Summary
Воспаление глазной поверхности повреждает ткани глазной поверхности и ставит под угрозу жизненно важные функции глаза. Настоящий протокол описывает способ индуцирования воспаления глаз и сбора скомпрометированных тканей в мышиной модели дисфункции мейбомиевой железы (MGD).
Abstract
Заболевания глазной поверхности включают в себя ряд нарушений, которые нарушают функции и структуры роговицы, конъюнктивы и связанной с ними сети глазных поверхностных желез. Мейбомиевые железы (МГ) выделяют липиды, которые создают покровный слой, препятствующий испарению водной части слезной пленки. Нейтрофилы и внеклеточные ловушки ДНК заполняют MG и глазную поверхность в мышиной модели аллергического заболевания глаз. Агрегированные внеклеточные ловушки нейтрофилов (aggNETs) образуют сетчатую матрицу, состоящую из внеклеточного хроматина, который закупоривает выходы MG и кондиционирует дисфункцию MG. Здесь представлен метод индуцирования воспаления глазной поверхности и дисфункции МГ. Подробно описаны процедуры сбора органов, связанных с глазной поверхностью, таких как роговица, конъюнктива и веки. Используя устоявшиеся методики обработки каждого органа, также показаны основные морфологические и гистопатологические особенности дисфункции МГ. Глазные экссудаты дают возможность оценить воспалительное состояние глазной поверхности. Эти процедуры позволяют исследовать местные и системные противовоспалительные вмешательства на доклиническом уровне.
Introduction
Каждое мгновение глаза восполняет гладкую слезную пленку, рассеянную по роговице. Эпителий глазной поверхности способствует распределению и правильной ориентации слезной пленки на глазной поверхности. Муцины обеспечиваются эпителиальными клетками роговицы и конъюнктивы, чтобы помочь позиционировать водную часть слезной пленки, поступающей из слезных желез на поверхности глаз. Наконец, МГ выделяет липиды, которые создают покровный слой, препятствующий испарению водной части слезной пленки 1,2,3. Таким образом, скоординированные функции всех глазных органов защищают глазную поверхность от вторжения патогенов или травм и поддерживают кристально чистое зрение без какой-либо боли или дискомфорта.
В здоровой глазной поверхности глазные струящиеся выделения или ревматический ревмат глаза сметают пыль, мертвые эпителиальные клетки, бактерии, слизь и иммунные клетки. Агрегированные нейтрофильные внеклеточные ловушки (aggNETs) образуют сетчатую матрицу, состоящую из внеклеточного хроматина, и включают эти компоненты в ревматоз глаза. AggNETs устраняют воспаление путем протеолитической деградации провоспалительных цитокинов и хемокинов4. Однако, когда они становятся дисфункциональными, эти аберрантные аггНЕТы управляют патогенезом таких заболеваний, как окклюзия сосудов при COVID-195, камни в желчном пузыре6 и сиалолитиаз7. Аналогичным образом, aggNETs на поверхности глаза играют защитную роль и способствуют разрешению воспаления сильно открытой поверхности8. Либо преувеличенное образование, либо отсутствие aggNETs на поверхности глаза может ухудшить стабильность слезной пленки и / или вызвать раны роговицы, цикатризирующий конъюнктивит и болезнь сухого глаза. Например, обструкция МГ является основной причиной заболевания сухого глаза9. Также известно, что AggNETs закупоривают поток секреции липидов из протоков MG и вызывают дисфункцию мейбомиевой железы (MGD). Застой mg отверстий aggNET вызывает недостаток жировой жидкости, обволакивающей глазную поверхность, и ретроградную бутилированную жидкость, что приводит к дисфункции функции железы и повреждению ацинара. Эта дисфункция может привести к испарению слезной пленки, фиброзу краев на веках, воспалению глаз и вредному повреждению MG10,11.
На протяжении многих лет было разработано несколько животных моделей, чтобы имитировать патологический процесс MGD у людей. Например, мыши C57BL/6 в возрасте 1 года помогли изучить возрастные эффекты на болезнь сухого глаза (DED) и MGD, отражающие патологию глазного заболевания у пациентов в возрасте 50 лет и старше 12,13,14. Кроме того, кролики являются подходящими моделями для изучения эффектов фармакологических вмешательств. Таким образом, индуцирование МГД у кроликов было зарегистрировано либо путем местного введения адреналина, либо системного введения 13-цис-ретиноевой кислоты (изотретиноина)15,16,17,18,19.
Хотя эти животные модели были адекватны для определения различных факторов, способствующих патофизиологии MGD, они были ограничены в их использовании. Например, мышиная модель возрастного MGD идеально подходила для расшифровки элементов только у пожилых людей, и, следовательно, кролики оказались наиболее подходящей животной моделью для изучения заболеваний глазной поверхности, поскольку они позволяют исследовать множественные патофизиологические механизмы. Однако из-за отсутствия комплексных аналитических инструментов для обнаружения белков на поверхности глаза и из-за того, что многие части генома кролика неаннотированы, они ограничены для исследований20,21.
