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Isolamento e Identificação de Bactérias Resistentes a Antibióticos Transmitidos pela Água e Caracterização Molecular de seus Genes de Resistência a Antibióticos

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DOI:

10.3791/63934

⸱

3 de março de 2023

 , 
1Antimicrobial Research (AMR) Lab, Department of Biotechnology, University of Mumbai

Neste artigo

Resumo

Aqui, apresentamos um protocolo detalhado para o isolamento e identificação de bactérias resistentes a antibióticos da água e a caracterização molecular de seus genes de resistência a antibióticos (ARGs). O uso de técnicas baseadas em cultura e não baseadas em cultura (análise metagenômica) fornece informações completas sobre a diversidade bacteriana total e o pool total de diferentes ARGs presentes em águas doces de Mumbai, Índia.

Resumo

O desenvolvimento e disseminação da resistência aos antibióticos (RA) através da microbiota associada a corpos de água doce é uma grande preocupação de saúde global. No presente estudo, amostras de água doce foram coletadas e analisadas com relação à diversidade bacteriana total e aos genes AR (ARGs) usando técnicas convencionais baseadas em cultura e uma abordagem metagenômica independente de cultura de alto rendimento. Este trabalho apresenta um protocolo sistemático para a enumeração das bactérias cultiváveis totais e resistentes a antibióticos de amostras de água doce e a determinação da resistência fenotípica e genotípica em isolados cultiváveis. Além disso, relatamos o uso de análise metagenômica completa do DNA metagenômico total extraído da amostra de água doce para a identificação da diversidade bacteriana geral, incluindo bactérias não cultiváveis, e a identificação do pool total de diferentes ARGs (resistoma) no corpo d'água. Seguindo esses protocolos detalhados, observamos uma alta carga bacteriana resistente a antibióticos na faixa de 9,6 × 10 5-1,2 × 109 UFC/mL. A maioria dos isolados foi resistente aos múltiplos antibióticos testados, incluindo cefotaxima, ampicilina, levofloxacina, cloranfenicol, ceftriaxona, gentamicina, neomicina, trimetoprima e ciprofloxacina, com múltiplos índices de resistência a antibióticos (MAR) de ≥0,2, indicando altos níveis de resistência nos isolados. O sequenciamento do RNAr 16S identificou potenciais patógenos humanos, como Klebsiella pneumoniae, e bactérias oportunistas, como Comamonas spp., Micrococcus spp., Arthrobacter spp. e Aeromonas spp. A caracterização molecular dos isolados mostrou a presença de vários ARGs, como blaTEM, blaCTX-M (β-lactâmicos), aadA, aac (6')-Ib (aminoglicosídeos) e dfr1 (trimetoprims), o que também foi confirmado por toda a análise metagenômica de DNA. Uma alta prevalência de outros ARGs que codificam bombas de efluxo de antibióticos - mtrA, macB, mdtA, acrD, β-lactamases-SMB-1, VIM-20, ccrA, ampC, blaZ, o gene da cloranfenicol acetiltransferase catB10 e o gene de resistência à rifampicina rphB - também foi detectada no DNA metagenômico. Com a ajuda dos protocolos discutidos neste estudo, confirmamos a presença de bactérias MAR transmitidas pela água com diversas características fenotípicas e genotípicas da RA. Assim, a análise metagenômica completa do DNA pode ser usada como uma técnica complementar às técnicas convencionais baseadas em cultura para determinar o status geral de RA de um corpo d'água.

