas y quimiocinas proinflamatorias4. Sin embargo, cuando se vuelven disfuncionales, estos aggNET aberrantes impulsan la patogénesis de enfermedades como las oclusiones vasculares en COVID-195, cálculos biliares6 y sialolitiasis7. Del mismo modo, los aggNET en la superficie ocular desempeñan un papel protector y contribuyen a resolver la inflamación de la superficie altamente expuesta8. Una formación exagerada o la falta de aggNET en la superficie ocular pueden afectar la estabilidad de la película lagrimal y / o causar heridas corneales, conjuntivitis cicatrizante y enfermedad del ojo seco. Por ejemplo, la obstrucción de la MG es una de las principales causas de enfermedad del ojo seco9. También se sabe que los AggNET tapan el flujo de secreción de lípidos de los conductos de MG y causan disfunción de la glándula de Meibomio (MGD). La congestión de los orificios de MG por aggNETs causa una falta de líquido graso que envuelve la superficie ocular y líquido retrógrado embotellado, lo que resulta en disfunción de la función de la glándula y daño acinar. Esta disfunción puede provocar evaporación de la película lagrimal, fibrosis de los márgenes de los párpados, inflamación ocular y daño perjudicial a la MG10,11.
Varios modelos animales se han desarrollado a lo largo de los años para imitar el proceso patológico de MGD en humanos. Por ejemplo, los ratones C57BL/6 de 1 año de edad han ayudado a estudiar los efectos relacionados con la edad sobre la enfermedad del ojo seco (DED) y la MGD, reflejando la patología de la enfermedad ocular en pacientes de 50 años o más12,13,14. Además, los conejos son modelos apropiados para investigar los efectos de las intervenciones farmacológicas. Por lo tanto, la inducción de MGD en conejos ha sido reportada por la administración tópica de epinefrina o la introducción sistémica de ácido 13-cis-retinoico (isotretinoína)15,16,17,18,19.
Aunque estos modelos animales fueron adecuados para determinar los diferentes factores que contribuyen a la fisiopatología de la DGM, fueron restringidos en su utilización. Por ejemplo, el modelo murino de DGM relacionado con la edad era ideal para descifrar elementos solo en adultos mayores y, por lo tanto, los conejos parecían ser el modelo animal más adecuado para estudiar las enfermedades de la superficie ocular, ya que permiten la investigación de múltiples mecanismos fisiopatológicos. Sin embargo, debido a la falta de herramientas analíticas integrales para detectar proteínas en la superficie ocular y debido a que muchas partes del genoma del conejo no están anotadas, están limitadas para las investigaciones20,21.
Además, estos modelos animales utilizados para investigar la patogénesis de la enfermedad del ojo seco no proporcionaron detalles adecuados para analizar el brazo inmunológico del trastorno que instiga la inflamación de la superficie ocular. En consecuencia, el modelo murino de DGM desarrollado por Reyes et al. mostró una asociación entre la enfermedad ocular alérgica en ratones y la DGM en humanos y destacó la etiología inmune responsable de la MGD obstructiva21. Este modelo asocia la enfermedad ocular alérgica con una respuesta TH17 que recluta neutrófilos a la conjuntiva y al párpado, causando DGM e inflamación ocular crónica21. La inducción de DGM e inflamación ocular en este modelo murino es una herramienta valiosa para investigar eventos aguas arriba durante el desarrollo de inflamación local impulsada por una respuesta inmune continua21. El protocolo actual describe la inflamación de la superficie ocular acompañada de DGM obstructiva. En este método, los ratones son inmunizados y, después de 2 semanas, desafiados en la superficie ocular con el inmunógeno durante 7 días. Además, se describen los pasos para aislar el exudado ocular y los órganos oculares asociados durante la inflamación aguda y la disección de la córnea, la conjuntiva y los párpados.
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Protocol
Todos los procedimientos con animales se llevaron a cabo de acuerdo con las directrices institucionales sobre bienestar animal y aprobadas por la comisión de bienestar animal de la Universidad Friedrich-Alexander Erlangen-Nuremberg (FAU) (número de permiso: 55.2.2-2532-2-1217). Para el presente estudio se utilizaron ratones hembra C57Bl/6, de 7 a 9 semanas de edad. Los ratones se obtuvieron de fuentes comerciales (ver Tabla de materiales) y se mantuvieron en condiciones específicas libres de patógenos con ciclos de día / noche de 12 h.