Кроме того, эти животные модели, используемые для исследования патогенеза заболевания сухого глаза, не предоставили адекватных деталей для анализа иммунологической ветви расстройства, которое вызывает воспаление глазной поверхности. Соответственно, мышиная модель MGD, разработанная Reyes et al., показала связь между аллергическим заболеванием глаз у мышей и MGD у людей и подчеркнула иммунную этиологию, ответственную за обструктивный MGD21. Эта модель связывает аллергическое заболевание глаз с ответом TH17, который набирает нейтрофилы в конъюнктиву и веко, вызывая MGD и хроническое воспаление глаз21. Индукция MGD и глазного воспаления в этой мышиной модели является ценным инструментом для исследования событий вверх по течению во время развития местного воспаления, вызванного продолжающимся иммунным ответом21. Текущий протокол описывает воспаление глазной поверхности, сопровождающееся обструктивным MGD. В этом методе мышей иммунизируют и через 2 недели оспаривают на глазной поверхности иммуногеном в течение 7 дней. Кроме того, описаны этапы выделения глазного экссудата и связанных с ним глазных органов при остром воспалении и рассечении роговицы, конъюнктивы и век.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Все процедуры с участием животных проводились в соответствии с институциональными руководящими принципами по благополучию животных и утверждались комиссией по благополучию животных Университета Фридриха-Александра Эрлангена-Нюрнберга (FAU) (номер разрешения: 55.2.2-2532-2-1217). Для настоящего исследования использовались самки мышей C57Bl/6 в возрасте 7-9 недель. Мышей получали из коммерческих источников (см. Таблицу материалов) и содержали в специфических условиях, свободных от патогенов, с 12-часовыми циклами день/ночь.
1. Индукция воспаления глазной поверхности мышей
- Выполняют иммуногенную подготовку к иммунизации.
- Готовят иммуноген заново в день иммунизации, смешивая овальбумин (OVA, 50 мг/мл) и токсин коклюша (100 мкг/мл) в физиологическом растворе и адъювантном гидроксиде алюминия (40 мг/мл) (см. Таблицу материалов) в пропорции 1:1.
ВНИМАНИЕ: Выполните вскрытие, восстановление и иммуногенную подготовку токсина коклюша в ламинарной палате безопасности. Носите защитную одежду и избегайте любого контакта с кожей. - Инкубировать смесь иммуногена и адъюванта при комнатной температуре в течение 30 мин и загрузить 100 мкл в шприц объемом 1 мл.
- Выполняют внутрибрюшинную инъекцию раствора иммуногена неанестезированной мыши.
- Держите мышь мягко за хвост, захватывая сетку клетки. Крепко держите кожу спины и области шеи между большим и указательным пальцами и зафиксируйте хвост и нижние конечности между кольцом и мизинцем против ладони.
- Держите неподвижную мышь головой вниз.
- Вводят 100 мкл приготовленного раствора иммуногена в правый или левый квадрант нижней части брюшной полости.
- Готовят иммуноген заново в день иммунизации, смешивая овальбумин (OVA, 50 мг/мл) и токсин коклюша (100 мкг/мл) в физиологическом растворе и адъювантном гидроксиде алюминия (40 мг/мл) (см. Таблицу материалов) в пропорции 1:1.
- Выполните исследование поверхности глаза через 2 недели после иммунизации.
- Обезболить мышь изофлураном (2,5%).
- Нанесите 5 мкл OVA (50 мг / мл) или физиологического раствора (0,9 % NaCl) на глаз на оба глаза и подождите, пока капля не будет поглощена глазом. Это занимает ~5 минут.
- Повторяйте процедуру 1 раз в день в течение 7 дней.
ПРИМЕЧАНИЕ: Местное введение лекарств может быть сделано таким же образом.
2. Коллекция глазных экссудатов
- Восстановите глазные экссудаты, образовавшиеся во время фазы вызова, применяя 50 мкл стерильного физиологического раствора к глазу сразу после вызова.
- Для получения одноклеточной суспензии обрабатывают собранные глазные выделения рекомбинантной МНазой (2 х 106 гелевых Ед/мл, см. Таблицу материалов), содержащей кофактор кальция (5 мМ) при 37 °С в течение 20 мин.
- Центрифуга при 400 х г в течение 7 мин при комнатной температуре.
- Выделяют супернатант и измеряют цитокины и хемокины с помощью мультиплексированного ИФА в соответствии с инструкциями производителя (см. Таблицу материалов).
ПРИМЕЧАНИЕ: Полученный супернатант может быть использован для анализа белка, а гранулы для функциональных анализов, таких как иммунофенотипирование, фагоцитоз, дегрануляция и экспрессия генов.