Introdução

A resistência antimicrobiana (RAM) tem sido identificada como um dos problemas globais mais prementes. A rápida evolução da RAM e a sua propagação mundial são uma das maiores ameaças à saúde humana e à economia global em termos dos custos de saúde que lhe estão associados1. O uso excessivo e indevido de antibióticos levaram a um aumento da RA. Isso foi destacado pela pandemia de COVID-19, durante a qual o tratamento de infecções secundárias associadas, em muitos casos, foi extremamente comprometido devido à RAM nos pacientes afetados2. Além do uso/uso indevido direto de antibióticos por seres humanos, o uso excessivo e indevido de antibióticos na agricultura e pecuária e sua descarga inadequada no meio ambiente, incluindo corpos d'água, são uma grande preocupação3. O surgimento de novas características de resistência e multirresistência em bactérias destaca urgentemente a necessidade de uma melhor compreensão dos fatores que levam ao desenvolvimento da RA e sua disseminação. Múltiplas bactérias resistentes a antibióticos, que muitas vezes carregam múltiplos genes AR (ARGs) em elementos genéticos móveis, como plasmídeos, podem transferir esses genes de resistência para microrganismos não resistentes, incluindo potenciais patógenos humanos, levando ao surgimento de superbactérias que são intratáveis mesmo com antibióticos de último recurso4. Essas múltiplas bactérias resistentes a antibióticos, se presentes nos ecossistemas aquáticos, podem entrar diretamente no intestino humano através do consumo de alimentos contaminados à base de água, como peixes, caranguejos e moluscos. Estudos anteriores mostraram que a disseminação de bactérias RA em sistemas de água que ocorrem naturalmente também pode atingir outros suprimentos de água, incluindo água potável, e, assim, pode entrar na cadeia alimentar humana 5,6,7.

O objetivo do presente estudo é fornecer um protocolo abrangente usando uma combinação de técnicas baseadas em cultura e não baseadas em cultura (análise metagenômica completa) para obter informações completas sobre a diversidade bacteriana total e o pool total de diferentes ARGs presentes em um corpo d'água em Mumbai, Índia. Convencionalmente, técnicas baseadas em cultura têm sido usadas para estudar a diversidade bacteriana em corpos d'água. Como os microrganismos cultiváveis constituem apenas uma pequena porcentagem da microbiota total em qualquer nicho, para ter uma melhor compreensão do status geral da diversidade bacteriana e das várias características resistentes prevalentes em qualquer amostra, várias técnicas baseadas em cultura e independentes da cultura devem ser usadas em conjunto. Uma dessas técnicas robustas e confiáveis independentes de cultura é a análise metagenômica completa do DNA. Esse método de alto rendimento tem sido utilizado com sucesso em diversos estudos sobre diversidade bacteriana ou anotações funcionais de vários ARGs 8,9. Esta técnica utiliza o metagenoma (o material genético total de uma amostra) como matéria-prima para várias análises e, por isso, é independente da cultura. Os protocolos do presente estudo podem ser utilizados para análise metagenômica completa de DNA para obtenção de informações sobre a diversidade bacteriana total e vários ARGs (resistoma) em amostras de água.

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Protocolo

1. Recolha e processamento de amostras

  1. Coleta de amostras
    1. Recolher o volume adequado da amostra de água no(s) recipiente(s) de amostra estéril(s), assegurando que não mais de 3/4 do recipiente estão cheios.
    2. Transportar as amostras para o laboratório em condições assépticas o mais rapidamente possível após a colheita e processá-las imediatamente.
  2. Processamento de amostras
    1. Filtre assepticamente a amostra de água através de um pano de musselina estéril para remover qualquer material particulado.
    2. Efectuar diluições em série adequadas da água filtrada para uma análise mais aprofundada.