1. Inducción de inflamación murina de la superficie ocular
- Realizar la preparación de inmunógenos para la inmunización.
- Preparar el inmunógeno recién el día de la inmunización, mezclando ovoalbúmina (OVA, 50 mg/ml) y toxina pertussis (100 μg/ml) en solución salina y el hidróxido de aluminio adyuvante (40 mg/ml) (ver Tabla de materiales) en una proporción de 1:1.
PRECAUCIÓN: Realice la apertura, reconstitución y preparación de inmunógenos de la toxina pertussis en un gabinete de seguridad laminar. Use ropa protectora y evite cualquier contacto con la piel. - Incubar la mezcla de inmunógeno y adyuvante a temperatura ambiente durante 30 min y cargar 100 μL en una jeringa de 1 ml.
- Realizar la inyección intraperitoneal de la solución de inmunógeno en un ratón no anestesiado.
- Sostenga el mouse suavemente por la cola mientras agarra la rejilla de la jaula. Sostenga firmemente la piel de la espalda y la región del cuello entre el pulgar y el índice y fije la cola y las extremidades inferiores entre el dedo anular y meñique contra la palma de la mano.
- Mantenga el ratón fijo con la cabeza hacia abajo.
- Inyecte 100 μL de la solución de inmunógeno preparada en el cuadrante derecho o izquierdo de la cavidad abdominal inferior.
- Preparar el inmunógeno recién el día de la inmunización, mezclando ovoalbúmina (OVA, 50 mg/ml) y toxina pertussis (100 μg/ml) en solución salina y el hidróxido de aluminio adyuvante (40 mg/ml) (ver Tabla de materiales) en una proporción de 1:1.
- Realizar la exposición a la superficie ocular 2 semanas después de la inmunización.
- Anestesiar al ratón con isoflurano (2,5%).
- Aplique 5 μL de OVA (50 mg/ml) o solución salina (0,9 % de NaCl) por ojo en ambos ojos y espere hasta que la gota sea absorbida por el ojo. Esto toma ~ 5 min.
- Repita el procedimiento 1 veces al día durante 7 días.
NOTA: La administración tópica de medicamentos se puede hacer de la misma manera.
2. Recolección de exudados oculares
- Recuperar los exudados oculares formados durante la fase de provocación aplicando 50 μL de solución salina estéril en el ojo inmediatamente después de la provocación.
- Para obtener una suspensión unicelular, tratar la secreción ocular recogida con MNasa recombinante (2 x 106 gel U/mL, ver Tabla de materiales) que contiene el cofactor calcio (5 mM) a 37 °C durante 20 min.
- Centrifugar a 400 x g durante 7 min a temperatura ambiente.
- Aísle el sobrenadante y mida las citocinas y quimiocinas utilizando ELISA multiplexado de acuerdo con las instrucciones del fabricante (consulte la Tabla de materiales).
NOTA: El sobrenadante obtenido se puede utilizar para el análisis de proteínas y el pellet para ensayos funcionales como inmunofenotipado, fagocitosis, degranulación y expresión génica.
3. Escisión de los tejidos de la superficie ocular
- Disecciona los párpados y el globo ocular siguiendo los pasos a continuación.
- Eutanasia del ratón por asfixia deCO2 y luxación cervical.
- Coloque el ratón sobre una superficie uniforme.
- Desinfecte el área orbitaria alrededor del ojo con un hisopo impregnado con etanol al 70%.
- Haga una incisión entre la oreja y el seno retroorbitario y a lo largo de la superficie por encima del hueso escamoso verticalmente, extendiendo la incisión horizontalmente debajo del párpado inferior a lo largo del hueso maxilar y por encima del párpado superior a lo largo del hueso frontal. Esto forma una incisión alrededor del ojo (Figura 1).
- Sostenga cuidadosamente el tejido disecado alrededor del ojo con pinzas curvas y saque el tejido y el globo ocular.
- Coloque los órganos extirpados en PBS estéril.
- Recorte el exceso de tejido muscular facial alrededor de los párpados superiores extirpados con un bisturí y bajo el microscopio estereoscópico.