3. Иссечение тканей глазной поверхности
- Рассекните веки и глазной шар, следуя приведенным ниже шагам.
- Усыпляют мышь путем удушьяCO2 и вывиха шейки матки.
- Поместите мышь на ровную поверхность.
- Продезинфицируйте область орбиты вокруг глаза тампоном, пропитанным 70% этанолом.
- Сделайте разрез между ухом и ретроорбитальным синусом и вдоль поверхности над плоской костью вертикально, расширяя разрез горизонтально ниже нижнего века вдоль верхнечелюстной кости и над верхним веком вдоль лобной кости. Это образует разрез вокруг глаза (рисунок 1).
- Осторожно удерживайте рассеченную ткань вокруг глаза с помощью изогнутых щипцов и вытяните ткань и глазное яблоко.
- Поместите иссеченные органы в стерильный PBS.
- Обрежьте избыточную мышечную ткань лица вокруг иссеченных верхних век с помощью скальпеля и под стереомикроскопом.
- Соберите конъюнктиву, выполнив следующие действия.
- Поместите верхнее веко на сухую чашку Петри под стереомикроскоп.
- Используя тонкий пинцет и скальпель, очень аккуратно отшелушите беловато-слизистый слой с внутренней поверхности века.
- Затем рассекните роговицу, следуя приведенным ниже шагам.
- Поместите глазной шар на новую сухую чашку Петри поверх сухого льда на 3 минуты.
- Вынесите чашку Петри на поверхность скамейки в устойчивом положении.
- Сделайте небольшой разрез на границе роговицы рядом с лимбом с помощью мелких острых ножниц.
- Удлините разрез скальпелем вокруг глазного шара, отделив склеру от роговицы.
- Удалите остатки радужной оболочки и хрусталика с обратной стороны роговицы, щедро промыв солевым раствором.
4. Документирование обструкции мейбомиевой железы (МГ)
- Для оценки МГ и его отверстий поместите иссеченные веки в вертикальное положение под стереомикроскопом (рисунок 2).
- Снимайте изображения с помощью эпиосвещенности белым светом в соответствии со временем экспозиции камеры и настройками ISO.
ПРИМЕЧАНИЕ: Морфометрический анализ этих изображений обеспечивает надежную количественную оценку размера пробки на выходе из желез. Количественная оценка может быть выполнена путем очерчивания с помощью инструмента палочки глазных пробок и выполнения команды «Анализировать частицы» программного обеспечения Image J (см. Таблицу материалов).
5. Трансиллюминация век (морфология мейбомиевой железы)
- Чтобы оценить площадь MG, поместите иссеченные веки в горизонтальное положение и включите подсветку стереомикроскопа, оснащенного инфракрасной камерой (рисунок 3).
- Делайте снимки, регулируя время экспозиции в соответствии с ISO камеры (см. Таблицу материалов).
ПРИМЕЧАНИЕ: Инфракрасная визуализация этих трансиллюминированных век под стереомикроскопом может помочь измерить форму и размер каждого ацинума. Морфометрический анализ этих изображений обеспечивает достоверную количественную оценку размера и количества МГ. Количественная оценка может быть выполнена путем выделения MG с помощью инструмента палочки и выполнения команды «Analyze Particles» программного обеспечения Image J.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Настоящий протокол описывает последовательные шаги для установления мышиной модели воспаления глазной поверхности. Протоколы направлены на то, чтобы показать, как применять терапевтические средства локально, получать глазные экссудаты и иссекать связанные с ними вспомогательные органы, такие как здоровые и воспаленные веки (рисунок 2), роговица и конъюнктива. Необходимо обратить внимание, когда верхние веки рассечены для выделения конъюнктивы, и она должна храниться в 1x PBS во время рассечения роговицы. Это предотвратит высыхание конъюнктивы, которая может быть использована для гистологических, фармакокинетических и генных исследований экспрессии.
OVA и физиологический раствор применялись местно в течение 7 последовательных дней после вышеупомянутого протокола. Мыши, подвергшиеся местному воздействию физиологического раствора, показали здоровую глазную поверхность с широко открытыми глазами и регулярным миганием. Тем не менее, глазное воспаление было спровоцировано у иммунизированных мышей C57BL / 6J, которым была брошена проблема с OVA. Закапывание раствора OVA на глазную поверхность вызывало зуд, а не боль, в течение первых 2 часов после закапывания. Экссудатная и вековая экзема наблюдалась только в течение последних 3 дней фазы вызова. Никакой боли не было видно, судя по поведению животных. Поэтому предполагался умеренный уровень стресса для мышей в течение короткого периода времени. Ежедневный вызов OVA вызвал клинические проявления, такие как обильные глазные выделения, хемоз и узкое открытие глаз. Кроме того, верхнее и нижнее веки часто прилипали друг к другу, ухудшая основную функцию моргания (рисунок 2). Для этой модели были соблюдены строгие критерии прерывания (Дополнительный файл), которые были одобрены местным этическим советом для экспериментов на животных. Немедленное прерывание осуществлялось, если одна мышь достигала 15 точек в любой момент времени.