2. Estimativa da carga bacteriana total e da contagem de bactérias resistentes a antibióticos

  1. Determinação da carga bacteriana total
    1. Suspender 18,12 g de Agar R2A, pó modificado em 1.000 mL de água duplamente destilada e dissolver a mistura por aquecimento. Autoclave a mistura dissolvida a 121 °C, 15 psi por 20 min. Prepare o ágar R2A, Placas modificadas derramando a quantidade apropriada da mistura autoclavada em placas de Petri estéreis (por exemplo, adicione aproximadamente 20 mL de meio estéril autoclavado a uma placa de Petri estéril de 90 mm).
    2. Espalhar uniformemente 100 μL das diluições apropriadas da amostra de água filtrada no ágar R2A, placa modificada uma vez que o meio se solidifica. Execute o experimento em duplicata.
    3. Incubar todas as placas acima a 35-37 °C durante 48 h (variar a temperatura e o tempo de incubação dependendo do meio utilizado para o isolamento).
    4. Exprimir a carga bacteriana total em termos de unidades formadoras de colónias por mililitro (UFC/ml) utilizando a equação (1):
      figure-protocol-1(1)
  2. Determinação da contagem bacteriana de RA
    1. Siga as etapas 2.1.1-2.1.4. No entanto, em vez de Agar R2A, placas modificadas, use ágar R2A, placas modificadas suplementadas individualmente com cinco antibióticos diferentes, a saber, cefotaxima (3 μg/mL), ciprofloxacina (0,5 μg/mL), eritromicina (20 μg/mL), canamicina (15 μg/mL) e vancomicina (3 μg/mL).
    2. Adicionar os antibióticos separadamente em tubos contendo 20 ml de ágar R2A fundido estéril, modificado (com a temperatura do ágar R2A fundido, modificado a ≤40 °C) para atingir a concentração final do antibiótico, tal como mencionado na etapa 2.2.1.
    3. Redemoinho para misturar uniformemente e despeje em placas de Petri estéreis antes que o ágar se solidifique. Execute o experimento em duplicata.
    4. Incubar todas as placas acima a 35-37 °C durante 48 h (se utilizar um meio diferente, a temperatura e o tempo de incubação podem variar).
    5. Para controle de qualidade e verificação da eficácia dos antibióticos, espalhe 100 μL de suspensões bacterianas das cepas Escherichia coli ATCC 25922 e Staphylococcus aureus ATCC 29213 em suas respectivas placas R2A contendo antibióticos, Placas modificadas (certifique-se de que a densidade da cultura fresca usada para a inoculação seja OD = 0,5 a 600 nm).
    6. Determinar a contagem bacteriana resistente aos antibióticos em termos de UFC/ml, conforme descrito no passo 2.1.4.
  3. Existências de glicerol dos isolados
    1. Selecione colônias de RA morfologicamente distintas.
    2. Suspender uma única colônia isolada em 2 mL de caldo estéril de Luria-Bertani contendo o respectivo antibiótico (por exemplo, se uma colônia foi selecionada de uma placa contendo cefotaxima, inocular a colônia a partir da etapa 2.3.1 em caldo estéril de Luria-Bertani contendo cefotaxima em sua respectiva concentração).
    3. Incubar os tubos inoculados a 37 °C a 80 rpm até que o OD600 atinja 0,5.
    4. Preparar as reservas de glicerol dos isolados misturando 750 μL da suspensão de cultura da fase 2.3.3 em 250 μL de glicerol estéril a 100% em condições assépticas.
    5. Conservar as existências de glicerol a -80 °C até uma análise mais aprofundada.
      NOTA: Para o renascimento das culturas das unidades populacionais de glicerol, descongelar as reservas de glicerol a 4 °C. Inocular uma alça deste estoque em 2 mL de caldo estéril de Luria-Bertani contendo o respectivo antibiótico e deixe crescer.