- Recoge la conjuntiva siguiendo los pasos a continuación.
- Coloque el párpado superior sobre una placa de Petri seca bajo el microscopio estereoscópico.
- Usando pinzas finas y un bisturí, retire la capa blanquecina-mucosa muy suavemente de la superficie interna del párpado.
- A continuación, disecciona la córnea siguiendo los pasos a continuación.
- Coloque el globo ocular en una nueva placa de Petri seca sobre hielo seco durante 3 minutos.
- Coloque la placa de Petri sobre la superficie del banco en una posición estable.
- Haga una pequeña incisión en el borde de la córnea junto al limbo con tijeras finas y afiladas.
- Prolongar la incisión con el bisturí alrededor del globo ocular, separando la esclerótica de la córnea.
- Retire los restos del iris y el cristalino de la parte posterior de la córnea enjuagando generosamente con solución salina.
4. Documentación de la obstrucción de la glándula de Meibomio (MG)
- Para evaluar el MG y sus orificios, coloque los párpados extirpados en posición vertical bajo el microscopio estereoscópico (Figura 2).
- Capture imágenes con epiiluminación de luz blanca de acuerdo con el tiempo de exposición de la cámara y la configuración ISO.
NOTA: El análisis morfométrico de estas imágenes proporciona una cuantificación fiable del tamaño del tapón en la salida de las glándulas. La cuantificación se puede realizar delineando con la herramienta varita los tapones oculares y ejecutando el comando "Analizar partículas" del software Image J (ver Tabla de materiales).
5. Transiluminación de párpados (morfología de la glándula de Meibomio)
- Para evaluar el área de MG, coloque los párpados extirpados en posición horizontal y encienda la retroiluminación del estereomicroscopio equipado con una cámara infrarroja (Figura 3).
- Capture imágenes ajustando el tiempo de exposición de acuerdo con el ISO de la cámara (consulte la Tabla de materiales).
NOTA: Las imágenes infrarrojas de estos párpados transiluminados bajo el microscopio estereoscópico pueden ayudar a medir la forma y el tamaño de cada acino. El análisis morfométrico de estas imágenes proporciona una cuantificación fiable del tamaño y número de MG. La cuantificación se puede realizar delineando el MG con la herramienta varita y ejecutando el comando "Analizar partículas" del software Image J.
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Representative Results
El presente protocolo describe los pasos secuenciales para establecer un modelo murino de inflamación de la superficie ocular. Los protocolos tienen como objetivo mostrar cómo aplicar la terapéutica localmente, obtener exudados oculares y extirpar órganos accesorios asociados, como párpados sanos e inflamados (Figura 2), la córnea y la conjuntiva. Se debe prestar atención cuando se diseccionan los párpados superiores para el aislamiento de la conjuntiva, y debe almacenarse en 1x PBS durante la disección de la córnea. Esto evitará el secado de la conjuntiva, que se puede utilizar para estudios histológicos, farmacocinéticos y de expresión génica.
OVA y solución salina se aplicaron tópicamente durante 7 días consecutivos siguiendo el protocolo mencionado anteriormente. Los ratones desafiados tópicamente con solución salina mostraron una superficie ocular saludable con los ojos muy abiertos y un patrón de parpadeo regular. Sin embargo, la inflamación ocular se instigó en ratones C57BL / 6J inmunizados desafiados con OVA. La instilación de la solución OVA en la superficie ocular causó picazón, y no dolor, durante las primeras 2 horas después de la instilación. El exudado y el eccema del párpado se observaron solo durante los últimos 3 días de la fase de desafío. No se evidenciaba ningún dolor, a juzgar por el comportamiento de los animales. Por lo tanto, se asumió un nivel moderado de estrés para los ratones durante un corto período de tiempo. El desafío diario de OVA desencadenó manifestaciones clínicas como secreción ocular abundante, quemosis y apertura estrecha de los ojos. Además, los párpados superiores e inferiores se adhirieron frecuentemente entre sí, perjudicando la función esencial del parpadeo (Figura 2). Se siguieron criterios estrictos de interrupción (Archivo Suplementario) para este modelo y fueron aprobados por la junta ética local para la experimentación animal. La interrupción inmediata se llevaba a cabo si un ratón alcanzaba los 15 puntos en un momento dado.