Дополнительный файл. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы загрузить этот файл.
После эвтаназии глазные органы иссекались и наблюдались при большем увеличении. Иссеченные веки под микроскопом показали большие окклюзии, закупоривающие отверстия MG и отек, в резком контрасте со здоровыми веками, показывающими небольшие пробки железы, выстилающей веко (рисунок 3).
Дальнейшее исследование инфракрасной трансиллюминации железы выявляет рацемический вид ацинумов МГ. Это позволяет количественно оценить видимые мейбомиевые железы (обозначены красным цветом). Веки мышей с физиологическим раствором показали круглые ацины, образующие MG. Для сравнения, применение OVA индуцировало разрушение и потерю некоторых МГ у мышей с аллергическим заболеванием глаз (AED, рисунок 4). Гистологический анализ век показал расширенный MG по сравнению с наивными мышами, которым вводили только физиологический раствор в течение 7 дней (рисунок 5), что позволяло накапливать нейтрофилы, продуцирующие aggNETs, которые в конечном итоге блокируют отверстия железы.
Отделение роговицы от склеры глаза может быть громоздким из-за скользкой слизистой поверхности глазного шара. Инкубация глазного яблока на сухом льду в чашке Петри в течение 3 мин позволяет зафиксировать глаз, сделать небольшой разрез на лимбе и рассечь роговицу (рисунок 6).
Шаги, перечисленные в протокольном разделе, облегчили сбор роговицы и конъюнктивы. Кроме того, местное введение ООВ вызывало сильное воспаление конъюнктивы, с гиперемичным видом (рисунок 7).
Анализ глазных экссудатов выявляет молекулярные механизмы в развитии МГД. Количественная оценка цитокинов и хемокинов, как описано, показала повышенные уровни основного хемокина, способствующего экстравазации нейтрофилов, фагоцитозу и дегрануляции (CXCL-1) в супернатантах у мышей с AED8. Кроме того, основной медиатор острой фазы ответа и производства нейтрофилов, IL-6, также был значительно повышен у мышей с AED. С другой стороны, концентрация IL-10, противовоспалительного цитокина, не показала существенных изменений как у наивных, так и у AED мышей (рисунок 8).
Рисунок 1: Иссечение тканей лица, окружающих орбитальную область. След разреза обозначен красным цветом. Это позволяет иссекать глазные органы и исследовать влияние и эффекты различных местно вводимых терапевтических средств на вспомогательные глазные органы, такие как конъюнктива и роговица. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 2: Введение OVA вызывает клинические проявления MGD. (A) Мыши, которым вводили физиологический раствор, показали здоровую глазную поверхность с широко открытыми глазами. (B) Применение OVA вызывает тяжелое воспаление глазной поверхности, узкое открытие глаз и признаки хемоза. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 3: Проточные пробки, препятствующие мейбомиевым железам (МГ), расположенным вдоль век. (A) Репрезентативная макрофотография здорового века без чрезмерных глазных выделений от мыши, вводимого физиологическим раствором только в течение 7 дней. (B) Веко, показывающее большие окклюзии протоков МГ и отек после периода вызова. Шкала = 300 мкм. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 4: Трансиллюминирующая макрофотография позволяет визуализировать ацины MG (красные линии). (A) Повышение инфракрасных уровней визуализирует здоровые ацины наивных мышей и раскрывает отчетливые карманные ацины в здоровых веках. (B) Ацины кажутся толстыми в пораженных веках мышей при применении OVA. Шкала = 100 мкм. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 5: Гистологический анализ век показывает расширенные протоки МГ у мышей с повторным оскорблением OVA в течение 7 дней. (A) Наивные веки мыши показывают отсутствие каких-либо расширенных протоков, изображая здоровый функционирующий глазной орган (B) в отличие от мышей с OVA challenge. Шкала = 200 мкм. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 6: Разрез на роговице рядом с лимбом и отделение роговицы от склеры. Изображение глазного яблока, показывающее точку разреза (обозначено белой стрелкой). Шкала = 500 мкм. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 7: Местное введение OVA. (A) Макроснимки мышиных глазных органов, показывающих роговицу. Шкала: 600 мкм. (B) Воспаленная конъюнктива от мышей, пораженных OVA. Шкала: 100 мкм. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 8: Измерение воспалительных маркеров в собранных глазных экссудатах. Количественный анализ цитокинов и хемокинов в супернатанте центрифугированного глазного экссудата наивных мышей (n=7) и мышей с МГД (n=8). Данные выражаются в виде медианы с диапазоном 5%-95%. Статистическая значимость была рассчитана с помощью двуххвостого U-теста Манна-Уитни. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Маслянистый секрет мейбомиевых желез имеет большое значение для здорового глаза22. Однако обструкция этих сальных желез агрегированными внеклеточными ловушками нейтрофилов (aggNETs), которые выстраиваются в виде параллельных нитей, расположенных на предплюсневых пластинах обоих век, может нарушить слезную пленку23. Это нарушение приводит к дисфункции мейбомиевой железы (MGD)1 и ускоренному испарению слезы и обусловливает повреждение поверхности глаза2. Этот протокол описывает установление иммуноопосредованного воспаления поверхности глаза, которое приводит к обструкции MG.