3. Identificação de bactérias cultiváveis por sequenciamento do gene 16S rRNA

  1. Preparação do molde de DNA dos isolados para PCR
    NOTA: O protocolo descrito para a preparação do molde de DNA para PCR para o isolamento do DNA bruto das bactérias é dado por Carlson et al.10.
    1. Usando um palito de dente estéril, pegue uma única colônia isolada e pura do isolado que cresce em uma placa de Petri. Suspender a colônia bacteriana em 100 μL de água estéril duplamente destilada em um tubo de microcentrífuga estéril e ferver por 10 min.
    2. Centrifugar a suspensão a 10.000 × g durante 2 minutos para peletizar os detritos e transferir o sobrenadante para um tubo de microcentrífuga estéril fresco para utilização como molde de ADN bruto.
  2. Amplificação por PCR direcionada da região V3 do gene 16S rRNA e sequenciamento
    1. Preparar 40 μL da mistura de reação em um tubo de PCR para amplificação por PCR, conforme mencionado na Tabela 1.
      NOTA: A preparação do DNA deve ser realizada em um bloco de gelo, minimizando a chance de contaminação (use luvas ao manusear os reagentes e limpe a superfície de trabalho completamente com etanol a 70%).
    2. Coloque o tubo no bloco térmico e execute o programa apropriado no termociclador de PCR. Veja a Tabela 2 para as condições padronizadas de ciclo de PCR e as informações do primer para a amplificação das regiões V3 dos genes 16S rRNA.
    3. Para resolver os amplificadores e visualização, realizar eletroforese em gel de agarose (AGE). Misture 10 μL do produto de PCR amplificado e 2 μL de tampão de carga de gel 6x (Tabela 3) e carregue essa mistura em poços em gel de agarose a 1,5% (dissolver 1,5 g de pó de agarose em 100 mL de tampão TAE 1x [Tabela 3]) contendo 5 μL de brometo de etídio de 10 mg/mL (EtBr) até uma concentração final de 0,5 μg/mL de EtBr em 100 mL do gel de agarose.
      CUIDADO: EtBr é um potente carcinógeno. As luvas devem ser usadas em todos os momentos durante o manuseio de EtBr e géis contendo EtBr.
    4. Adicione a escada de DNA para a estimativa do tamanho dos amplificadores.
    5. Realize a eletroforese do gel em um tampão de tanque TAE a 80-100 V.
    6. Uma vez que o corante de rastreamento executa 3/4 do gel, pare a eletroforese e visualize as bandas de amplificador sob um transiluminador UV.
    7. Use o produto de PCR (amplicon) para sequenciamento do gene 16S rRNA para identificar o isolado.
    8. Quantificar o amplicon submetendo-o à análise espectrofotométrica usando a equação (2).
      figure-protocol-2(2)
    9. Para verificar a pureza do ADN, calcule a relação A260/A280.
      NOTA: Idealmente, esse número deve estar acima de 1,5 e, de preferência, entre 1,8 e 2,0.
    10. Para identificar os isolados, compare as sequências obtidas com bancos de dados de sequência usando uma ferramenta de pesquisa de alinhamento apropriada.

4. Detecção de resistência a antibióticos nos isolados utilizando testes de sensibilidade a antibióticos

NOTA: Este protocolo descreve o método para o teste de suscetibilidade a antibióticos (AST) por difusão em disco. Foram utilizados os seguintes discos antibióticos: cefotaxima (5 μg), ampicilina (10 μg), levofloxacina (5 μg), cloranfenicol (30 μg), tigeciclina (15 μg), ceftriaxona (30 μg), imipenem (10 μg), gentamicina (10 μg), neomicina (10 μg), trimetoprim (5 μg) e ciprofloxacina (5 μg).