Expediente complementario. Haga clic aquí para descargar este archivo.
Después de la eutanasia, los órganos oculares fueron extirpados y se observaron con mayor aumento. Los párpados extirpados bajo un microscopio mostraron grandes oclusiones taponando los orificios de la MG y el edema, en marcado contraste con los párpados sanos que muestran pequeños tapones de la glándula que recubre el párpado (Figura 3).
Un examen más detallado de la transiluminación infrarroja de la glándula revela la apariencia racémica de los acinos de la MG. Esto permite cuantificar las glándulas de Meibomio visibles (indicadas en rojo). Los párpados de ratones con desafíos salinos mostraron los acinos redondos formando el MG. En comparación, la aplicación de OVA indujo la destrucción y pérdida de alguna MG en ratones con enfermedad ocular alérgica (FAE, Figura 4). El análisis histológico de los párpados mostró MG dilatada en comparación con ratones naïve administrados solo con solución salina durante 7 días (Figura 5), permitiendo la acumulación de neutrófilos produciendo aggNETs que finalmente obstruyen los orificios de la glándula.
Separar la córnea de la esclerótica del ojo puede ser engorroso debido a la superficie mucosa resbaladiza del globo ocular. La incubación del globo ocular en hielo seco en una placa de Petri durante 3 minutos permite fijar el ojo, hacer una pequeña incisión en el limbo y diseccionar la córnea (Figura 6).
Los pasos enlistados en la sección de protocolo facilitaron la recolección de la córnea y la conjuntiva. Además, la administración local de OVA infligió inflamación severa a la conjuntiva, con apariencia hiperémica (Figura 7).
El análisis de los exudados oculares revela mecanismos moleculares en el desarrollo de la DGM. La cuantificación de citoquinas y quimiocinas como se describe mostró niveles elevados de la quimiocina principal que facilita la extravasación de neutrófilos, fagocitosis y desgranulación (CXCL-1) en los sobrenadantes de ratones con FAE8. Además, el mediador principal de la respuesta de fase aguda y la producción de neutrófilos, IL-6, también se elevó significativamente en ratones con FAE. Por otro lado, la concentración de IL-10, una citoquina antiinflamatoria, no mostró cambios significativos tanto en ratones naïve como en AED (Figura 8).
Figura 1: Escisión del tejido facial que rodea la región orbitaria. El rastro de incisión está indicado en rojo. Esto permite extirpar los órganos oculares e investigar la influencia y los efectos de diversas terapias administradas tópicamente en órganos oculares accesorios como la conjuntiva y la córnea. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 2: La administración de OVA causa manifestaciones clínicas de MGD . (A) Los ratones a los que se les administró solución salina muestran una superficie ocular sana con los ojos bien abiertos. (B) La aplicación de OVA induce inflamación severa de la superficie ocular, la abertura estrecha de los ojos y signos de quemosis. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 3: Tapones ductales que obstruyen las glándulas de Meibomio (MG) ubicadas a lo largo de los párpados. (A) Fotografía macro representativa de un párpado sano sin secreción ocular excesiva de un ratón administrado solución salina durante 7 días solamente. (B) Párpado que muestra grandes oclusiones ductales de la MG y edema después del período de provocación. Barra de escala = 300 μm. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 4: La macrofotografía transiluminadora permite la visualización de los acinos (líneas rojas) del MG. (A) La mejora de los niveles infrarrojos visualiza los acinos sanos de ratones ingenuos y revela los distintos acinos en forma de bolsillo en los párpados sanos. (B) Los acinos aparecen gruesos en los párpados afectados de los ratones con la aplicación de OVA. Barra de escala = 100 μm. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 5: El análisis histológico de los párpados muestra conductos dilatados de MG en ratones con insulto OVA repetido durante 7 días. (A) Los párpados de ratón ingenuos muestran la ausencia de conductos dilatados, lo que representa un órgano ocular saludable y funcional (B) en contraste con los ratones con desafío OVA. Barra de escala = 200 μm. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 6: Incisión en la córnea junto al limbo y separación de la córnea de la esclerótica. Imagen del globo ocular que muestra el punto de incisión (indicado por flecha blanca). Barra de escala = 500 μm. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 7: Administración local de OVA . (A) Macro fotografías de órganos oculares murinos que muestran la córnea. Barra de escala: 600 μm. (B) Conjuntiva inflamada de ratones desafiados con OVA. Barra de escala: 100 μm. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 8: Medición de marcadores inflamatorios en los exudados oculares recogidos. Análisis cuantitativo de citoquinas y quimiocinas en el sobrenadante del exudado ocular centrifugado de ratones naïve (n = 7) y ratones con MGD (n = 8). Los datos se expresan como mediana con un rango de 5% -95%. La significación estadística se calculó mediante la prueba U de Mann-Whitney de dos colas. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
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Discussion
La secreción oleosa de las glándulas de Meibomio es de gran importancia para un ojo sano22. Sin embargo, la obstrucción de estas glándulas sebáceas por trampas extracelulares agregadas de neutrófilos (aggNETs) que se alinean como hebras paralelas ubicadas en las placas tarsales de ambos párpados puede alterar la película lagrimal23. Esta alteración resulta en disfunción de la glándula de Meibomio (DGM)1 y evaporación lagrimal acelerada y condiciona el daño de la superficie ocular2. Este protocolo describe el establecimiento de inflamación de la superficie ocular mediada por el sistema inmune que conduce a la obstrucción de la MG.
Los estudios de modelos de ratón han confirmado los mecanismos inmunes subyacentes que causan la obstrucción de MG asociada con la inflamación de la superficie ocular. Una respuesta TH17 robusta que recluta neutrófilos en el modelo de ratón de FAE y un aumento de neutrófilos y otras células mieloides en el líquido lagrimal de pacientes con MGD indica el papel de los neutrófilos que obstruyen la MG21. La presencia de aggNET que ocluyen los orificios MG se confirmó con peptidil arginina deiminasa 4 en ratones con FAE. En este modelo, los neutrófilos mostraron una capacidad disminuida para agregarse y formaron aggNET que obstruyeron los conductos y orificios de las glándulas MG10. Además, el análisis lagrimal de pacientes con DGM mostró un aumento de la anafilatoxina C5a y la quimiocina IL-8, lo que demuestra una mayor actividad del sistema del complemento y una alta afluencia de infiltración de neutrófilos. Finalmente, un aumento en el nivel de citoquinas asociadas con varias funciones de neutrófilos, como IL-6, IL-18, MCP-1 / CCL-2 y MIG / CXCL9, subraya la posición principal de los neutrófilos en la patogénesis de MGD11.
La ocurrencia de DGM es un contribuyente significativo para el desarrollo de DED, y examinar el papel de los numerosos elementos involucrados en la patogénesis de las manifestaciones oculares es complicado24. Por lo tanto, la selección de animales como modelos está fuertemente influenciada por la cuestión bajo investigación. Por ejemplo, los conejos sirven como modelos convencionales para pruebas farmacéuticas de formulaciones; Los modelos felino, porcino y canino son adecuados para investigar características patológicas similares a los pacientes humanos, y los ratones son adecuados principalmente para la manipulación genética25.
Los modelos animales son herramientas valiosas para investigar la patogénesis de la enfermedad y examinar la eficacia terapéutica de diversas intervenciones in vivo. Por ejemplo, los tratamientos convencionales incluyen la administración de instilaciones de gotas oculares para tratar las manifestaciones oculares clínicas; Sin embargo, debido al flujo lagrimal y al sistema de drenaje lagrimal, tales intervenciones oculares se eliminan rápidamente de la superficie ocular. Esto causa solo una acción temporal y requiere administraciones repetidas y dosis altas. Para resolver este problema, el modelo de conejo de la enfermedad del ojo seco (DED) sirvió como el medio ideal para examinar termogeles y nanogeles carbonizados (GNC) como tratamientos tópicos alternativos. Los termogeles obtenidos mediante la conjugación de diferentes grados de sulfatación de ácido hialurónico y un poli terminado en amina (N-isopropil acrilamida), cuando se administran al ojo, se transforman en un gel. En el modelo de conejo de DED, este gel fue retenido por más tiempo, y una sola gota reparó el epitelio corneal dañado, detuvo la apoptosis y reprimió la inflamación ocular durante un seguimiento de 7 días, sugiriendo una interrupción en la infiltración leucocitaria debido a la inhibición de la interacción leucocitaria mediada por selectina26.