Исследования на мышиных моделях подтвердили основные иммуноопосредованные механизмы, вызывающие обструкцию MG, связанную с воспалением поверхности глаза. Надежный ответ TH17, рекрутирующий нейтрофилы в мышиной модели AED и увеличение нейтрофилов и других миелоидных клеток в слезной жидкости пациентов с MGD, указывает на роль нейтрофилов, препятствующих MG21. Наличие aggNETs, закупоривающих отверстия MG, было подтверждено пептидиларгининдейминазой 4 у мышей с AED. В этой модели нейтрофилы показали уменьшенную способность агрегировать и образовывать aggNETs, которые блокировали протоки и отверстия MG желез10. Кроме того, анализ слез у пациентов с МГД показал увеличение анафилатоксина С5а и хемокина IL-8, демонстрируя повышенную активность системы комплемента и высокий приток нейтрофильной инфильтрации. Наконец, повышение уровня цитокинов, связанных с несколькими функциями нейтрофилов, такими как IL-6, IL-18, MCP-1 / CCL-2 и MIG / CXCL9, подчеркивает основное положение нейтрофилов в патогенезе MGD11.
Возникновение МГД является значительным вкладчиком в развитие ДДД, а изучение роли многочисленных элементов, участвующих в патогенезе глазных проявлений, осложняется24. Поэтому на выбор животных в качестве моделей сильно влияет исследуемый вопрос. Например, кролики служат обычными моделями для фармацевтических испытаний составов; Кошачьи, свиные и собачьи модели подходят для исследования патологических характеристик, сходных с человеческими пациентами, а мыши подходят в первую очередь для генетических манипуляций25.
Животные модели являются ценными инструментами для исследования патогенеза заболеваний и изучения терапевтической эффективности различных вмешательств in vivo. Например, обычные методы лечения включают введение инстилляций глазных капель для лечения клинических глазных проявлений; однако из-за слезного потока и слезной дренажной системы такие глазные вмешательства быстро удаляются с глазной поверхности. Это вызывает лишь временные действия и требует повторных введений и высоких доз. Чтобы решить эту проблему, кроличья модель болезни сухого глаза (DED) служила идеальной средой для изучения термогелей и карбонизированных наногелей (CNG) в качестве альтернативных местных методов лечения. Термогели, полученные путем конъюгирования различных степеней сульфатации гиалуроновой кислоты и амино-концевого поли (N-изопропилакриламида), при введении в глаз превращаются в гель. В кроличьей модели DED этот гель сохранялся в течение более длительного времени, и одна капля восстанавливала поврежденный эпителий роговицы, останавливала апоптоз и подавляла глазное воспаление в течение последующего наблюдения в течение 7 дней, предполагая прерывание инфильтрации лейкоцитов из-за ингибирования селектин-опосредованного лейкоцитарного взаимодействия26.
Кроме того, в кроличьей модели DED карбонизированные наногели (CNG) в виде глазных капель показали удаление свободных радикалов, леча дефицит слезы и чрезмерное испарение слезы, вызванное обострением воспалительной реакции и окислительным стрессом. ЦНГ получали путем пиролиза лизина гидрохлорида (Lys-CNGs) и вводили, а однократная доза смягчала симптомы DED в течение 4 дней. Аналогичный терапевтический эффект был достижим только при нескольких процедурах 10-кратного увеличения количества циклоспорина А глазных капель. Эти новые биосовместимые фармацевтические вмешательства продемонстрировали превосходные перспективы в виде однодозовых вмешательств и более длительного удержания глаз в доклинических моделяхживотных 27.