  1. Preparação do inóculo para a AST
    1. Inocular assepticamente uma única colônia de RA purificada isolada usando uma alça estéril em 2 mL de um meio estéril não seletivo, como o caldo de Luria-Bertani (sem qualquer antibiótico), e incubar a 37 °C a 80 rpm durante a noite.
    2. Ressuspender tomando 100-150 μL da cultura cultivada durante a noite (aproximadamente, OD 600 = 1,8-2,0) em 2 mL de caldo fresco não seletivo de Luria-Bertani e incubar por 2-4 h (até que a OD600 atinja 0,4-0,5).
    3. Diluir esta suspensão de cultura recém-cultivada usando solução salina estéril a 0,85%, de modo que a densidade da cultura seja igual a 0,5 padrão de McFarland (aproximadamente, OD600 = 0,1), o que corresponde aproximadamente a 1-2 × 108 células/mL.
    4. Misture suavemente a suspensão bacteriana para uma distribuição celular uniforme.
    5. Utilize a suspensão acima referida no prazo de 15 minutos após a diluição.
  2. Inoculação das placas de ágar
    1. Preparar placas de ágar Mueller-Hinton (MHA) para a realização do AST misturando 38 g de MHA em 1.000 mL de água duplamente destilada e dissolver a mistura por aquecimento. Autoclave a mistura dissolvida a 121 °C, 15 psi durante 15 min.
    2. Certifique-se de que a profundidade do MHA nas placas seja de 4 mm (25 mL de meio por placa).
    3. Simultaneamente, retire os discos antibióticos do congelador e aqueça-os à temperatura ambiente.
      NOTA: Os discos de antibióticos devem ser gradualmente descongelados descongelando inicialmente os discos a 4 °C e posteriormente à temperatura ambiente para reduzir qualquer perigo potencial de condensação nos discos, o que pode subsequentemente afectar a zona de inibição (ZOI).
    4. Em condições assépticas, mergulhe um cotonete estéril no inóculo preparado na etapa 4.1 e remova o excesso de suspensão para evitar a inoculação excessiva das placas.
    5. Espalhe a cultura uniformemente nas placas, começando do topo da placa MHA e indo e voltando de ponta a ponta. Gire a placa em 60° enquanto balança.
  3. Aplicação dos discos antibióticos
    1. Com a ajuda de pinças esterilizadas por chama, transfira assepticamente os discos antibióticos para as placas MHA inoculadas e pressione os discos suavemente para garantir o contato completo do nível com o ágar.
      NOTA: Este procedimento deve ser feito dentro de 15 min da inoculação da cultura nas placas.
    2. Coloque o número apropriado de discos de antibióticos na placa de ágar, levando em conta o organismo, o antibiótico usado e o tamanho da placa para evitar a sobreposição das zonas de inibição.
      NOTA: Quatro a cinco discos podem ser acomodados em uma placa circular de 90 mm.
  4. Incubação das placas
    1. No prazo de 15 minutos após a aplicação dos discos antibióticos, inverter as placas e incubar a 37 °C durante a noite.
  5. Interpretação dos resultados
    1. Medir o diâmetro do ZOI em milímetros (mm) e interpretar de acordo com os valores do ponto de interrupção indicados pelo EUCAST11. Veja os dois exemplos dados abaixo.
      1. O ponto de ruptura do diâmetro da zona (mm) para um disco antibiótico ciprofloxacina (5 μg) para Enterobacterales é S ≥ 25 e R < 22, o que significa que é considerado sensível (S) se o ZOI ≥ 25 mm, enquanto é resistente (R) se o ZOI < 22 mm. Se o diâmetro do ZOI cair entre 22 e 25, o isolado é considerado intermediário (I).
      2. O ponto de ruptura do diâmetro da zona (mm) para um disco antibiótico cloranfenicol (30 μg) para Staphylococcus spp. é S ≥ 18 e R < 18, o que significa que é considerado sensível se o ZOI ≥ 18 mm, enquanto é resistente se o ZOI < 18 mm.
    2. Determine o índice de resistência múltipla a antibióticos (MAR) encontrando a proporção do número de antibióticos aos quais o isolado é resistente ao número total de antibióticos aos quais o isolado está exposto.
      NOTA: Para o controle de qualidade, E. coli ATCC 25922 e S. áureo ATCC 29213 são usados como cepas de referência seguindo o protocolo como na etapa 4.

5. Detecção baseada em PCR de genes de resistência a antibióticos nos isolados

  1. Utilizar um protocolo de PCR padrão para a identificação de ARGs nos isolados. Preparar o molde de ADN utilizando o protocolo indicado no passo 3.1.
    NOTA: As condições de ciclagem por PCR utilizadas neste estudo foram de 94 °C por 10 min, seguidas por 35 ciclos de 94 °C por 30 s, recozimento por 30 s na temperatura apropriada (conforme padronizado para cada conjunto de primer), extensão a 72 °C por 40 s e extensão final a 72 °C por 5 min. A mistura de reação está descrita na Tabela 4. A lista de ARGs, primers e temperaturas de recozimento é apresentada na Tabela 5.
  2. Para resolver, visualizar e verificar a pureza dos amplificadores, siga as etapas 3.2.3-3.2.10.