Además, en el modelo de conejo de DED, los nanogeles carbonizados (GNC) como gotas para los ojos mostraron eliminación de radicales libres tratando la deficiencia lagrimal y la evaporación excesiva de lágrimas causada por una respuesta inflamatoria exacerbada y estrés oxidativo. Los GNC se obtuvieron a través de la pirólisis de clorhidrato de lisina (Lys-CNG) y se administraron, y una dosis única mitigó los síntomas de DED en 4 días. Un efecto terapéutico similar solo se pudo lograr con varios tratamientos de una cantidad 10 veces mayor de instilaciones de gotas oculares de ciclosporina A. Estas nuevas intervenciones farmacéuticas biocompatibles mostraron perspectivas superiores como intervenciones de dosis única y retención ocular más prolongada en modelos animales preclínicos27.
La eliminación de varios genes en modelos de ratón ha revelado el papel de múltiples proteínas implicadas en la patogénesis de la MGD. Por ejemplo, la expresión génica desregulada del receptor gamma activado por proliferador de peroxisomas (PPAR γ)24 y las alteraciones en su vía de señalización inducen cambios en la entrada/proliferación del ciclo celular, la síntesis de lípidos y la atrofia de la glándula de Meibomio durante el envejecimiento13. Además, la ausencia del βENaC (canal epitelial de sodio β) en un modelo de ratón indicó que el fenotipo de disfunción MG prevalente en mujeres se asoció con atrofia de MG y obstrucción del orificio como en humanos con pseudohipoaldosteronismo 1(PHA)28. El papel esencial de CD147 también fue dilucidado en ratones, y se cree que mantiene el rico contenido lipídico de los meibocitos29. Los ratones deficientes para la enzima superóxido dismutasa 1 mostraron un daño elevado en los lípidos oxidativos y el ADN, lo que se relacionó con un aumento en la inflamación de MG30. Finalmente, una sola mutación en el ELOVL4 que codifica la enzima necesaria para sintetizar residuos de ácidos grasos de cadena extremadamente larga que forman el lipidoma meibum conduce a cambios funcionales en la superficie ocular anterior31. Curiosamente, la DGM también fue inducida en ratones con una dieta especial con composición lipídica incompleta para evaluar la eficacia terapéutica de la azitromicina como formulación oftálmica32.
Si bien la mayoría de los estudios que emplean modelos de ratón han identificado varios genes involucrados en la MGD, muchos carecen de una condición inmunológica subyacente. El modelo FAE proporciona toda una gama de posibles intervenciones desde la inducción de la respuesta inmune, la generación de anticuerpos IgE y la fase efectora, acompañada de varios cambios patológicos que se asemejan a la MGD evaporativa humana.
Al investigar la DGM utilizando el protocolo mencionado, es crucial agregar inmunógeno (OVA y toxina pertussis) al alumbre en una proporción de 1: 1. Se debe incubar la mezcla durante 30 minutos a temperatura ambiente para una buena adsorción de la toxina ovoalbúmina-tos ferina al alumbre. Estas interacciones son vitales para desencadenar una respuesta inmune adecuada. Además, durante la inmunización, se debe prestar atención al inyectar, ya que esto puede provocar la perforación de los órganos subyacentes de la cavidad peritoneal. Esto puede resultar en una inmunización inadecuada e inflamación sistémica en el ratón, con efectos profundos en la respuesta inmune.
Los exudados oculares son grandes estructuras de cromatina extracelular en forma de red que enjaulan las células inmunitarias infiltradas. Por lo tanto, el tratamiento de MNase de los exudados oculares recolectados de este modelo es vital para obtener suspensiones unicelulares11. Además, estos exudados son fáciles de recoger en la superficie ocular y son una fuente de neutrófilos viables que han transmigrado de la circulación. La principal limitación de esta técnica es la cantidad de exudado que se recoge de las superficies oculares. La adición de 50 μL de solución salina a cada ojo permite la recuperación de hasta 100 μL de exudado de un ratón. Esto es apenas suficiente para tinciones de citometría de flujo 1-2 (FACS) y sobrenadantes para estudios bioquímicos.