Нокаут нескольких генов в мышиных моделях раскрыл роль нескольких белков, участвующих в патогенезе MGD. Например, нерегулируемая экспрессия гена рецептора-гамма-рецептора, активированного пролифератором пероксисом (PPAR γ)24 , и изменения в его сигнальном пути вызывают изменения во входе/пролиферации клеточного цикла, синтезе липидов и атрофии мейбомиевой железы во время старения13 лет. Кроме того, отсутствие βENaC (β - эпителиального натриевого канала) в мышиной модели указывало на то, что фенотип дисфункции МГ, распространенный у женщин, был связан с атрофией МГ и обструкцией отверстий, как у людей с псевдогипоальдостеронизмом 1(PHA)28. Существенная роль CD147 также была выяснена у мышей, и считается, что он поддерживает богатое содержание липидов в мейбоцитах29. У мышей с дефицитом фермента супероксиддисмутазы 1 наблюдалось повышенное окислительное повреждение липидов и ДНК, что было связано с увеличением воспаления MG30. Наконец, одна мутация в ELOVL4, кодирующая фермент, необходимый для синтеза чрезвычайно длинноцепочечных остатков жирных кислот, образующих липидом мейбума, приводит к функциональным изменениям в передней глазной поверхности31. Интересно, что MGD также индуцировали у мышей со специальной диетой с неполным липидным составом для оценки терапевтической эффективности азитромицина в качестве офтальмологического препарата32.
В то время как большинство исследований с использованием мышиных моделей выявили несколько генов, участвующих в MGD, во многих из них отсутствует основное иммунологическое состояние. Модель AED предоставляет целый ряд возможных вмешательств от индукции иммунного ответа, генерации антител IgE и эффекторной фазы, сопровождающихся несколькими патологическими изменениями, напоминающими испарительный MGD человека.
При исследовании MGD с использованием упомянутого протокола крайне важно добавить иммуноген (OVA и токсин коклюша) к квасцам в пропорции 1: 1. Следует инкубировать смесь в течение 30 мин при комнатной температуре для хорошей адсорбции овальбумин-коклюшного токсина к квасцам. Эти взаимодействия жизненно важны для запуска адекватного иммунного ответа. Кроме того, во время иммунизации необходимо уделять внимание при инъекциях, так как это может привести к перфорации нижележащих органов брюшной полости. Это может привести к неадекватной иммунизации и системному воспалению у мышей, что оказывает глубокое влияние на иммунный ответ.
Глазные экссудаты представляют собой большие паутиноподобные внеклеточные структуры хроматина, которые проникают в клетку иммунных клеток. Поэтому обработка МНаз собранными глазными экссудатами из этой модели имеет жизненно важное значение для получения одноклеточных суспензий11. Кроме того, эти экссудаты легко собираются на поверхности глаза и являются источником жизнеспособных нейтрофилов, которые трансмигрировали из циркуляции. Основным ограничением этого метода является количество экссудата, которое должно быть собрано с глазных поверхностей. Добавление 50 мкл физиологического раствора к каждому глазу позволяет восстановить до 100 мкл экссудата у одной мыши. Этого едва хватает для окрашиваний 1-2 проточной цитометрии (FACS) и супернатантов для биохимических исследований.
Рассечение скальпелем для последующего выщипывания глаза и окружающих тканей часто может привести к повреждению поверхностной височной вены, нижней пальпебральной вены или глазной угловой вены. Рекомендуется создавать разрез в коже с меньшей глубиной вокруг глаза, так как кровотечение может мешать дальнейшим гистологическим препаратам. Во время рассечения одной ткани хранение других тканей в PBS имеет важное значение, поскольку высыхание или недостаточная смазка может привести к потере структурных особенностей.
Во время рассечения роговицы от глазного шара, если инкубация глазного шара на сухом льду не позволяет обеспечить устойчивый контроль, можно продлить время до 5 мин, чтобы был возможен разрез на лимбе и отделение роговицы.
Потенциальные области применения
Воспаление глазной поверхности, связанное с MGD, является многофакторным заболеванием. Развитие и прогрессирование дисфункции в этих железах, секретирующих липиды, может быть вызвано офтальмологическими, системными, гормональными и генетическими факторами, химическими веществами, лекарственными средствами, механическими вредными агентами и иммунологическими реакциями33. В нескольких исследованиях сообщалось о нейтрофилах, вызывающих окклюзию мейбомиевых желез и воспаление 11,21,34,35,36,37,38. Разработка местных и системных противовоспалительных вмешательств, которые мешают этим иммунологическим путям, может предложить облегчение пациентам, страдающим от глазного дискомфорта из-за MGD. Мышиная модель аллергического заболевания глаз может быть использована в доклинических условиях для исследования фармакокинетических и фармакодинамических свойств этих агентов. Эта модель заболевания позволяет разработать соответствующие стратегии для борьбы с MGD и помогает определить правильное введение местных или системных противовоспалительных агентов, которые нацелены на жизненно важные компоненты в болезнетворных путях.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
У авторов нет конфликта интересов для раскрытия.