6. Análise metagenômica completa do DNA para a identificação da diversidade bacteriana total e a detecção de ARGs no metagenoma

  1. Extração do DNA total (metagenoma) da amostra de água
    1. Extraia o DNA metagenômico das amostras de água filtrada.
      NOTA: No presente estudo, o DNA metagenômico (DNA total) foi extraído das amostras de água filtrada usando o kit de isolamento de DNA referenciado seguindo o protocolo do fabricante (consulte a Tabela de Materiais).
    2. Verifique a qualidade do DNA carregando 3 μL do DNA metagenômico extraído em um gel de agarose a 0,8% e execute o gel a 80-110 V por aproximadamente 30 min.
    3. Verifique a presença de uma única banda intacta.
    4. Verifique a concentração de DNA usando um fluorômetro.
  2. Determinação da diversidade bacteriana e detecção de ARGs usando sequenciamento de DNA metagenômico completo
    1. Preparação da biblioteca e amplificação por PCR:
      1. Prepare uma biblioteca de sequenciamento final emparelhada usando o kit de preparação da biblioteca de DNA referenciada (consulte a Tabela de Materiais).
      2. Prepare o DNA para a ligadura do adaptador, pegando 200 ng de DNA e cortando-o mecanicamente em fragmentos menores, seguido por uma etapa contínua de reparo final na qual um "A" é adicionado às extremidades de 3'.
      3. Dependendo da plataforma usada para sequenciamento, ligue adaptadores específicos para ambas as extremidades dos fragmentos de DNA.
        Observação : sequências cruciais para vincular bibliotecas de código de barras duplas a uma célula de fluxo para sequenciamento estão presentes nesses adaptadores. Isso permite a amplificação por PCR dos fragmentos ligados ao adaptador e a ligação dos primers de sequenciamento padrão.
      4. Para verificar a qualidade e a quantidade, analise a biblioteca amplificada usando um chip de DNA de alta sensibilidade, de acordo com as instruções do fabricante.
    2. Geração e sequenciamento de clusters:
      1. Carregue a biblioteca amplificada na plataforma de sequenciamento apropriada para geração de cluster e sequenciamento subsequente.
        NOTA: As moléculas da biblioteca ligam-se aos oligos do adaptador complementar na célula de fluxo final emparelhada. Durante o sequenciamento, os fios dianteiros são seletivamente clivados após a ressíntese do fio reverso. Essa fita reversa copiada é então sequenciada a partir da extremidade oposta do fragmento.
    3. Análise bioinformática:
      1. Gere andaimes a partir de dados de alta qualidade usando a plataforma apropriada.
      2. Submeter estes andaimes à análise bioinformática para a classificação taxonómica e identificação dos ARGs.
        NOTA: O fluxo de trabalho para toda a análise metagenômica de DNA para a identificação da diversidade bacteriana total e a detecção de ARGs no metagenoma é dado na Figura 1. Um fluxograma da metodologia completa descrita no manuscrito é apresentado na Figura 2.

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Resultados

Carga bacteriana total e contagem de bactérias resistentes a antibióticos (AR)
A enumeração da carga bacteriana total foi realizada espalhando diluições de 10−4 a 10−6 vezes das amostras de água em Agar R2A, meio modificado. Para a enumeração da contagem de bactérias AR, diluições de 10−3 a 10−6 vezes foram espalhadas em placas de meio contendo antibióticos (Figura 3). As contagens de bactérias totais e de RA foram calculadas co...

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Discussão

A coleta e o processamento da amostra desempenham um papel significativo e podem afetar os resultados e a interpretação do estudo. Assim, para descartar a variabilidade nas amostras, é importante realizar a amostragem em vários locais do corpo de água doce em estudo. Manter condições ambientais assépticas adequadas ao manusear essas amostras pode evitar a contaminação. Além disso, para evitar alterações na composição bacteriana que possam influenciar a qualidade e a quantidade de ácidos nucleicos extraídos, as condições ...