La disección con un bisturí para luego depilarse el ojo y los tejidos circundantes a menudo puede causar lesiones en la vena temporal superficial, la vena palpebral inferior o la vena angular ocular. Se recomienda crear una incisión en la piel con menos profundidad alrededor del ojo, ya que el sangrado puede interferir con preparaciones histológicas adicionales. Durante la disección de un tejido, almacenar otros tejidos en PBS es esencial ya que el secado o la lubricación insuficiente pueden provocar la pérdida de características estructurales.
Durante la disección de la córnea del globo ocular, si la incubación del globo ocular en hielo seco no permite un control constante, se puede extender el tiempo hasta 5 minutos para que sea posible la incisión en el limbo y la separación de la córnea.
Aplicaciones potenciales
La inflamación de la superficie ocular asociada con MGD es una enfermedad multifactorial. El desarrollo y la progresión de la disfunción en estas glándulas secretoras de lípidos puede ser causada por factores oftálmicos, sistémicos, hormonales y genéticos, productos químicos, fármacos, agentes nocivos mecánicos y respuestas inmunológicas33. Varios estudios han reportado neutrófilos causando oclusión de las glándulas de Meibomio e inflamación 11,21,34,35,36,37,38. El desarrollo de intervenciones antiinflamatorias tópicas y sistémicas que interfieran con estas vías inmunológicas puede ofrecer alivio a los pacientes que sufren molestias oculares debido a la MGD. El modelo murino de enfermedad ocular alérgica se puede utilizar en un entorno preclínico para investigar las propiedades farmacocinéticas y farmacodinámicas de estos agentes. Este modelo de enfermedad permite el desarrollo de estrategias apropiadas para abordar la MGD y ayuda a determinar la administración adecuada de agentes antiinflamatorios tópicos o sistémicos que se dirigen a componentes vitales en las vías causantes de la enfermedad.
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Disclosures
Los autores no tienen conflictos de intereses que revelar.
Acknowledgments
Este trabajo fue parcialmente apoyado por la Fundación Alemana de Investigación (DFG) 2886 Proyecto PANDORA-No.B3; SCHA 2040/1-1; MU 4240/2-1; CRC1181(C03); TRR241(B04), H2020-FETOPEN-2018-2020 Project 861878, y por la Volkswagen-Stiftung (subvención 97744) a MH.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1x PBS | Gibco | ||
| Aluminium Hydroxide | Imject alum Adjuvant | 77161 | 40 mg/ mL Final Concentration: in vivo: 1 mg/ 100 µL |
| C57Bl/6 mice, aged 7–9 weeks | Charles River Laboratories | ||
| Calcium | Carl roth | CN93.1 | 1 M Final Concentration: 5 mM |
| Curved forceps | FST by Dumont SWITZERLAND | 5/45 11251-35 | |
| Fine sharp scissor | FST Stainless steel, Germany | 15001-08 | |
| Laminar safety cabinet | Herasafe | ||
| Macrophotography Camera | Canon | EOS6D | |
| Macrophotography Camera (without IR filter) | Nikon | D5300 | |
| Mnase | New England biolabs | M0247S | 2 x 106 gel U/mL |
| Multi-analyte flow assay kit (Custom mouse 13-plex panel) | Biolegend | CLPX-200421AM-UERLAN | |
| NaCl 0,9% (Saline) | B.Braun | ||
| Ovalbumin (OVA) | Endofit, Invivogen | 9006-59-1 | 10 mg/200 µL in saline |
| Pertussis toxin | ThermoFisher Scientific | PHZ1174 | 50 µg/ 500 µL in saline Final Concentration: in vivo: 100 µg/ 100 µL |
| Petridish | Greiner bio-one | 628160 | |
| Scalpel | Feather disposable scalpel | No. 21 | Final Concentration: in vivo: 300 ng/ 100 µL |
| Stereomicroscope | Zeiss | Stemi508 | |
| Syringe (corneal/iris washing) | BD Microlane | 27 G x 3/4 - Nr.20 0,4 x 19 mm | |
| Syringe (i.p immunization) | BD Microlane | 24 G1"-Nr 17, 055* 25 mm |
References
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