Acknowledgments
Эта работа была частично поддержана Немецким исследовательским фондом (DFG) 2886 PANDORA Project-No.B3; ГАК 2040/1-1; МУ 4240/2-1; CRC1181(C03); Проект TRR241(B04), H2020-FETOPEN-2018-2020 861878, а Также Фондом Volkswagen (грант 97744) для MH.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1x PBS | Gibco | ||
| Aluminium Hydroxide | Imject alum Adjuvant | 77161 | 40 mg/ mL Final Concentration: in vivo: 1 mg/ 100 µL |
| C57Bl/6 mice, aged 7–9 weeks | Charles River Laboratories | ||
| Calcium | Carl roth | CN93.1 | 1 M Final Concentration: 5 mM |
| Curved forceps | FST by Dumont SWITZERLAND | 5/45 11251-35 | |
| Fine sharp scissor | FST Stainless steel, Germany | 15001-08 | |
| Laminar safety cabinet | Herasafe | ||
| Macrophotography Camera | Canon | EOS6D | |
| Macrophotography Camera (without IR filter) | Nikon | D5300 | |
| Mnase | New England biolabs | M0247S | 2 x 106 gel U/mL |
| Multi-analyte flow assay kit (Custom mouse 13-plex panel) | Biolegend | CLPX-200421AM-UERLAN | |
| NaCl 0,9% (Saline) | B.Braun | ||
| Ovalbumin (OVA) | Endofit, Invivogen | 9006-59-1 | 10 mg/200 µL in saline |
| Pertussis toxin | ThermoFisher Scientific | PHZ1174 | 50 µg/ 500 µL in saline Final Concentration: in vivo: 100 µg/ 100 µL |
| Petridish | Greiner bio-one | 628160 | |
| Scalpel | Feather disposable scalpel | No. 21 | Final Concentration: in vivo: 300 ng/ 100 µL |
| Stereomicroscope | Zeiss | Stemi508 | |
| Syringe (corneal/iris washing) | BD Microlane | 27 G x 3/4 - Nr.20 0,4 x 19 mm | |
| Syringe (i.p immunization) | BD Microlane | 24 G1"-Nr 17, 055* 25 mm |
References
- Gilbard, J. P., Rossi, S. R., Heyda, K. G. Tear film and ocular surface changes after closure of the meibomian gland orifices in the rabbit. Ophthalmology. 96 (8), 1180-1186 (1989).
- Mishima, S., Maurice, D. M. The oily layer of the tear film and evaporation from the corneal surface. Experimental Eye Research. 1, 39-45 (1961).
- Gipson, I. K. The ocular surface: The challenge to enable and protect vision: The Friedenwald lecture. Investigative Ophthalmology and Visual Science. 48 (10), 4391-4398 (2007).
- Hahn, J., et al. Aggregated neutrophil extracellular traps resolve inflammation by proteolysis of cytokines and chemokines and protection from antiproteases. The FASEB Journal. 33 (1), 1401-1414 (2019).
- Leppkes, M., et al. Vascular occlusion by neutrophil extracellular traps in COVID-19. EBioMedicine. 58, 102925 (2020).
- Munoz, L. E., et al. Neutrophil extracellular traps initiate gallstone formation. Immunity. 51 (3), 443-450 (2019).
- Schapher, M., et al. Neutrophil extracellular traps promote the development and growth of human salivary stones. Cells. 9 (9), 2139 (2020).
- Mahajan, A., et al. Frontline science: Aggregated neutrophil extracellular traps prevent inflammation on the neutrophil-rich ocular surface. Journal of Leukocyte Biology. 105 (6), 1087-1098 (2019).
- DEWS Definition and Classification Subcommittee. The definition and classification of dry eye disease: Report of the Definition and Classification Subcommittee of the International Dry Eye Workshop. The Ocular Surface. 5 (2), 75-92 (2007).
- Nichols, K. K., et al. The international workshop on meibomian gland dysfunction: Executive summary. Investigative Ophthalmology and Visual Science. 52 (4), 1922-1929 (2011).
- Mahajan, A., et al. Aggregated neutrophil extracellular traps occlude Meibomian glands during ocular surface inflammation. The Ocular Surface. 20, 1-12 (2021).
- Jester, B. E., Nien, C. J., Winkler, M., Brown, D. J., Jester, J. V. Volumetric reconstruction of the mouse meibomian gland using high-resolution nonlinear optical imaging. The Anatomical Record. 294 (2), 185-192 (2011).
- Nien, C. J., et al.
- Parfitt, G. J., Xie, Y., Geyfman, M., Brown, D. J., Jester, J. V. Absence of ductal hyper-keratinization in mouse age-related meibomian gland dysfunction (ARMGD). Aging. 5 (11), 825-834 (2013).
- Lambert, R. W., Smith, R. E. Pathogenesis of blepharoconjunctivitis complicating 13-cis-retinoic acid (isotretinoin) therapy in a laboratory model. Investigative Ophthalmology and Visual Science. 29 (10), 1559-1564 (1988).
- Jester, J. V., Nicolaides, N., Kiss-Palvolgyi, I., Smith, R. E. Meibomian gland dysfunction. II. The role of keratinization in a rabbit model of MGD. Investigative Ophthalmology and Visual Science. 30 (5), 936-945 (1989).