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Divulgações

Os autores não têm interesses conflitantes a divulgar.

Agradecimentos

Este trabalho foi parcialmente apoiado por doações financeiras do Departamento de Ciência e Tecnologia-Promoção da Pesquisa Universitária e Excelência Científica (DST-PURSE) Esquema da Universidade de Mumbai. Devika Ghadigaonkar trabalhou como bolsista do projeto sob o esquema. É reconhecida a ajuda técnica prestada por Harshali Shinde, investigador sénior do Departamento de Ciência e Tecnologia-Conselho de Investigação em Ciência e Engenharia (DST-SERB): CRG/2018/003624.

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Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo
NomeEmpresaNúmero de catálogoComentários
Escada de DNA de 100 pbHimediaMBT049-50LNPara estimativa do tamanho dos amplicons
2x PCR Taq mastermixHiMediaMBT061-50RPara fazer mistura de reação de PCR
37 ° C IncubadoraGS-192, Gayatri ScientificNAPara incubação de bactérias
6x Gel Loading BufferHiMediaML015-1MLCarregando e rastreando corante que ajuda a pesar a amostra de DNA e acompanhar o progresso da eletroforese
Pó de agaroseHimediaMB229-50GPara resolver amplicons durante a eletroforese em gel de agarose (AGE)
Disco antibiótico de ampicilinaHiMediaSD002Para realizar AST
AutoclaveEquitronNANecessário para esterilização de meios, placas de vidro, tubos de ensaio, etc
Bioanalyzer 2100Agilent TechnologiesNAPara verificar a qualidade e quantidade da biblioteca amplificada
Bisafety B2 GabineteIMSETIMSET BSC-Classe II Tipo B2Usado para trabalhos microbiológicos como cultura bacteriana, AST etc.
Disco antibiótico de cefotaximaHiMediaSD295E-5VLPara realizar AST
Pó antibiótico de cefotaximaHiMediaTC352-5GPara preparação de solução de estoque de antibiótico necessária durante o isolamento de bactérias resistentes a antibióticos
Disco antibiótico de ceftriaxonaHiMediaSD065Para realizar
a centrífugaMinispin EppendorfMinispin Plus-5453Usado para peletar os detritos durante a preparação do DNA bruto
Disco antibiótico cloranfenicolHiMediaSD006-5x50DSPara realizar o
disco antibiótico AST CiprofloxacinaHiMediaSD060-5x50DSPara realizar o
pó antibiótico AST CiprofloxacinaHiMediaTC447-5GPara a preparação da solução estoque antibiótica necessária durante o isolamento de resistente a antibióticos colorímetro de bactérias
QuestNAPara verificar a DO de suspensões de cultura
Banco de dadosanotação funcional de ARGs; https://card.mcmaster.ca/
Incubadora de agitador de resfriamentoBTL41 Allied ScientificNAPara incubação de placas de mídia para cultura de bactérias
Congelador (-40 ° C) HaierDW40L, Haier BiomedicalsPara armazenamento de estoques de glicerol Kit de
preparação para biblioteca de DNANEB Next Ultra Kit de preparação para bibliotecabiblioteca de sequenciamento emparelhado
EDTAHiMediaGRM1195-100GPara preparação de tampão de execução de gel para eletroforese em gel de agarose (AGE)Aparelho de
eletroforeseTechResourceBandejade fundição em gel de 15 cmPara fazer o gel de agarose e realização de eletroforese 
Eletroforese Power pack com eletrodosGeneiNAPara executar o AGE 
Disco antibiótico de eritromicinaHiMediaSD222-5VLPara realizar AST
Pó de antibiótico de eritromicinaHiMediaCMS528-1GPara preparação de solução de estoque de antibióticos necessária durante o isolamento de bactérias resistentes a antibióticos
Pó de antibiótico de eritromicinaHiMediaTC024-5GPara preparação de solução de estoque de antibióticos necessária durante o isolamento de resistente a antibióticos bactérias
Escherichia coli ATCC 25922       HiMedia0335X-1Usado como controle durante a execução
do brometo de etídioHiMediaMB071-1GAgente intercalante e visualização de DNA após eletroforese sob Gel Sistema
Documentação FluorômetroQubit 2.0NAPara determinar a concentração de DNA metagenômico extraído
Sistema de Documentação de GelBioRadUsado para visualizar amplicons de PCR após eletroforese
Disco antibiótico de gentamicinaHiMediaSD170-5x50DSPara realizar AST
Ácido acético glacialHiMediaAS119-500MLPara preparação de tampão de execução de gel para eletroforese em gel de agarose (AGE)
GlycerolHiMediaGRM1027-500MLPara fazer estoques de glicerol
Discoantibiótico ImipenemHiMediaSD073Para realizar AST
Kaiju DatabaseNANA Para classificação taxonômica de leituras; https://kaiju.binf.ku.dk/
Disco de antibiótico canamicinaHiMediaSD017-5x50DSPara realizar
AST Pó antibiótico canamicinaHiMediaMB105-5GPara preparação de solução estoque de antibiótico necessária durante o isolamento de bactérias resistentes a antibióticos
Disco antibiótico de levofloxacinaHiMediaSD216-5VLPara realizar o
caldo AST Luria BertaniHimediaM1245-500GPara enriquecimento de culturas
Padrões McFarlandHimediaR092-1NoPara comparar a densidade da suspensão de cultura
Biologia Molecular águaHiMediaTCL018-500MLPara fazer mistura
de reação PCRÁgar Mueller-Hinton (MHA) HiMediaM173-500GPara realizar Teste de Suscetibilidade Antibiotc (AST)
Disco antibiótico NeomicinaHiMediaSD731-5x50DSPara realizar AST
PCR Gradient Thermal CyclerEppendorfMastercycler Nexus Gradient 230V/50-60 Hz Usado para realizar PCR para amplificação da região 16S rRNA e vários genes de resistência a antibióticos
Primers XcelrisNApara amplificação de PCR 
R2A Agar, ModifiedHiMediaM1743Para preparação de placas de mídia para isolamento de carga bacteriana total e resistente a antibióticos (AR)
Geração de andaimesCLC Genomics Workbench 6.0NAPara geração de andaimes
SequenciadorPlataforma Illumina (2 x 150 bp química)NASequenciamento de biblioteca amplificada
Cloreto de Sódio HiMediaTC046-500GPara preparação de solução salina a 0,85% para diluir serialmente a amostra de água
Kit de isolamento de DNA do soloXcelgenNAPara extração de DNA metagenômico completo da amostra de água filtrada 
Staphylococcus aureus subsp. aureus ATCC 29213HiMedia0365PUsado como controle durante a realização
Classificação TaxonômicaKaiju ioinformaticstool NAPara classificação de leituras em diferentes grupos taxonômicos do filo ao nível de gênero 
O Banco de Dados Abrangente de Resistência a Antibióticos (CARD)NANA Para anotação funcional de ARGs
Disco antibiótico de tigeciclinaHiMediaSD278Para realizar
AST Disco antibiótico TrimetoprimHiMediaSD039-5x50DSPara realizar AST
Tris baseHiMediaTC072-500GPara preparação de tampão de execução de gel para gel de agarose Eletroforese (AGE)
Vancomicina antibiótico em póHiMediaCMS217Para preparação de solução de estoque de antibióticos necessária durante o isolamento de bactérias resistentes a antibióticos
Balança de pesagemMettler ToledoME204 Mettler ToledoUsado para pesar pós de meios, pós reagentes, etc.
NA - Não aplicável
AST abrangente de resistência a antibióticos (CARD) de DNA para preparação de Illumina NA AST de da AST

Referências

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