- Jester, J. V., et al. In vivo biomicroscopy and photography of meibomian glands in a rabbit model of meibomian gland dysfunction. Investigative Ophthalmology and Visual Science. 22 (5), 660-667 (1982).
- Lambert, R., Smith, R. E. Hyperkeratinization in a rabbit model of meibomian gland dysfunction. American Journal of Ophthalmology. 105 (6), 703-705 (1988).
- Knop, E., Knop, N., Millar, T., Obata, H., Sullivan, D. A. The international workshop on meibomian gland dysfunction: Report of the subcommittee on anatomy, physiology, and pathophysiology of the meibomian gland. Investigative Ophthalmology and Visual Science. 52 (4), 1938-1978 (2011).
- Huang, W., Tourmouzis, K., Perry, H., Honkanen, R. A., Rigas, B. Animal models of dry eye disease: Useful, varied and evolving (Review). Experimental and Therapeutic Medicine. 22 (6), 1394 (2021).
- Reyes, N. J., et al. Neutrophils cause obstruction of eyelid sebaceous glands in inflammatory eye disease in mice. Science Translational Medicine. 10 (451), (2018).
- Knop, E., Korb, D. R., Blackie, C. A., Knop, N. The lid margin is an underestimated structure for preservation of ocular surface health and development of dry eye disease. Developments in Ophthalmology. 45, 108-122 (2010).
- Knop, N., Knop, E. Meibomian glands. Part I: anatomy, embryology and histology of the Meibomian glands. Ophthalmologe. 106 (10), 872-883 (2009).
- Nien, C. J., et al. Effects of age and dysfunction on human meibomian glands. Archives of Ophthalmology. 129 (4), 462-469 (2011).
- Lio, C. T., Dhanda, S. K., Bose, T. Cluster analysis of dry eye disease models based on immune cell parameters - New insight into therapeutic perspective. Frontiers in Immunology. 11, 1930 (2020).
- Nguyen, D. D., Luo, L. J., Lai, J. Y. Thermogels containing sulfated hyaluronan as novel topical therapeutics for treatment of ocular surface inflammation. Materials Today Bio. 13, 100183 (2022).
- Lin, P. H., et al. Alleviation of dry eye syndrome with one dose of antioxidant, anti-inflammatory, and mucoadhesive lysine-carbonized nanogels. Acta Biomaterialia. 141, 140-150 (2022).
- Yu, D., et al. Loss of beta epithelial sodium channel function in meibomian glands produces pseudohypoaldosteronism 1-like ocular disease in mice. American Journal of Pathology. 188 (1), 95-110 (2018).
- Mauris, J., et al. Loss of CD147 results in impaired epithelial cell differentiation and malformation of the meibomian gland. Cell Death & Disease. 6 (4), 1726 (2015).
- Ibrahim, O. M., et al. Oxidative stress induced age dependent meibomian gland dysfunction in Cu, Zn-superoxide dismutase-1 (Sod1) knockout mice. PloS One. 9 (7), 99328 (2014).
- McMahon, A., Lu, H., Butovich, I. A. A role for ELOVL4 in the mouse meibomian gland and sebocyte cell biology. Investigative Ophthalmology and Visual Science. 55 (5), 2832-2840 (2014).
- Miyake, H., Oda, T., Katsuta, O., Seno, M., Nakamura, M. Meibomian gland dysfunction model in hairless mice fed a special diet with limited lipid content. Investigative Ophthalmology and Visual Science. 57 (7), 3268-3275 (2016).
- Schaumberg, D. A., et al. The international workshop on meibomian gland dysfunction: Report of the subcommittee on the epidemiology of, and associated risk factors for, MGD. Investigative Ophthalmology and Visual Science. 52 (4), 1994-2005 (2011).
- Lee, S. Y., et al. Analysis of tear cytokines and clinical correlations in Sjogren syndrome dry eye patients and non-Sjogren syndrome dry eye patients. American Journal of Ophthalmology. 156 (2), 247-253 (2013).
- Nakae, S., et al. Antigen-specific T cell sensitization is impaired in IL-17-deficient mice, causing suppression of allergic cellular and humoral responses. Immunity. 17 (3), 375-387 (2002).
- von Vietinghoff, S., Ley, K. IL-17A controls IL-17F production and maintains blood neutrophil counts in mice. Journal of Immunology. 183 (2), 865-873 (2009).
- Langrish, C. L., et al. IL-23 drives a pathogenic T cell population that induces autoimmune inflammation. Journal of Experimental Medicine. 201 (2), 233-240 (2005).
- Chen, Y., et al. Anti-IL-23 therapy inhibits multiple inflammatory pathways and ameliorates autoimmune encephalomyelitis. Journal of Clinical Investigation. 116 (5), 1317-1326 (2006).
